提取调理包中腐败菌DNA的试剂盒及其提取方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种提取调理包中腐败菌dna的试剂盒及其提取方法。
背景技术：
：随着方便食品的快速发展，美味的方便食品越来越受到广大消费者的喜爱，其美味的核心是丰富多样、美味营养的调理包。经过高压杀菌的调理包，因不含防腐剂而广受欢迎，也因不含有防腐剂，在常温条件下，如遇到包装破损则容易受到微生物污染，腐败胀袋的风险也同时大大增加。因此，能否实现调理包中腐败微生物的快速检出，是进行进一步原因分析的技术关键，也对产品的质量安全保障至关重要。关于腐败微生物的分析，目前应用广泛的方法为依赖于培养的分析方法，主要分析方法包括通过样品处理、选择针对性不同的培养基培养出菌落、分离纯化、挑取单菌落鉴定这一系列的实验过程[1-3]。但依赖于培养的方法来培养腐败样品中的污染微生物，由于需氧微生物/兼性厌氧微生物/厌氧微生物所采用的培养基、培养温度时间均不相同，因此，通常得到不同菌种的单菌落需要5-7天的时间，十分费时费力。腐败样品中微生物dna的提取难度，取决于样品本身的复杂程度。对于调理包而言，由于调理包经过了调配及加工过程，使其含有色素、油脂等在微生物dna提取时的干扰成分。传统的dna提取方法主要有pc法(苯酚/氯仿)、试剂盒提取法等。但是针对复杂样本，使用现有方法提取dna的获得率不高，提取后的dna中影响pcr扩增的夹杂物过多，影响后续研究或诊断。为了提高复杂样本的核酸提取效率，提高扩增效率，qiagen等公司研发了粪便专用提取盒/土壤专用提取试剂盒等，但是，该专用提取试剂盒通用性差，成本高昂。因此亟需开发一种不需要通过培养而直接提取样品中微生物总dna的试剂盒或方法，以能够快速实现对腐败样品中腐败微生物的精准分析。以下给出相关文献：[1]李盈颖,高雯,周帼萍.山西老陈醋样品的污染微生物分析[j].食品科学,2016,37(12):226-231.[2]张翼,赵炜,周帼萍.复合调味酱制品的污染微生物分析[j].中国调味品,2016,41(03):53-56.[3]童迅,高雯,黄庭轩,周帼萍.浓缩果汁中耐热霉菌的分析及鉴定[j].食品科学,2016,37(20):198-202.技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是现有技术中dna提取试剂盒及其提取方法提取调理包中腐败菌dna时容易堵塞具有核酸吸附膜的过滤柱，提取dna的获得率不高，提取后的dna中影响pcr扩增的夹杂物过多，影响后续研究或诊断，而且价格昂贵，提取周期长的问题。为了解决上述技术问题，本发明实施例提供的一种提取调理包中腐败菌dna的试剂盒，包括：样品清洗a液、细菌裂解b液、细菌裂解c液、细菌裂解d液；其中，所述样品清洗a液主要由na2hpo4、nacl、nah2po4·2h2o配制得到；所述细菌裂解b液主要由tris、na2edta、溶菌酶配制得到；所述细菌裂解c液主要由sds、蛋白酶k配制得到；所述细菌裂解d液主要由tris-hcl、nacl、edta、ctab配制得到。可选的，所述样品清洗a液由以下方法配制得到：称取1.07g的na2hpo4、8.5g的nacl和0.39g的nah2po4·2h2o置于500ml无菌容器中用水溶解，调节ph＝7.2并用水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌配制得到样品清洗a液。可选的，所述细菌裂解b液由以下方法配制得到：称取0.121g的tris和0.0372g的na2edta置于500ml无菌容器中用水溶解，调节ph＝8.0并用水定容至1000ml，得到te缓冲液，将所述te缓冲液与溶菌酶以9：1的体积比混合得到细菌裂解b液。可选的，所述细菌裂解c液由以下方法配制得到：将10％w/vsds水溶液与20mg/ml的蛋白酶k以5：2的体积比混合得到细菌裂解c液。可选的，所述细菌裂解d液由以下方法配制得到：称取3.15g100mm的tris-hcl、16.38g1.4m的nacl、1.17g20mm的edta、4g2％w/v的ctab置于500ml无菌容器中，调节ph＝8.0并用水定容至200ml，得到细菌裂解d液。可选的，所述调理包为调理酱包、调理肉包。本发明还提供一种提取调理包中腐败菌dna的方法，包括：采用本发明实施例所述的试剂盒对调理包中的腐败菌进行dna提取。可选的，采用本发明实施例所述的试剂盒对调理包中的腐败菌进行dna提取包括：基于待测样品与样品清洗a液，来得到第一处理液；将所述第一处理液用第一过滤器过滤，滤液离心后得到沉淀；将所述沉淀与细菌裂解b液混合，得到第二处理液；将所述第二处理液与细菌裂解c液和细菌裂解d液混合，处理后转移至具有核酸吸附膜的过滤柱过滤，弃去滤液；从所述核酸吸附膜上提取dna，作为待测样品的dna。可选地，所述基于待测样品与样品清洗a液，来得到第一处理液包括：将待测样品与样品清洗a液混合，进行振荡，得到第一处理液。所述将所述第一处理液用第一过滤器过滤，滤液离心后得到沉淀包括：将所述第一处理液用60至80目过滤网过滤，将滤液在转速5000r下进行离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀。可选的，所述将所述沉淀与细菌裂解b液混合，得到第二处理液包括：向所述沉淀中加入200μl细菌裂解b液，反复吹打离心管底部沉淀混匀，37℃保持1h，得到所述第二处理液。可选的，所述将所述第二处理液与细菌裂解c液和细菌裂解d液混合，处理后转移至具有核酸吸附膜的过滤柱过滤，弃去滤液包括：向所述第二处理液中加入70μl细菌裂解c液，55℃保持30min，且在此期间间断性摇匀；加入500μl细菌裂解d液65℃保持30min，在此期间轻轻振荡混匀3-5次；转移至具有核酸吸附用硅胶膜的过滤柱过滤，弃去滤液。可选的，所述从所述核酸吸附膜上提取dna，作为待测样品的dna包括：用无水乙醇洗涤核酸吸附膜，25℃干燥后，用水溶解核酸吸附膜上的dna并保存，作为待测样品的dna。与现有技术相比本发明具有以下优点：本发明实施例提供的提取调理包中腐败菌dna的试剂盒包括样品清洗a液、细菌裂解b液、细菌裂解c液、细菌裂解d液，首先通过样品清洗a液溶解调理包酱料中的色素、油脂、颗粒等物质，然后再经过细菌裂解b液、细菌裂解c液和细菌裂解d液裂解细菌细胞壁，提高细菌细胞dna释放量，有利于获得较多的dna。另外，本发明实施例还提供提取调理包中腐败菌dna的方法，所述方法采用本发明实施例所述试剂盒进行dna提取，通过样品清洗a液的物理清洗和第一过滤器的过滤处理步骤，能极大提高后续的提取效率，不仅能有效解决后续步骤中过滤柱堵塞的难题，而且相较于传统平板先培养再鉴定的方法，极大地缩短了调理包腐败菌鉴定的时间。进一步地，本发明在沉淀dna时采用核酸吸附用硅胶膜的过滤柱，极大程度的保证了dna的获得率。进一步地，本发明的提取调理包中腐败菌dna的试剂盒及其方法不仅可以应用于深加工的调理包等复杂样品，而且还可以应用于土壤、粪便、泥沙等复杂样品的dna提取，为核酸提取困难的样本的核酸提取提供了有力工具和新方法。附图说明图1为本发明实施例中一种提取调理包中腐败菌dna的方法的工艺流程图。图2为本发明实施例试剂盒和市售试剂盒提取的16srdna凝胶电泳图。图中，m代表marker；1代表市售试剂盒提取的a号dna；2代表本发明实施例的试剂盒提取的b号dna。图3为本发明实施例试剂盒提取的不同含量的蜡样芽孢杆菌污染样品的16srdna凝胶电泳图。图中，m代表marker；对照代表空白pcr；空白代表未加菌样品；1代表101cfu/g浓度样品；2代表102cfu/g浓度样品；3代表103cfu/g浓度样品；4代表104cfu/g浓度样品；5代表105cfu/g浓度样品；6代表106cfu/g浓度样品；7代表107cfu/g浓度样品；阳性代表细菌阳性模板。图4为污染样品灵敏度检测验证实时荧光pcr图。横坐标cycle代表周期，纵坐标△rn代表pcr产物的量。具体实施方式如
背景技术：
中所述，现有技术中dna提取试剂盒提取调理包腐败菌dna时容易堵塞具有核酸吸附膜的过滤柱，提取dna的获得率不高，提取后的dna中影响pcr扩增的夹杂物过多，影响后续研究或诊断，而且价格昂贵。本发明提供的提取调理包中腐败菌dna的试剂盒包括样品清洗a液、细菌裂解b液、细菌裂解c液、细菌裂解d液，首先通过样品清洗a液溶解调理包酱料中的色素、油脂、颗粒等物质，然后再经过细菌裂解b液、细菌裂解c液和细菌裂解d液裂解细菌细胞壁，提高细菌细胞dna释放量，有利于获得较多的dna。另外，本发明还提供提取调理包中腐败菌dna的方法，所述方法采用本发明所述试剂盒进行dna提取，通过样品清洗a液的物理清洗和第一过滤器的过滤处理步骤，能极大提高后续的提取效率，不仅能有效解决后续步骤中过滤柱堵塞的难题，而且相较于传统平板先培养再鉴定的方法，极大地缩短了调理包腐败菌鉴定的时间。为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。除特殊注明外，本发明对所用试剂的来源通常没有特殊限制，例如可以采用市售即可。本发明实施例提供一种提取调理包中腐败菌dna的试剂盒，包括：样品清洗a液、细菌裂解b液、细菌裂解c液、细菌裂解d液。其中，所述样品清洗a液主要由na2hpo4、nacl、nah2po4·2h2o配制得到。在一些实施例中，所述样品清洗a液由以下方法配制得到：称取1.07g的na2hpo4、8.5g的nacl和0.39g的nah2po4·2h2o置于500ml无菌容器中用水溶解，调节ph＝7.2并用水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌配制得到样品清洗a液。所述细菌裂解b液主要由tris、na2edta、溶菌酶配制得到。在一些实施例中，所述细菌裂解b液由以下方法配制得到：称取0.121g的tris和0.0372g的na2edta置于500ml无菌容器中用水溶解，调节ph＝8.0并用水定容至1000ml，得到te缓冲液，将所述te缓冲液与溶菌酶以9：1的体积比混合得到细菌裂解b液。所述细菌裂解c液主要由sds(十二烷基硫酸钠)、蛋白酶k配制得到。在一些实施例中，所述细菌裂解c液由以下方法配制得到：将10％w/vsds水溶液与20mg/ml的蛋白酶k以5：2的体积比混合得到细菌裂解c液。所述细菌裂解d液主要由tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、nacl、edta、ctab(溴化十六烷基三甲铵)配制得到。在一些实施例中，所述细菌裂解d液由以下方法配制得到：称取3.15g100mm的tris-hcl、16.38g1.4m的nacl、1.17g20mm的edta、4g2％w/v的ctab置于500ml无菌容器中，调节ph＝8.0并用水定容至200ml，得到细菌裂解d液。在一些实施例中，所述调理包为调理酱包、调理肉包。本发明实施例还提供一种提取调理包中腐败菌dna的方法，包括：采用上述本发明实施例所述的试剂盒对调理包中的腐败菌进行dna提取。图1是本发明实施例中一种提取调理包中腐败菌dna的方法的工艺流程图。本发明实施例的提取调理包中腐败菌dna的方法可以应用于调理包中腐败菌dna的提取，提取方法即为图1中的各个步骤。在一些实施例中，所述采用上述本发明实施例所述的试剂盒对调理包中的腐败菌进行dna提取包括：s100，基于待测样品与样品清洗a液，来得到第一处理液；在一些实施例中，所述基于待测样品与样品清洗a液，来得到第一处理液包括：将待测样品与样品清洗a液混合，进行振荡，得到第一处理液。s200，将所述第一处理液用第一过滤器过滤，滤液离心后得到沉淀；在一些实施例中，所述将所述第一处理液使用第一过滤器过滤，滤液离心后得到沉淀包括：将所述第一处理液用60至80目过滤网过滤，将滤液在转速5000r下进行离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀。s300，将所述沉淀与细菌裂解b液混合，得到第二处理液；在一些实施例中，所述将所述沉淀与细菌裂解b液混合，得到第二处理液包括：向所述沉淀中加入200μl细菌裂解b液，反复吹打离心管底部沉淀混匀，37℃保持1h，得到所述第二处理液。s400，将所述第二处理液与细菌裂解c液和细菌裂解d液混合，处理后转移至具有核酸吸附膜的过滤柱过滤，弃去滤液；在一些实施例中，所述将所述第二处理液与细菌裂解c液和细菌裂解d液混合，处理后转移至具有核酸吸附膜的过滤柱过滤，弃去滤液包括：向所述第二处理液中加入70μl细菌裂解c液，55℃保持30min，且在此期间间断性摇匀；加入500μl细菌裂解d液65℃保持30min，在此期间轻轻振荡混匀3-5次；转移至具有核酸吸附用硅胶膜的过滤柱过滤，弃去滤液。s500，从所述核酸吸附膜上提取dna，作为待测样品的dna。在一些实施例中，所述从所述核酸吸附膜上提取dna，作为待测样品的dna包括：用无水乙醇洗涤核酸吸附膜，25℃干燥后，用水溶解核酸吸附膜上的dna并保存，作为待测样品的dna。为了进一步说明本发明，下面结合具体实例来对上述实施例作更具体的分析，以便于本领域的技术人员进一步地理解。实例一1、制备人工模拟污染样品(1)取灭菌离心管，分别称取适量酱包样品并标号；(2)分光光度计od600nm值为0.15时，蜡样芽孢杆菌悬液菌含量为108cfu/ml；(3)对108cfu/ml菌悬液按照10倍梯度稀释，分别取1ml各浓度菌液加入到对应的离心管中；(4)制备菌含量为101-107cfu/g的人工模拟污染样品。2、配制提取调理包中腐败菌dna的试剂盒的试剂(1)配制样品清洗a液称取1.07g的na2hpo4、8.5g的nacl和0.39g的nah2po4·2h2o置于500ml无菌烧杯中用水溶解，调节ph＝7.2并用水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌配制样品清洗a液。(2)配制细菌裂解b液称取0.121g的tris和0.0372g的na2edta置于500ml无菌烧杯中用水溶解，调节ph＝8.0并用水定容至1000ml，得到te缓冲液；将te缓冲液与溶菌酶以9：1的体积比配制细菌裂解b液。(3)配制细菌裂解c液制备含量为10％w/v的sds水溶液，将10％w/vsds水溶液与20mg/ml的蛋白酶k以5：2的体积比配制细菌裂解c液。(4)配制细菌裂解d液称取3.15g100mm的tris-hcl、16.38g1.4m的nacl、1.17g20mm的edta、4g2％w/v的ctab置于500ml无菌烧杯中，调节ph＝8.0并用水定容至200ml配制细菌裂解d液。3、用市售试剂盒提取污染样品取一份含104cfu/g蜡样芽孢杆菌的污染样品，使用对照组试剂盒按照说明书进行核酸提取；对照组试剂盒采用qiagen公司粪便核酸专用提取试剂qiaampdnastoolminikit，按照说明书提取样品中的dna，发现过滤柱堵塞，最终获得1管核酸并标示为a号。4、用提取调理包中腐败菌dna的试剂盒提取不同污染量的样品(1)取一份含104cfu/g蜡样芽孢杆菌的污染样品中加入样品清洗a液振荡摇匀，经过60-80目过滤网过滤，将10000g滤液在转速5000r下离心10min，倒去上清液，得到沉淀。(2)向所得沉淀中加入200μl细菌裂解b液，反复吹打离心管底部沉淀混匀，37℃保持1h。(3)加入70μl细菌裂解c液，55℃保持30min，且在此期间间断性摇匀。(4)加入500μl细菌裂解d液65℃保持30min，中间轻轻振荡混匀3-5次。(5)上清液转移到具有核酸吸附用硅胶膜的过滤柱中，弃去滤液。(6)用无水乙醇洗涤硅胶膜，室温25℃干燥后，用双蒸水溶解膜上核酸，最终获得1管核酸并标示为b号。同理，分别取含101-107cfu/g蜡样芽孢杆菌的污染样品，使用上述方法提取样品中的dna，最终获得7管核酸并标识为1-7号。5、不同试剂盒提取结果对比(1)dna的质量浓度和纯度检测分别取上述a号、b号和1-7号的dna溶液1μl，用超微量核酸蛋白分析仪(柏精-biodropμlite )测定以上提取的dna在波长260nm和280nm处的紫外吸收值，通过比较od260nm/od230nm、od260nm/od280nm和质量浓度值判断dna的纯度和浓度，结果见表1。表1dna的浓度和纯度比较编号od260nm/od230nmod260nm/od280nmdna质量浓度μg/mla1.420.8110.6b1.811.86113.211.961.94121.321.821.87116.831.781.93102.541.841.78110.251.882.03108.761.721.97111.571.912.11119.6(2)16s琼脂糖凝胶电泳检测分别取上述a号、b号和1-7号的dna溶液2μl，进行16srdna的pcr反应。反应结束后，用2％w/v琼脂糖凝胶电泳检测，120v恒定电压、40min。紫外灯下观察条带，并照相记录结果，结果见图2、图3。(3)蜡样芽孢杆菌荧光pcr验证以蜡样芽孢杆菌特异性基因片段nhec基因片段设计引物探针；其中：f:3’-gttgtatgcggatattgtaaagaat-5’；r:3’-gctacgcaaagtacgcca-5’；probe：fam－cgcgatagaatggcgaaagatacaaatag－tama。反应体系(20μl)：模板溶液2μl，probeqpcrmix(2×)10μl，roxreferencedye(50x)0.4μl，上游引物f3(10μm)0.4μl、下游引物r3(10μm)0.4μl、探针bjp(10μm)0.4μl，其余为水。反应条件：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，共45个循环。反应在abi7900ht实时荧光检测仪中进行，对于ct值≤40的扩增结果判定为阳性，结果见图4。从上述结果可知，本发明实施例提供的提取调理包中腐败菌dna的试剂盒及其提取方法与市售可信度极高的试剂盒相比，其核酸提取效率明显增高，经s100(样品清洗a液清洗)和s200(第一过滤器过滤)步骤后，能有效去除待测样品中的部分油脂、色素和大部分固定颗粒，使具有核酸吸附用硅胶模的过滤柱不会堵塞，且经过s300、s400、s500步骤后，所获得的核酸质量好，收获量大，同时不容易受到复杂样品中抑制实时荧光pcr扩增的物质干扰，实验数据表明本发明实施例提供的试剂盒及其提取方法相较于市售试剂盒对样品中的杂质有较好的清除效果。另外，通过本发明提供的提取调理包中腐败菌dna的试剂盒及其提取方法，通过样品清洗a液的物理清洗和过滤网的过滤作用清除调理包污染样品中的固体杂质和部分色素，达到提高提取效率的目的，通过比较彻底去除影响pcr扩增效率的杂质，提高扩增效率。而且传统提取复杂样品dna的方法需要在提取dna前增菌、污染菌分离培养和鉴定，一般需要3至7天的时间，而通过本发明实施例所述的试剂盒及其提取方法从复杂样品前处理、核酸提取到污染菌鉴定总耗时约为4h，大大缩短污染菌鉴定时长。因此，本发明提供的提取调理包中腐败菌dna的试剂盒及其提取方法可以为对复杂样品的分子生物学研究提供高质量的核酸，提高分子生物学研究的应用范围，为产品腐败微生物快速定位分析提供保障。虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。当前第1页12