结核分枝杆菌MPB64抗原的制备与纯化

xiaoxiao 2019-3-26 16

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结核分枝杆菌MPB64抗原的制备与纯化 
作者:陈超 
来源:《医学信息》2014年第07期 
        摘要:根据GenBank结核分枝杆菌基因序列设计引物扩增出MPB64基因,连接至原核表达载体pET32a( ),转化至大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,克隆的MPB64基因同源率为98.36%,重组蛋白以可溶形式在细胞周质中表达,大小为24KDa。采用切胶回收水平电泳洗脱纯化出的MPB64具有反应原性。为进一步研究结核快速诊断试剂奠定了基础。         关键词:牛分枝杆菌;MPB64;原核表达;切胶纯化 
        结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis TB)引起的一种严重危害人民健康的慢性传染病,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)2012年的数据显示,世界总共有880万的结核病患者,相当于每10万人中就有138个结核病患者,我国2010年结核病死亡人数54000,新发现结核患者869092,复发人数54216,新患者中出现MDR-TB人数为49000,再次感染的患者出现MDR-TB人数为14000,结核患者中得HIV的人数为145919,HIV患者中出现结核的人数为65412,相对于2006年后呈现逐渐增加的趋势,每年用于结核的治疗费用也从2006年开始递增,2011年已经花费285百万美元,预计2012年将花费350百万美元。 
        结核菌素试验作为最古老的免疫学试验方法之一,仍然在使用,对于牛分枝杆菌的特异性抗原的筛选,仍然是诊断中的重点。MPB64抗原是牛分枝杆菌的分泌性抗原,表现为较强的迟发型超敏反应,并可诱导产生和释放γ干扰素,且MPB64抗原对活动的牛结核的特异性为100%,敏感性为98.1%[1],并且发现部分卡介苗菌株缺MPB64基因[2],若此用其做皮试,可区分已患病、隐性感染未发病和己接种卡介苗的个体,故MPB64可能是最具有潜在应用价值的诊断试剂。         1资料与方法 
        1.1菌株与质粒 E.coli BL21(DE3)由本实验室保存,表达载体pET32a( ),以及牛结核分枝杆菌DNA基因组由宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室提供。         1.2主要试剂 限制性核酸内切酶BamHI(15U/μL)、EcoR I(15U/μL)、ExTaq DNA聚合酶(5U/μL)、T4链接酶均购自大连TaKaRa公司;Marker DL2000、Protein Marker、琼脂糖、氨苄霉素、IPTG均购自全式金公司;胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)为OXOID产品;透析袋和PVDF膜均购自上海索莱宝公司; His-Tag鼠单抗购自Abmart公司;羊抗鼠IgG-HRP(酶标二抗)购自武汉博士德公司;胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒为杭州爱思进生物技术有限公司产品。 

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