一种高比例B7H4阳性脐带间充质干细胞、其培养方法及培养液与流程

本发明属于干细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种高比例b7h4阳性脐带间充质干细胞、其培养方法及培养液。
背景技术：
：脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，uc-mscs)是一种来源丰富、易于分离培养的干细胞，uc-mscs也是应用于临床试验最广泛的细胞，治疗的病种涉及到自身免疫性疾病，糖尿病，肝脏疾病和心血管疾病等多个方面。uc-mscs的临床试验研究进展迅速，结果也令人欢欣鼓舞，但是干细胞治疗也存在诸多问题。例如损伤组织部位缺氧环境和炎性因子对的干细胞存活时间和免疫调节功能的影响等。而延长干细胞在体内的存活时间，就可以调高间充质干细胞治疗的疗效，这对于间充质干细胞治疗技术更好地应用于临床十分重要。目前延长间充质干细胞的体内存活时间的方法主要有低氧预处理培养法，预先将间充质干细胞在低氧环境(体积分数1％氧气)中生长一段时间，使其抗凋亡因子表达升高，进而增加体内存活时间。但是间充质干细胞低氧处理需要特殊的昂贵设备如低氧细胞培养箱。而且间充质干细胞低氧处理过程中需要消耗大量的氮气，导致成本进一步升高，使得其推广受到一定的限制。白介素-6(il-6)是一种炎症调解因子，不仅可以调节免疫细胞的功能，还能调控干细胞的生长和分化过程。il-6在uc-mscs的培养中的应用已有相关研究，例如中国发明专利“cn109777771b原代脐带间充质干细胞的无血清培养基及其使用方法”中，采用il-3、il-6、g-csf和scf等细胞因子可协同fl产生强烈的增殖效应同时抑制脐带间充质干细胞的分化。然而，目前人们对于将il-6用于uc-mscs的培养究竟能够产生什么作用的认识仍然不够全面，其对于uc-mscs的存活时间等性能的影响仍然是未知的。技术实现要素：针对现有技术的缺陷，本发明提供一种高比例b7h4阳性脐带间充质干细胞、其培养方法及培养液。目的在于提供一种能够长时间在体内存活的脐带间充质干细胞。一种脐带间充质干细胞，所述脐带间充质干细胞表面表达b7h4分子的比例大于等于45％。优选的，所述脐带间充质干细胞表面表达b7h4分子的比例为45-61.8％。优选的，所述脐带间充质干细胞表面表达pd-l1分子的比例大于等于40％。优选的，所述脐带间充质干细胞表面表达pd-l1分子的比例为40-51.5％。优选的，所述脐带间充质干细胞采用同时含有il-6和il-6rα的刺激培养液培养得到。本发明还提供上述脐带间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)接种并培养脐带间充质干细胞；(2)使用同时含有il-6和il-6rα的刺激培养液培养所述脐带间充质干细胞；(3)消化步骤(2)得到的脐带间充质干细胞，吹打，终止消化，即得。优选的，步骤(1)中，接种密度为10000-20000细胞/cm2；和/或，所述培养的条件为在37℃，体积分数5％co2浓度下培养24小时；和/或，步骤(1)所用培养液是以l-dmem培养液作为基础培养基，添加有终浓度为：10％v/v的fbs胎牛血清；5mmol/l的谷氨酰胺；100u/ml的青霉素；100μg/ml的链霉素。优选的，步骤(2)中，所述培养的条件为在37℃，体积分数5％co2浓度下培养48小时；和/或，步骤(2)所用刺激培养液是以l-dmem培养液作为基础培养基，添加有终浓度为：10％v/v的fbs胎牛血清；1-10ng/ml的il-6；1-10ng/ml的il-6rα；5mmol/l的谷氨酰胺；100u/ml的青霉素；100μg/ml的链霉素。本发明还提供一种用于培养上述脐带间充质干细胞的培养液，它是以l-dmem培养液作为基础培养基，添加有终浓度为：10％v/v的fbs胎牛血清；1-10ng/ml的il-6；1-10ng/ml的il-6rα；5mmol/l的谷氨酰胺；100u/ml的青霉素；100μg/ml的链霉素。它是以l-dmem培养液作为基础培养基，添加有终浓度为：10％v/v的fbs胎牛血清；1ng/ml的il-6；1ng/ml的il-6rα；5mmol/l的谷氨酰胺；100u/ml的青霉素；100μg/ml的链霉素。本发明还提供il-6和il-6rα在培养上述脐带间充质干细胞，或在制备用于培养上述脐带间充质干细胞的培养液中的用途。本发明中，所述“脐带间充质干细胞表面表达b7h4分子的比例”是指脐带间充质干细胞中表面b7h4呈阳性的比例；所述“脐带间充质干细胞表面表达pd-l1分子的比例”是指脐带间充质干细胞中表面pd-l1呈阳性的比例。b7h4是一个在细胞表面表达的免疫检查点分子，是b7家族新发现的分子。b7h4家族的分子在免疫细胞调节反应中表现出正或者负共刺激信号，而本发明发现表达b7h4分子的uc-mscs可以在体内存活更长的时间。因而本发明提供的高比例b7h4阳性uc-mscs在体内能够存活更长的时间，从而有利于调高间充质干细胞治疗的疗效。此外，pd-l1也是一种免疫负调控分子，本发明提供的uc-mscs表面同样具有高比例的pd-l1表达，这能进一步延长uc-mscs在体内的存活时间。在优选方案中，本发明采用低浓度白介素-6(il-6)因子短时间的刺激，可以培养得到b7h4阳性比例更高的脐带间充质干细胞。il-6通过结合可溶性白介素-6受体-阿尔法(il-6rα)和gp130,向细胞内传递信号，激活stat3等信号通路，调节基因的表达。因此，在优选方案中，为了更好地发挥il-6因子的信号，本发明在刺激培养基中加入il-6因子的同时还加入了il-6rα，以保障信号更加高效的传递给间充质干细胞，进而诱导产生更多的b7h4阳性脐带间充质干细胞。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为实验例1的脐带间充质干细胞流式细胞仪分析结果；图2为实验例2的uc-mscs移植小鼠活细胞体内荧光成像实验结果。具体实施方式实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1高比例b7h4阳性脐带间充质干细胞的培养本实施例的培养方法如下：(1)将uc-mscs按照10000个细胞/cm2的密度种植到3个t75细胞培养瓶中，分别加入基础培养液，放置在细胞培养箱中，37℃，体积分数5％co2浓度进行培养；其中，基础培养液组成为：l-dmem(gibco)；fbs胎牛血清10％v/v(gibco)；谷氨酰胺5mmol/l(gibco)；青霉素:100u/ml(gibco)；链霉素100g/ml(gibco)。(2)24小时后，更换步骤(1)中的基础细胞培养液，分别加入新的刺激培养液，将细胞培养瓶放置在细胞培养箱中，37℃，体积分数5％co2浓度进行培养48小时；其中，刺激培养液组成为：l-dmem(gibco)；fbs胎牛血清10％v/v(gibco)；il-61ng/ml(r&d)；il-6rα1ng/ml(r&d)；谷氨酰胺5mmol/l(gibco)；青霉素:100u/ml(gibco)；链霉素100g/ml(gibco)。(3)将步骤(2)得到的uc-mscs用浓度为质量分数0.25％的胰酶消化2min，之后将间充质干细胞吹打下来并用基础培养液终止消化，200g离心5分钟，弃上清，使用pbs缓冲液重悬细胞，即得。对比例1本对比例的培养方法与实施例1基本相同，区别在于将步骤(2)中所用含有il-6的刺激培养液替换为基础培养液，即本对比例中步骤(2)所用的刺激培养液组成为：l-dmem(gibco)；fbs胎牛血清10％v/v(gibco)；谷氨酰胺5mmol/l(gibco)；青霉素:100u/ml(gibco)；链霉素100g/ml(gibco)。对比例2本对比例的培养方法与实施例1基本相同，区别在于将步骤(2)中所用含有il-6的刺激培养液替换为含有干扰素(ifn-γ)的刺激培养液，即本对比例中步骤(2)所用的刺激培养液组成为：l-dmem(gibco)；fbs胎牛血清10％v/v(gibco)；ifn-γ500u/ml(r&d)；谷氨酰胺5mmol/l(gibco)；青霉素:100u/ml(gibco)；链霉素100g/ml(gibco)。为了进一步说明本发明的有益效果，将实施例1和对比例1、2得到的三种uc-mscs分别记为il-6刺激组(图1中为il-6)、基础培养对照组(图1中为control)和干扰素刺激组(图1中为ifn-γ)，进行如下实验。实验例1脐带间充质干细胞流式细胞仪分析进行流式细胞仪分析，具体步骤如下：每个流式管中放入1×106的uc-mscs和30μl的抗体，每管分别加入(ebioscience，anti-humancd80(b7-1),fitc；anti-humancd86(b7-2),pe；anti-humancd274(pd-l1,b7-h1),apc)和(ebioscience，anti-humanhla-drapc；anti-humanmhc-ⅰpe；b7-h4monoclonalantibody,percp-efluor710)，室温孵育30分钟后加入pbs缓冲液洗涤2次，以400μlpbs重悬上机检测，流式结果使用flowjo软件进行分析。结果如图1所示，uc-mscs分别经过不同刺激培养液的培养处理后，其细胞表面分子发生了很大的变化。其中，hla-dr分子和免疫共刺激因子cd80和cd86表达增加会导致uc-mscs被免疫细胞攻击和清除，影响细胞在体内存活时间。而从实验结果来看，干扰素刺激组uc-mscs表面的hla-dr分子和免疫共刺激因子cd80和cd86分子迅速上升，而il-6刺激组和基础培养对照组中的hla-dr分子和免疫共刺激因子cd80和cd86分子的表达比例则相对较低，表明il-6刺激组的uc-mscs不易受到免疫细胞攻击和清除，存活时间增加。另一方面，pd-l1和b7h4为免疫负调控分子，其表达比例升高将使得uc-mscs具有更低的免疫刺激能力，以及更强的免疫抑制能力，进而有利于增加其体内存活时间。从实验结果来看，干扰素刺激组和基础培养对照组中的pd-l1和b7h4分子表达比例相对较低，而il-6刺激组的pd-l1和b7h4分子表达比例相对较高，这也表明il-6刺激组的uc-mscs不易受到免疫细胞攻击和清除，存活时间增加。从本实验例的结果可知，il-6刺激组的uc-mscs中pd-l1和b7h4分子表达比例显著升高，相比于基础培养对照组，pd-l1分子表达比例从8.23％升高到49.9％，b7h4分子表达比例从9.08％升高到61.8％。这说明，il-6刺激培养液处理的uc-mscs具有更低的免疫刺激能力，以及更强的免疫抑制能力，有利于在体内更长时间的存活。实验例2uc-mscs移植小鼠活细胞体内荧光成像实验由于lenticrisprv2系统带有luc基因，因此可以通过小动物荧光活体成像技术分析对比经过基础培养液、il-6刺激培养液和干扰素刺激培养液处理后的uc-mscs在小鼠模型体内的定位及存活时间。(1)将il-6刺激组、基础培养对照组和干扰素刺激组的uc-mscs，分别加入含有luc基因的慢病毒，稳定转染后，形成含有luc荧光报告基因的uc-mscs。(2)经过小鼠心肌动脉，将3组uc-mscs细胞各1×105分别注射到模型小鼠中。(3)3周后，经过眼球后注射荧光素底物，使用小动物荧光成像仪分析三组uc-mscs在体内的分布及驻留情况。结果如图2所示，其中il-6刺激组、基础培养对照组和干扰素刺激组分别为中间、左侧和右侧的小鼠。结果表明3组uc-mscs在体内的存活时间有很大的差异。其中il-6刺激组的uc-mscs在小鼠体内存活的时间最久，3周后仍然有大量细胞在小鼠体内存活。而基础培养对照组和干扰素刺激组的uc-mscs在小鼠体内存活的时间较短，3周后在小鼠体内存活的细胞数量非常少。实验例3il-6最佳浓度流式细胞仪分析确认实验(1)将uc-mscs按照10000个细胞/cm2的密度种植到3个t75细胞培养瓶中，分别加入基础培养液，放置在细胞培养箱中，37℃，体积分数5％co2浓度进行培养；其中，基础培养液组成为：l-dmem(gibco)；fbs胎牛血清10％v/v(gibco)；谷氨酰胺5mmol/l(gibco)；青霉素:100u/ml(gibco)；链霉素100g/ml(gibco)。(2)24小时后，更换步骤(1)中的基础细胞培养液，分别加入新的刺激培养液，将细胞培养瓶放置在细胞培养箱中，37℃，体积分数5％co2浓度进行培养48小时；其中，刺激培养液组成为：l-dmem(gibco)；fbs胎牛血清10％v/v(gibco)；按照实验组设置添加不同量的il-6和il-6rα；谷氨酰胺5mmol/l(gibco)；青霉素:100u/ml(gibco)；链霉素100g/ml(gibco)。6组实验组中，il-6和il-6rα浓度如下表：表1不同实验组的il-6和il-6rα浓度a组b组c组d组e组f组il-60.1ng/ml0.1ng/ml1ng/ml1ng/ml10ng/ml10ng/mlil-6rα0.1ng/ml0ng/ml1ng/ml0ng/ml10ng/ml0ng/ml(3)将步骤(2)得到的uc-mscs用浓度为质量分数0.25％的胰酶消化2min，之后将间充质干细胞吹打下来并用基础培养液终止消化，200g离心5分钟，弃上清，使用pbs缓冲液重悬细胞，即得。所得各组细胞分别进行流式细胞仪分析，具体步骤如下：每个流式管中放入1×106的uc-mscs和30μl的抗体，每管分别加入anti-humancd274(pd-l1,b7-h1),apc)和b7-h4monoclonalantibody,percp-efluor710，室温孵育30分钟后加入pbs缓冲液洗涤2次，以400μlpbs重悬上机检测，流式结果使用flowjo软件进行分析，结果如下表：表2流式细胞仪分析结果结果如表2所示，不同浓度的il-6和il-6rα对于刺激uc-mscs其细胞表面分子发生了很大的变化，a组由于il-6浓度过低，导致b7h4表达水平和pd-l1表达水平都很低，c组的组合浓度是最优的，b7h4表达水平和pd-l1表达水平都显著升高，b、d和f组由于没有il-6rα，导致il-6的信号向细胞内传导效率变低，因此其b7h4表达水平和pd-l1表达水平都降低。e组的组合il-6和il-6rα的浓度都是最高，但是其b7h4表达水平对比c组并没有升高，反而从61.8％降低到45.8％，而pd-l1表达水平对比c组升高不明显，因此c组的il-6和il-6rα浓度组合是最合适的，而且il-6rα对于il-6的信号向细胞内传导非常重要。通过上述实施例和实验例可以看到，通过含有il-6的刺激培养液培养得到的uc-mscs具有高比例的b7h4和pd-l1表达，这使得uc-mscs具有更低的免疫刺激能力，以及更强的免疫抑制能力，进而能够增加uc-mscs在体内的存活时间。本发明的技术方案有利于调高间充质干细胞治疗的疗效，具有很好的应用前景。当前第1页12