一种结核分枝杆菌RNA提取方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体地，涉及一种结核分枝杆菌rna提取方法。
背景技术：
：结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。潜伏期4～8周。其中80％发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。2018年世界卫生组织发布2017年结核病新发患者1000万人，估算死亡人数157万。在新发人群中，结核联合hiv双重感染占据9％即92万人；耐多药结核56万人。世界上大约1/3的人口患有潜伏性结核，结核菌感染者在一生中因结核病而病倒的危险为10％。此外，结核病是艾滋病毒携带者的头号杀手。因此，结核分枝杆菌的检测至关重要，然而，结核分枝杆菌rna提取非常困难。技术实现要素：为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采取的技术方案如下：本发明提供一种结核分枝杆菌rna的提取方法，包括以下步骤：s1，获得结核分枝杆菌；s2，加入含有裂解液的管中，涡旋混匀后室温放置10-20min；s3，加入氯仿，剧烈振荡10-30sec后室温放置1-5min，离心5-15mim；s4，吸取水相，缓慢加入水相0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到溶液和沉淀一起转入tiangendp419试剂盒中的吸附柱cr3中，离心20-40；s5，向吸附柱cr3中加入去蛋白液rw1，离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s6，向吸附柱cr3中央加入dnasei工作液，室温放置15min；s7，向吸附柱cr3中加入去蛋白液rw1，离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s8，吸附柱cr3中加入漂洗液rw，室温放置1-3min，离心30-60sec，倒掉废液，将吸附柱cr3放回收集管中；s9，重复步骤s8；s10，离心1-3min，倒掉废液，将吸附柱cr3置于室温放置1-10min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s11将吸附柱cr3转入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100rnase-freeddh2o，室温放置1-3min，离心1-3min，得到rna溶液。在本发明的一些实施方案中，步骤s6中，dnasei工作液的配制：取10μldnasei储存液，加入70μlbufferrdd，轻柔混匀，其中dnasei储存液的配制：将dnasei干粉溶解在550μlrnase-freeddh2o中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存。在本发明的一些实施方案中，所述离心的转速为12,000rpm。在本发明的一些实施方案中，在步骤s5之前进一步包括：向吸附柱cr3中加入去蛋白液rd，离心20-40sec，弃废液，将cr3放入收集管中。在本发明的一些实施方案中，使用tiangendp430中的去蛋白液rw1代替tiangendp419中的去蛋白液rd。在本发明的一些实施方案中，步骤s2中，所述裂解液为裂解液rl。在本发明的一些优选实施方案中，所述裂解液rl在使用前加入β-巯基乙醇至终浓度1％。在本发明的另一些实施方案中，步骤s2中，所述裂解液为transzolup。本发明的有益效果本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：利用本发明的发明提取结核分枝杆菌rna，纯度高、浓度大，并且完整性高，十分适宜大规模提取。具体实施方式除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。下述实施例中，用到的部分试剂的配制方法如下：裂解液rl配制：操作前在裂解液rl中加入β-巯基乙醇至终浓度1％，如1ml裂解液rl中加入10μlβ-巯基乙醇。该裂解液最好现用现配，配好的裂解液rl4℃可放置1个月，裂解液rl在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，则加热溶解后使用。dnasei储存液的配制：将dnasei干粉(1500kunitz单位)溶解在550μlrnase-freeddh2o中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存(可保存9个月)。融化的dnasei的储存液置于4℃储存(可保存6周)，不可再次冻存。dnasei工作液的配制：每个反应取10μldnasei储存液，加入70μlbufferrdd，轻柔混匀。溶菌酶工作液配制：te缓冲液中的溶菌酶终浓度(g-细菌400μg/ml，g 细菌3mg/ml)。下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(j.萨姆布鲁克、m.r.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1结核杆菌提取条件第一轮优化1.样品前处理本实施例利用9例样本，前处理分别如下：2.rna提取裂解后的样品使用dp430(tiangen)进行rna提取，参考制造商的说明书进行。①将裂解后的样品12000rpm(～13,400×g)离心2min，将上清转移至另一离心管中。加入250μl无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉废液，将吸附柱cr3放回收集管中。②向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。③向吸附柱cr3中央加入80μl的dnasei工作液，室温放置15min。④向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。⑤向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉废液，将吸附柱cr3放回收集管中。⑥重复步骤5。⑦7.12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：此步骤目的是将吸附柱cr3中残余的漂洗液去除。⑧将吸附柱cr3转入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到rna溶液。本实施例利用dp430提取的结核杆菌rna浓度只有3-5ng/μl，无法达到临床要求。实施例2结核杆菌提取条件第二轮优化1.样品前处理本实施例利用6例样本，前处理分别如下：2.rna提取①rl裂解：将裂解后的样品12000rpm(～13,400×g)离心2min，将上清转移至另一离心管中。加入250μl无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。transzolup裂解：加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液rz试剂的50％。把水相转移至另一离心管中，缓慢加入水相0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。②裂解后的样品使用dp430(tiangen)进行rna提取，后续操作步骤同实施例1。本实施例次使用transzolup dp430过柱的方法，提取的rna浓度在80.9ng/μl，260/280＝2.65，260/230＝2.33。实施例3结核杆菌提取条件第三轮优化1.样品前处理本实施例利用6例样本，前处理分别如下：样本处理方式1将结核杆菌加入含有1mlrz的ep管中，涡旋混匀后室温放置5min2将结核杆菌加入含有1mlrz的ep管中，涡旋混匀后室温放置10min3将结核杆菌加入含有1mlrz的ep管中，涡旋混匀后室温放置15min4将结核杆菌加入含有1mltranszolup的ep管中，涡旋混匀后室温放置5min5将结核杆菌加入含有1mltranszolup的ep管中，涡旋混匀后室温放置10min6将结核杆菌加入含有1mltranszolup的ep管中，涡旋混匀后室温放置15min2.rna提取①rz裂解：将裂解完成后的样品加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。transzolup裂解：将裂解完成后的样品加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液rz试剂的50％。把水相转移至另一离心管中。②缓慢加入水相0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中，4℃12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱cr3，请分两次转入吸附柱cr3中，4℃12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃掉收集管中的废液。③向吸附柱cr3中加入500μl去蛋白液rd(使用前请先检查是否已加入乙醇)，4℃12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将cr3放入收集管中。④将上述处理后的样品使用dp419(tiangen)进行rna提取，后续操作步骤同实施例1。本实施例利用dp419trizol裂解，rna结果如下：样本核酸浓度(ng/μl)a260/a280a260/a230157.61.230.41270.921.590.83353.251.650.70480.621.240.33548.481.480.55649.081.210.37本发明结果表明，使用trizol进行菌体裂解效果较好，且使用trizol(rz/transzolup)也能够裂解结核杆菌，浓度差异明显可能与挑取细菌量有关系，但是纯度方面rz略优于transzolup，后续过程rw1漂洗 rw漂洗提取的纯度优于rd漂洗 rw漂洗。为了进一步提高纯度，在使用dp419试剂盒时，可以使用rd重复漂洗一次，其次也可以使用dp430中的bufferrw1代替dp419中的bufferrd。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12