本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法。
背景技术：
造血干细胞(hscs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，它是第一个成功用于治疗和治愈患者的成体干细胞。
造血干细胞是成功治疗白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等多种血液疾病和恶性肿瘤的关键。骨髓细胞减少症可以通过输注hsc进行选择性的治疗，起到稳定状态和调节造血功能的作用。hsc可以改善衰老相关的免疫缺陷，及时补充hsc可以增强老年人的免疫功能，全球每年进行超过68000例造血干细胞移植，无论是自体移植还是异体移植，造血干细胞越来越多地被应用到临床上来治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、骨髓衰竭性疾病以及一些先天性疾病等，同时在儿科的血液病、遗传病、肿瘤的治疗中也表现出一定的应用发展前景。
临床上常用的移植hsc源有骨髓,动员的外周血及脐带血.但是,由于这些组织中hsc含量很少,及组织相容性抗原特异的供者稀缺等问题,导致许多病人无法获得足够量的组织相容性匹配的hsc.然而,hsc数量不足仍然是制约hsc移植临床应用的主要瓶颈。如何通过体外培养获得满足临床需要的hsc已成为近年来学者们研究的热点问题。
人多能干细胞(humanpluripotentstemcell,hpsc),包括人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell,hesc)和人诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcell,hipsc),人多能干细胞在体外可以无限制生长而保持非分化状态并且具有自我复制并分化为人体各种功能细胞的潜能，hpsc细胞无限的复制能力可以为替代治疗提供充足的移植物来源，目前已成为成为hsc移植的重要来源。
传统方法中的人多能干细胞诱导分化培养基中通常添加有血清以促进细胞增殖，并将多能干细胞与不同的基质细胞共培养，如op9细胞等，直接定向诱导分化为造血细胞；然而此传统方法中使用血清增加了污染源，并且使用op9细胞具有未知风险，安全性低。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种安全的多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；
所述第一阶段培养基包括e8完全培养基、bmp4、rhg-csf、chir99021、pdgf、igf-ⅰ，所述第一阶段培养基中bmp4、rhg-csf、chir99021、pdgf、igf-ⅰ的终浓度比为(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)∶(0.25-0.5)∶(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)；
所述第二阶段培养基包括e6基础培养基、sb4315424、vegf、scf、tpo、il-3、csf，所述第二阶段培养基中sb4315424、vegf、scf、tpo、il-3、csf的终浓度比为(0.25-1.0)∶(1.0-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)；
所述第三阶段培养基包括stemlineⅱ基础培养基、vegf、scf、hgh、il-3、flt3l、epo、egf，所述第三阶段培养基中vegf、scf、hgh、il-3、flt3l、epo、egf的终浓度比为(0.2-2.0)：(0.5-2.0)∶(0.2-0.4)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)。
可选的，所述第一阶段培养基中bmp4的终浓度为50-100ng/ml、rhg-csf的终浓度为50-100ng/ml、chir99021的终浓度为10-50mm/ml、pdgf的终浓度为50-100ng/ml、igf-ⅰ的终浓度为50-100ng/ml；所述第二阶段培养基中sb4315424的终浓度为1-5um/ml、vegf的终浓度为50-100ng/ml、scf的终浓度为20-80ng/ml、tpo的终浓度为20-80ng/ml、il-3的终浓度为20-80ng/ml、csf的终浓度为20-80ng/ml；所述第三阶段培养基中vegf的终浓度为10-60ng/ml、scf的终浓度为20-80ng/ml、hgh的终浓度为10-100nm、il-3的终浓度为20-80ng/ml、flt3l的终浓度为20-80ng/ml、epo的终浓度为20-80ng/ml、egf的终浓度为20-80ng/ml。
可选的，所述第一阶段培养基中bmp4、rhg-csf、chir99021、pdgf、igf-ⅰ的终浓度比为1.0∶1.0∶0.25∶1.0∶1.0；所述第二阶段培养基中sb431542、vegf、scf、tpo、il-3、csf的终浓度比为0.25∶1.0∶0.625∶0.625∶0.625∶0.625；所述第三阶段培养基中vegf、scf、hgh、il-3、flt3l、epo、egf的终浓度比为1.0∶1.25∶0.25∶1.25∶0.5∶1.0∶1.0。
可选的，所述第一阶段培养基中bmp4的终浓度为80ng/ml、rhg-csf的终浓度为80ng/ml、chir99021的终浓度为4μm、pdgf的终浓度为80ng/ml、igf-ⅰ的终浓度为80ng/ml；所述第二阶段培养基中sb4315424的终浓度为2μm、vegf的终浓度为80ng/ml、scf的终浓度为50ng/ml、tpo的终浓度为50ng/ml、il-3的终浓度为50ng/ml、csf的终浓度为50ng/ml；所述第三阶段培养基中vegf的终浓度为40ng/ml、scf的终浓度为50ng/ml、hgh的终浓度为10ng/ml、il-3的终浓度为50ng/ml、flt3l的终浓度为20ng/ml、epo的终浓度为40ng/ml、egf的终浓度为40ng/ml。
本发明还公开了一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的方法，包括以下步骤：
s1：将多能干细胞置于aggrewell板中，并于上述任一项所述的第一阶段培养基中进行第一阶段的诱导分化成为拟胚体；
s2：将拟胚体置于上述任一项所述的第二阶段培养基中进行第二阶段的诱导分化；
s3：将s2诱导分化后的细胞混合物置于上述任一项所述的第三阶段培养基中进行第三阶段的诱导分化。
可选的，将多能干细胞接种于aggrewell板进行拟胚体分化的第一阶段培养记为第0天，所述第一阶段的诱导分化自第0天开始至第4天结束，所述第二阶段的诱导分化自第4天开始至第8天结束，所述第三阶段的诱导分化自第8天开始至第14天结束。
可选的，所述第一阶段的诱导分化的第0天至第4天，接种时期使用第一阶段分化培养基，期间不换液；所述第二阶段的诱导分化的第4天将拟胚体转移至t75培养瓶中培养至第8天，转移时期加第二阶段分化培养基，期间不换液；所述第三阶段的诱导分化的第8天将t75培养瓶中的培养基更换新鲜第三阶段培养基，自所述第三阶段的诱导分化起第8天开始，隔3天半量更换为新鲜的第三阶段培养基。第三阶段培养期间，隔3天半量更换为新鲜的第三阶段培养基，为细胞分化提供足够的细胞因子和营养，促进细胞快速分化，及时换液可以大大提高造血干细胞的产量。
可选的，所述aggrewell板中多能干细胞的接种数量为每孔接种30万个细胞。
可选的，所述多能干细胞包括诱导多能干细胞、胚胎干细胞中的一种或两种。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过采用上述三种特定成分和浓度将多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，依次对多能干细胞诱导分化，提高了多能干细胞向造血干细胞分化的效率；
2.通过使用纯细胞因子法配制培养基，避免了血清的使用，降低了污染源从而避免污染；本发明避免了一些其他细胞系作为饲养诱导条件，使分化出的细胞更为安全，降低未知风险。
附图说明
图1是流式检测实施例1及其对比组的cd34 阳性率的结果图。
图2是流式检测实施例2及其对比组的cd34 阳性率的结果。
图3是流式检测阴性组的cd34 阳性率的结果图。
图4是实施例1及其对比组、实施例2及其对比组的阳性率柱状图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
本发明采用的细胞购于北京北纳创联生物技术研究院。
一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法，采用细胞因子法诱导多能干细胞进行分化，所述多能干细胞包括诱导多能干细胞、胚胎干细胞中的一种或两种。
实施例1
本实施例提供细胞因子法诱导胚胎干细胞(es)分化成造血干细胞的培养基及方法。
其中，本实施例采用的培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；
第一阶段培养基中，bmp4、rhg-csf、chir99021、pdgf、igf-ⅰ的终浓度比为1.0∶1.0∶0.25∶1.0∶1.0，具体配方为：e8完全培养基中加入终浓度为80ng/ml的骨形态发生蛋白4(bmp4)、终浓度为80ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子(rhg-csf)、终浓度为4μm的chir99021、终浓度为80ng/ml的pdgf、终浓度为80ng/ml的igf-ⅰ。
第二阶段培养基中sb4315424、vegf、scf、tpo、il-3、csf的终浓度比为0.25∶1.0∶0.625∶0.625∶0.625∶0.625，具体配方为：e6基础培养基中加入终浓度为2μm的sb4315424、终浓度为80ng/ml的vegf、终浓度为50ng/ml的干细胞因子(stemcellfactor，scf)、终浓度为50ng/ml的tpo、终浓度为50ng/ml的白细胞介素-3(il-3)、终浓度为50ng/ml的csf。
第三阶段培养基中vegf、scf、hgh、il-3、flt3l、epo、egf的终浓度比为1.0∶1.25∶0.25∶1.25∶0.5∶1.0∶1.0，具体配方为：stemlineⅱ基础培养基中加入终浓度为40ng/ml的vegf、终浓度为50ng/ml的干细胞因子(stemcellfactor，scf)、终浓度为10ng/ml的hgh、终浓度为50ng/ml的白细胞介素-3(il-3)、终浓度为20ng/ml的flt3、终浓度为40ng/ml的epo、终浓度为40ng/ml的egf。
本实施例采用的细胞因子法诱导胚胎干细胞(es)分化成造血干细胞的方法包括：
(1)用aars处理aggrewell24孔板使aggrewell板适宜接种胚胎干细胞且确保不会贴壁并形成拟胚体；
(2)步骤(1)接种培养基使用第一阶段分化培养基，接种数量为每孔30万个细胞；
(3)接种当天记为第0天，在37℃、5％co2培养箱中培养4天，第4天在体视显微镜下挑选出成熟且状态较好的拟胚体，按照每150个拟胚体接种入t75培养瓶中，培养基使用第二阶段分化培养基，在37℃、5％co2培养箱中培养4天。第8天开始换液，将第二阶段分化培养基吸弃并添加第三阶段分化培养基，此后隔3天半量换液以提高分化效率，第三阶段分化周期为7-20天，本实施中在第14天收取造血干细胞。
为了做比较，本实施例还设置了对比组，对比组与本实施例的区别仅在于，仅采用如下配方的培养基进行第一次诱导分化：e8完全培养基中加入终浓度为40ng/ml的骨形态发生蛋白4(bmp4)、终浓度为40ng/ml的rhg-csf、终浓度为2μm的chir99021、终浓度为40ng/ml的pdgf、终浓度为40ng/ml的igf-ⅰ。
实施例2
本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于多能干细胞的种类选用诱导多能干细胞(ips)。
为了做比较，本实施例还设置了对比组，对比组与本实施例的区别仅在于，仅采用如下配方的培养基进行第一次诱导分化：e8完全培养基中加入终浓度为40ng/ml的骨形态发生蛋白4(bmp4)、终浓度为40ng/ml的rhg-csf、终浓度为2μm的chir99021、终浓度为40ng/ml的pdgf、终浓度为40ng/ml的igf-ⅰ。
实施例1-2的结果测试
cd34 阳性率的检测：取实施例1、实施2及其对比组最终所得细胞，收集细胞到50ml离心管中1000r/min离心5min，弃上清后用1ml含2％(v/v)血清的pbs重悬，加入抗体cd34-pe-cy7，4℃孵育30min后用含2％血清的pbs洗一遍。然后以5×106/ml的密度重悬细胞，使用agilentnovocyte流式仪细胞仪检测并分析其分化效率。在检测过程中，以普通es细胞为阴性组，即未进行造血诱导分化的细胞或者是虽进行分化实验但是并未用流式抗体染色的细胞。
结果实施例1及其对比组测试结果如图1、图4所示，流式细胞分析发现实施例1的cd34 阳性率上升到89.69％(其对比组为75.48％)，表明实施例1相较于其对比组的分化效率明显上升；实施例2及其对比组的测试结果如图2、图4所示，cd34 阳性率上升到88.06％(其对比组为64.54％)，表明实施例2相较于其对比组的分化效率明显上升。阴性对比组见图3。
对比例1
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第三阶段培养基培养14天。
结果：本对比例测得的cd34 阳性率为21.62％。
对比例2
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第一阶段培养基培养14天。
结果：本对比例测得的cd34 阳性率为15.54％。
对比例3
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第二阶段培养基培养d14天。
结果：本对比例测得的cd34 阳性率为26.42％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
