本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种用于三维细胞聚集体培养的半球微孔阵列基底及其制备方法。
背景技术：
细胞以单层铺展于某种基底表面的生长方式被称为二维培养，是一种便于观察和长期培养的细胞培养方式。然而随着研究的逐渐深入，人们发现细胞与细胞微环境之间的相互作用对细胞的增殖、分化以及功能有着决定性的作用。显然，由于细胞在生理环境下多是以多层细胞堆积的形式存在于细胞外基质中，因此二维培养并不能很好地模拟其生存环境从而满足研究需求。因此如何模拟细胞的体内微环境引起了人们的注意。三维细胞聚集体(cellaggregation)培养作为日益兴起的仿生模拟培养方式，其可以非常有效地模拟细胞生存环境，加强细胞-细胞、细胞-环境间的联系，更有助于细胞维持并恢复细胞本征的行为与功能。细胞聚集体在药物筛选、肿瘤研究及其毛囊重建中迫切需要，因此急需可稳定高效、大批量制备球径可控的细胞球技术。
细胞聚集体的培养是通过减少细胞与基底的黏附从而加强细胞与细胞间的相互作用来达到的，有多种实施措施。悬滴法(handingdrop)是最简单的培养方式，但是培养过程中却极易受外界干扰、无法更换培养介质且劳动量大难以大规模制备。表面低黏附处理法改善了悬滴法易受干扰的缺陷，可大量制备细胞聚集体，但是聚集体大小难以控制，应用受限。近年发展的微阵列法(microarray)，通过一致的阵列可以得到大小均一的细胞聚集体，可大规模制备是十分理想的细胞聚集体制备方法。但是现有的微阵列基本都是借助光刻技术制备，需要特需设备和仪器，成本高昂，且只能制备得到的平板型底面。而弧形底面则能更高效的促进细胞聚集，并提高细胞捕获率提高细胞利用率。现有技术也有借用微球阵列制备复刻出pdms弧形培养基底，但是其得到的是开口较小的球腔，细胞间不能很好的进行信号传递，且细胞球收集困难；同时由于pdms较为疏水性使用前必须经过一系列预处理，且细胞捕获率低导致通常需要高密度细胞才能形成聚集体。
技术实现要素：
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底及其制备方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明公开的细胞培养基底由琼脂糖固化成型得到且表面具有半球微孔阵结构，该结构不需要借助复杂设备与仪器得到，可稳定多次制备、重现性高。其使用操作与二维细胞类似，但是由于琼脂糖不具备细胞粘性且具微孔结构，可将细胞均匀的捕获在半球微孔底部进而形成尺寸均一的聚集体。
本发明提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底的制备方法，包括如下步骤：
(1)微球阵列制备：在洁净的平面上贴一层双面胶，然后将筛网粘在平面上，倒入微球，将单个微球固定在单个筛网微孔内，小心按压，轻轻揭下筛网，得到带有微球阵列的平面；
(2)半球阵列制备：在洁净的透光基片上涂覆一层紫外胶，将步骤(1)所述带有微球阵列的平面压覆在紫外胶上，在紫外灯照射下进行固化处理，然后将透光基片与带有微球阵列的平面分开，取带有紫外胶的透光基片，得到半微球阵列模板；
(3)翻模：往步骤(2)所述微球阵列模板上加入琼脂糖溶液，室温静置至琼脂糖冷却固化，将固化后的琼脂糖与微球阵列模板分离，得到所述用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底。
进一步地，步骤(1)所述平面为玻璃平面。
进一步地，步骤(1)所述筛网上的筛孔大小为30-50目。
优选地，步骤(1)所述筛网上的筛孔大小为40目。
进一步地，步骤(1)所述微球的直径为300-400μm。
优选地，步骤(1)所述微球的直径为350μm。
进一步地，步骤(1)所述将微球固定在筛网微孔内的方式为将微球通过刮擦进筛网微孔内。
优选地，步骤(1)中，一个筛网微孔内固定一个微球。
步骤(1)所述微球阵列排布是借助合适目数的筛网得到，排列规则。
进一步地，步骤(2)所述透光基片为玻璃基片，所述透光基片的厚度为10-30mm。
优选地，步骤(2)所述透光基片的厚度为20mm。
进一步地，步骤(2)所述涂覆紫外胶的转速为1500-2000rpm。
进一步地，步骤(2)所述固化处理的时间为5-15min。
优选地，步骤(2)所述固化处理的时间为10min。
步骤(2)所述半微球阵列模板的微孔大小是可通过改变小球的球径来调控。
步骤(2)所述半微球阵列模板的大小可变，可兼容各种孔板大小。
进一步地，步骤(3)所述琼脂糖溶液的体积百分比浓度为2％-5％。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底。
本发明提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底，其底部具有规则光滑的半球形微孔。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底是通过简单的半球阵列翻模而成，操作简易，成本低廉，无任何复杂操作；
(2)本发明提供的制备方法，只需要借助双面胶、筛网和一定直径的小钢球即可制备得到，制备方法简单；
(3)本发明提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底，可以让低密度8w左右的细胞在24h后聚集。
(4)本发明提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底是以琼脂糖凝胶为原料，该凝胶本身不具有细胞粘性，且表面具有规则的半球微孔阵结构，可将细胞捕获在微孔结构中，增强细胞间碰撞便于聚集体形成，同时该基底形状大小可控，可与各种培养皿适配，可用于快速大规模制备尺寸均一的细胞聚集体。本发明中的半球微孔阵结构不需要采取光刻方式，只需要利用琼脂糖翻模即可得到，重现性、稳定性高。
附图说明
图1为实施例中半球微孔阵列基底制备步骤示意图。
图2a为实施例中半球微孔阵结构与无微孔结构的捕获原理示意图；
图2b为实施例中半球微孔阵结构与无微孔结构的细胞捕获对比图。
图3为实施例中匀胶机2000rpm制备的半球微孔阵列基底结构形貌图。
图4为利用本发明实施例的半球微孔阵列基底制备的真皮毛乳头细胞聚集体阵列形貌图，细胞数为8*104。
图5为利用本发明实施例的半球微孔阵列基底制备的真皮毛乳头细胞聚集体阵列形貌图，细胞数为1*105。
图6为利用本发明实施例的半球微孔阵列基底制备的真皮毛乳头细胞聚集体阵列形貌图，细胞数为2*105。
图7为实施例中匀胶机1500rpm制备的半球微孔阵列基底结构形貌图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施列1
一种用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底的制备方法，包括如下步骤(可参照图1所示)：
(1)在玻璃表面紧贴上一层双面胶，利用双面胶将筛孔大小为30目的不锈钢筛网粘在表面，得到双面胶-玻璃-不锈钢筛网的夹层结构，然后在不锈钢筛网上倒入过量的400μm不锈钢微球，通过刮擦的方式将单个钢珠捕获于单个筛网微孔内，每个筛孔中均固定一个钢珠，按压，使钢珠被双面胶黏贴，然后揭下不锈钢筛网得到了带有微球阵列的平面(其正面为排列整齐的微球阵列)。
(2)准备一块洁净的玻璃基片(厚度为20mm)，在2000rpm转速下利用匀胶机在其上涂覆一层紫外胶，然后将微球阵列按压覆在紫外胶上，然后置于紫外灯下照射10min固化，紫外胶固化后用镊子将两块玻璃分开，取带有紫外胶的玻璃，得到排列规整的半微球阵列模板。
(3)配置体积分数为5％的琼脂糖溶液；将所述半微球阵列模板放入12孔板中(以防后面琼脂糖溶液飞溅或流动)，在半微球阵列模板表面倒入2ml的琼脂糖溶液，然后室温静置直到琼脂糖冷却固化，然后分离琼脂糖和微球阵列，得到所述用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底(琼脂糖半球微阵列)。
实施列2
一种用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底的制备方法，包括如下步骤(可参照图1所示)：
(1)在玻璃表面紧贴上一层双面胶，利用双面胶将筛孔大小为40目的不锈钢筛网粘在表面，得到双面胶-玻璃-不锈钢筛网的夹层结构，然后在不锈钢筛网上倒入过量的350μm不锈钢微球，通过刮擦的方式将单个钢珠捕获于单个筛网微孔内，每个筛孔中均固定一个钢珠，按压，使钢珠被双面胶黏贴，然后揭下不锈钢筛网得到了排列整齐的微球阵列带有微球阵列的平面(其正面为排列整齐的微球阵列)。
(2)准备一块洁净的玻璃基片(厚度为10mm)，在2000rpm转速下利用匀胶机在其上涂覆一层紫外胶，然后将微球阵列按压覆在紫外胶上，然后置于紫外灯下照射10min固化，紫外胶固化后用镊子将两块玻璃分开，取带有紫外胶的玻璃，得到排列规整的半微球阵列模板(其形貌可参照图3所示)。
(3)配置体积分数为2％的琼脂糖溶液；将所述半微球阵列模板放入12孔板中(以防后面琼脂糖溶液飞溅或流动)，在半微球阵列模板表面倒入2ml的琼脂糖溶液，然后室温静置直到琼脂糖冷却固化，然后小心分离琼脂糖和微球阵列，得到琼脂糖半球微阵列。
实施列3
一种用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底的制备方法，包括如下步骤(可参照图1所示)：
(1)在玻璃表面紧贴上一层双面胶，利用双面胶将筛孔大小为50目的不锈钢筛网粘在表面，得到双面胶-玻璃-不锈钢筛网的夹层结构，然后在不锈钢筛网上倒入过量的350μm不锈钢微球，通过刮擦的方式将单个钢珠捕获于单个筛网微孔内，每个筛孔中均固定一个钢珠，按压，使钢珠被双面胶黏贴，然后揭下不锈钢筛网得到了带有微球阵列的平面(其正面为排列整齐的微球阵列)。
(2)准备一块洁净的玻璃基片(厚度为30mm)，在1500rpm转速下利用匀胶机在其上涂覆一层紫外胶，然后将得到的微球阵列按压覆在紫外胶上，然后置于紫外灯下照射15min固化，紫外胶固化后用镊子将两块玻璃分开，取带有紫外胶的玻璃，得到排列规整的半微球阵列模板(其形貌可参照图7所示)。
(3)配置体积分数为4％的琼脂糖溶液。将所述半微球阵列模板放入12孔板中(以防后面琼脂糖溶液飞溅或流动)，在半半微球阵列模板表面倒入2ml的琼脂糖溶液，然后室温静置直到琼脂糖冷却固化，然后小心分离琼脂糖和微球阵列，得到用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底(琼脂糖半球微阵列)。
实施例4
一种用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底的制备方法，包括如下步骤(可参照图1所示)：
(1)在玻璃表面紧贴上一层双面胶，利用双面胶将筛孔大小为50目的不锈钢筛网粘在表面，得到双面胶-玻璃-不锈钢筛网的夹层结构，然后在不锈钢筛网上倒入过量的300μm不锈钢微球，通过刮擦的方式将单个钢珠捕获于单个筛网微孔内，每个筛孔中均固定一个钢珠，按压，使钢珠被双面胶黏贴，然后揭下不锈钢筛网得到了带有微球阵列的平面(其正面为排列整齐的微球阵列)。
(2)准备一块洁净的玻璃基片(厚度为20mm)，在2000rpm转速下利用匀胶机在其上涂覆一层紫外胶，然后将微球阵列按压覆在紫外胶上，然后置于紫外灯下照射30min进行固化，紫外胶固化后用镊子将两块玻璃分开，取带有紫外胶的玻璃，得到排列规整的半微球阵列模板。
(3)配置体积分数为5％的琼脂糖溶液；将所述半微球阵列模板放入12孔板中(以防后面琼脂糖溶液飞溅或流动)，在半微球阵列模板表面倒入2ml的琼脂糖溶液，然后室温静置直到琼脂糖冷却固化，然后分离琼脂糖和微球阵列，得到所述用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底(琼脂糖半球微阵列)。
对比例1
配置体积分数为5％的琼脂糖溶液，将所述琼脂糖溶液倒入12孔板中，室温静置直到琼脂糖冷却固化，得到无半球微孔阵列的基底。
效果验证
将实施例1、实施例2、实施例3制备的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底，对比例1制备的无半球微孔阵列的基底分别用打孔器制成1直径为10mm的圆片。将上述圆片分别进行灭菌消毒。
分组：将实施例1的圆片编号为实施例1组，将实施例2的圆片编号为实施例2组，将实施例3的圆片编号为实施例3组，将对比例1的圆片编号为对比例1组；
接着分别将实施例1的圆片、实施例2的圆片、实施例3的圆片、对比例1的圆片分别放入48孔板中，每种圆片分别添加3个孔；然后在实施例1组的3个孔中分别加入含1×105个的真皮毛乳头细胞的细胞悬液、含2×105个的真皮毛乳头细胞的细胞悬液、含8×104个的真皮毛乳头细胞的细胞悬液，每个孔加入的真皮毛乳头细胞悬液的体积均为200μl；实施例2组、实施例3组、对比例1组的孔也像实施例1组这样加入真皮毛乳头细胞悬液。
将实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组放入细胞培养箱中进行孵育，孵育的时间为24h，孵育的温度为37℃。
在显微镜下观察结果。
图4为利用本发明实施例的半球微孔阵列基底制备的真皮毛乳头细胞聚集体阵列形貌图，细胞数为8*104。图5为利用本发明实施例的半球微孔阵列基底制备的真皮毛乳头细胞聚集体阵列形貌图，细胞数为1*105。图6为利用本发明实施例的半球微孔阵列基底制备的真皮毛乳头细胞聚集体阵列形貌图，细胞数为2*105。
结果如图4、图5及图6所示，实施例提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底在孵育以后，均形成了真皮毛乳头细胞聚集体阵列，而且低密度的细胞悬浮液也能在其表面聚集，被实施例提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底所捕获，形成细胞聚集体(捕获原理可参照图2a所示，图2a的上半部分是本发明实施例提供的产品捕获细胞的原理示意图，图2a的小半部分是对比例1提供的产品无法捕获细胞的原理示意图)。
参照图2b所示，对比例1提供的无半球微孔阵列的基底，无法像实施例提供的基底那样捕获细胞，形成细胞聚集体，在经过24h的孵育后，细胞无规则地分散在对比例1提供的基底上。图2b的左半部分是对比例1提供的无半球微孔阵列的基底在进行细胞孵育后的形貌图，图2b的右半部分是本发明实施例提供的基底在进行细胞孵育后的形貌图。
实施例4制备的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底在经过细胞孵育后，也可以能聚集细胞，形成细胞聚集体，可参照图4-图6所示。
综上所述，本发明实施例提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底，只需要借助双面胶、筛网和一定直径的小钢球即可制备得到，制备方法简单；本发明实施例提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底，可以让低密度8w左右的细胞在24h后聚集。本发明实施例提供的用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底是以琼脂糖凝胶为原料，该凝胶本身不具有细胞粘性，且表面具有规则的半球微孔阵结构，可将细胞捕获在微孔结构中，增强细胞间碰撞便于聚集体形成，同时该基底形状大小可控，可与各种培养皿适配，可用于快速大规模制备尺寸均一的细胞聚集体。本发明中的半球微孔阵结构不需要采取光刻方式，只需要利用琼脂糖翻模即可得到，重现性、稳定性高。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
