本发明属于病毒学、渔业生物技术及水产动物医学领域，更具体涉及分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用。
背景技术：
黄颡鱼pelteobagrusfulvidraco肉质细嫩、营养丰富、养殖方式多样(单养、混养、网箱养殖)，是我国广泛养殖的肉食性为主的杂食性小型名优经济养殖鱼类[李明德.北京:海洋出版社,2011,116-122]。我国黄颡鱼养殖产业发展迅速，近些年来，黄颡鱼的病害研究大多集中于细菌、真菌和寄生虫等病原[周勇等.中国渔业质量与标准,2019,9(1):18-26；yesg,etal.aquaculture,2009,292:6-10]。2020年3—4月浙江湖州、湖北枝江、潜江等黄颡鱼主养区域发生黄颡鱼暴发性疾病，随后，四川、重庆、湖南、广西、广东等地区相继暴发，给黄颡鱼养殖业造成了巨大经济的损失，但病因不明。
患病黄颡鱼临床症状主要表现为鱼体表颜色加深，下颌基部和体表出血，脾脏和肾脏坏死出血。与已报道的黄颡鱼疾病临床症状不同并且该病传播迅猛，发病率约40％～60％，死亡率高达70％～80％，病程一般为3～5d，发病水温20～24℃，抗生素药物治疗无效。
针对上述问题，申请人就近年引起我国黄颡鱼暴发性死亡的主要致病病原进行鉴定，申请人采用了高通量测序方法对患病黄颡鱼肾脏组织进行测序分析，结合人工感染实验、病毒组织表达分布、患病鱼组织原位杂交等实验，最终鉴定引起黄颡鱼出血性病毒病原为黄颡鱼杯状病毒病原，暂命名为yellowcatfishcalicivirus(yccv)，该病毒是直接导致黄颡鱼体表出现出血性死亡特点的致病病毒病原。
至申请日目前，该病毒病原首次在鱼类中发现，而且与杯状病毒科其他成员属在核苷酸层面无同源性，在氨基酸层面也仅有30％左右的同源性，对该病毒病原的研究也尚属空白。因此，对引起黄颡鱼出血性疾病，高致死率的黄颡鱼杯状病毒yccv开展诊断及流行病学调查、疾病防控、疾病早期预警模型等方面研究，不仅具有重要科学意义，且开发的相关产品能推广应用，为黄颡鱼的养殖业健康持续发展奠定基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种分离的黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivirus)，所述病毒的全基因组为seqidno.2所示。
本发明的另一个目的在于提供了黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivirus)的特异性序列，所述序列为seqidno.1所示。
本发明还有一个目的在于提供了用于检测seqidno.1所示特异性序列的引物。
本发明还有一个目的在于提供了seqidno.1所示序列或针对seqidno.1设计的引物在制备黄颡鱼杯状病毒诊断试剂中的应用。
本发明最后一个目的在于提供了全基因组为seqidno.2所示的黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivirus)的应用，包括用于黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivirus)的标准对照品，或是作为黄颡鱼杯状病毒的疫苗。
为了达到上述目的，本发明采取如下技术措施：
申请人从不同养殖场采集患出血性疾病的濒死黄颡鱼进行主要致病病原鉴定，透射电子显微镜结果显示患病黄颡鱼的组织细胞中存在大量球形无囊膜病毒样颗粒，直径约30～40nm；病毒粒子分布在宿主细胞的细胞质中，有的由单位膜包裹在包涵体中，而正常黄颡鱼组织中未观察到球形样病毒颗粒；进一步对脾脏和肾脏组织进行高通量测序，发现与现有杯状病毒进化相近的一株新病毒(yellowcatfishcalicivirus，yccv)。yccv首次在鱼类中发现，而且与杯状病毒科其他成员属在核苷酸层面无同源性，在氨基酸层面也仅有30％左右的同源性。基于高通量测序所得部分yccv基因组序列，利用race和overlappcr技术进行病毒全基因组扩增，最终获得了seqidno.2所示的包括特异性序列在内的病毒全基因组序列。
该病毒的非结构蛋白(nonstructuralprotein,ns)是调控病毒复制的关键基因，针对该基因筛选出seqidno.1所示的特异性靶序列。
通过对本领域的常规手段，对上述靶序列的全部或者部分序列进行检测，可用于检测yccv；
上述的检测试剂可以为引物，优选的，为yccv-ns-f：5'-cgcctaaagttctcctccttgttgg-3'和yccv-ns-r：5'-aaagttgggtggattggtttgtcat-3'，扩增出的序列为seqidno.3所示。
本发明的保护内容还包括，全基因组为seqidno.2所示的黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivirus)的应用，包括用于黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivirus)的标准对照品，或是作为黄颡鱼杯状病毒的疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明实现了对黄颡鱼出血性疾病、高死亡率病毒病高效和准确诊断。
2)本发明是基于新鉴定的黄颡鱼杯状病毒yccv特异性序列，采用2条引物进行rt-pcr的扩增策略，在提高效率，简化过程、降低成本的同时，还能了解yccv的分子流行病学特征，从而获得更丰富和更准确的信息与数据。
3)本发明提供的基因序列或其引物，可研发准确、快速、便捷的免疫检测技术和/或制剂，广泛用于在国内外黄颡鱼的健康评估、或病毒病流行调查及预警。
5)利用本发明提供的rt-pcr检测方法灵敏，待检样品中含yccv基因量为0.1ng/μl可检出。
6)所扩增的基因yccv-ns具有可预测的功能或保守结构域；基因大小适中，扩增后易于分析和判断。
7)本发明提供了yccv全基因组序列，为下一步制备疫苗和病毒的分子流行病学调查研究提供参考。
附图说明
图1为濒死黄颡鱼脾脏和肾脏的超薄切片透射电镜图片示意图；
显示在濒死黄颡鱼脾脏和肾脏的超薄切片中，存在大量的杯状病毒颗粒。
图2yccv-ns在现有ncbi中与该目病毒成员属的同源性对比结果截图：
图中结果显示，yccv-ns氨基酸序列与现有的小rna病毒目中各个病毒科成员属，如杯状病毒科、小rna病毒科、双顺子反子病毒科等有部分同源性(～30％)。
图3用yccv-ns引物对患病黄颡鱼组织进行rt-pcr扩增产物的电泳图；
待检样品共三份，均显示黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivrus,yccv)阳性；
所用引物分别是yccv-ns-f/yccv-ns-r。m：1000bp。结果在大小为523bp处，扩增出一条特异性的核酸条带。
图4用不同稀释浓度的yccvcdna模板进行rt-pcr产物电泳图；
图：待检模板dna浓度依次为(105、104、103、102、101、100、10-1、10-2、10-3或10-4)×0.1ng/μl。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特备说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
黄颡鱼杯状病毒的发现及特异性序列的获得：
申请人从不同黄颡鱼养殖场采集患出血性疾病濒死黄颡鱼，进行致病病原鉴定。结果显示患病黄颡鱼的脾脏和肾脏细胞坏死、出血。超微切片观察结果显示：患病黄颡鱼内脏组织的细胞中存在大量球形无囊膜病毒样颗粒，直径约30～40nm，在黄颡鱼的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、鳃等不同组织中分布，尤其是在脾脏和肾脏组织中有大量病毒增殖，经高通量测序后，发现该病毒病原为新的病毒病原，基因组序列与杯状病毒科其他成员有较大差异，但是进化关系相近，因此命名为黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivrus,yccv)(图1)。因尚无可用于增值yccv的细胞系，本发明的yccv均是通过将该病毒匀浆组织接种至健康黄颡鱼后取其脾脏和肾脏组织进行yccv相关实验。
将yccv匀浆悬液注射到健康黄颡鱼体内3～10天后，可引起黄颡鱼死亡。收集人工接种yccv后濒死的黄颡鱼组织，进行临床和超薄切片观察，其病变特征及所含病毒形态特征与自然发病黄颡鱼的检出特征相同。
在获得yccv基因组核酸、完成其全基因组测序之后，对病毒基因组结构进行分析。结果显示yccv全基因组rna含7243bp(seqidno.2所示)，为单股正链rna，推定编码3个开放阅读框(orf)，在基因结构组成方面与杯状病毒科中部分成员属相似，但基因组同源性差异较大，在核苷酸层面无同源性，在氨基酸层面也仅有30％左右的同源性，是一株新的病毒株(图2)。
经序列比对，最终筛选黄颡鱼杯状病毒的非结构蛋白序列yccv-ns用于诊断检测黄颡鱼杯状病毒，其序列为seqidno.1所示。
实施例2：
针对yccv-ns的特异性序列设计的引物在制备黄颡鱼杯状病毒(yellowcatfishcalicivrus,yccv)检测试剂盒中的应用：
针对seqidno.1所示序列设计的引物为：yccv-ns-f：5'-cgcctaaagttctcctccttgttgg-3'和yccv-ns-r：5'-aaagttgggtggattggtttgtcat-3'。
扩增体系为：
待检样品cdna1μl(0.1μg)，引物yccv-ns-f/yccv-ns-r每条各加1μl10μm；加2μl、10mm的dntpmix；加5μl10×transtarttaqbuffer(mg2 )和1μltranstarttaqdnapolymerase(北京全式金生物技术有限公司产品)，加ddh2o，使终体积为50μl，混匀后，离心15s使反应组分集中在管底。
进行pcr扩增，循环程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1.5min，32个循环，72℃延伸5min,12℃保存。
扩增结束后，向体系中加入3μl6×loadingbuffer，混匀，取5μl上样至1％浓度琼脂糖凝胶孔中，199v，97ma，电泳30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入1％浓度的eb液中，浸泡5min，在凝胶成像系统(gbox全自动凝胶成像及分析系统，美国syngene公司生产)中成像。
判定：
由引物yccv-ns-r/yccv-ns-r扩增，当待检cdna样品中含yccv基因，其产物电泳后出现1条分子量为523bp(seqidno.3所示)的核酸条带(图3)。
实施例3：
针对yccv-ns的特异性序列设计的引物的灵敏度：
将黄颡鱼杯状病毒yccv(yellowcatfishcalicivrus,yccv)基因组cdna依次10倍系列稀释：原液0.1ng/μl、10-1…至10-4，作为模板cdna。
2)按照实施例2中的方法进行rt-pcr扩增；
4)该引物对yccv的检测限可达0.1ng/μl(图4)。
实施例4：
针对yccv-ns的特异性序列设计的引物的特异性：
针对目前水生动物流行的主要病毒病原，如草鱼呼长孤病毒、鲤疱疹病毒ii型、黄鳝弹状病毒和大鲵虹彩病毒设计引物(见表1)，用实施例2的引物和方法对表1中的待检的病毒核酸样品进行扩增。结果除黄颡鱼杯状病毒的核酸样品能被扩增(523bp)，其它引物扩增结果均为阴性。
表1水生动物主要病毒病原信息
序列表
<110>中国水产科学研究院长江水产研究所
<120>分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>5060
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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