本发明属于药用植物快速繁殖培养
技术领域：
，具体涉及一种魔芋试管芋的快速繁殖方法。
背景技术：
：魔芋又称蒟蒻，天南星科(araceae)魔芋属(amorphophallusblume)多年生宿根草本植物。其经济器官是地下球茎，球茎中主要含葡甘露聚糖(kgm)、淀粉、生物碱、维生素、矿物质，此外还含有少量蛋白质、多种氨基酸、神经酰胺、黄酮类化合物等营养物质。魔芋具有多种药理作用，主要可概括为减肥瘦身、降脂、降血糖、抗癌、抗衰老、改善肠道微环境，已被联合国卫生组织列为十大保健食品之一。并且魔芋是自然界中唯一能大量提供kgm的主要经济作物，具有较高的医疗保健价值和经济价值，在绿色食品开发、医疗保健、疾病防治、以及建材化工等领域都具有良好的应用和开发前景。据统计，全世界每年魔芋精粉需求量超过10万吨。目前我国魔芋栽培面积约190万亩，加工企业130多个，年产魔芋精粉、微粉25000吨。传统的魔芋种植方法会受到季节和外界环境条件的限制，存在繁殖速度慢、生长周期长等问题，且随着种植年限的延长，出现品种退化、软腐病危害和连坐障碍危害加剧等问题，导致魔芋种植面积锐减和种质质量下降，魔芋精粉产量供不应求，因此魔芋产业急需良种选育。而常规魔芋种植生产周期长、制种量小，不能满足生产需要。为此，能够提供一种操作简单、周期短和成活率高的魔芋快速繁殖方法是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，本方法将植物组织培养技术与魔芋试管芋制备技术相结合，利用魔芋微球茎分化不定根，并进一步诱导魔芋试管芋，摆脱了魔芋传统种植中软腐病、品种退化等问题，可以在短时间内获得大量脱毒效果良好的试管芋，生产效率高，质量好，可以满足市场需求，具有重大的推广价值。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织的制备：将魔芋切块、洗净、消毒和培养后，获得外植体，将所述外植体转接至分化培养基中，得到魔芋胚性愈伤组织；(2)魔芋微球茎的制备：将所述魔芋胚性愈伤组织进行诱导、分割和增殖后，即得魔芋微球茎；(3)试管芋的制备：将所述魔芋微球茎进行不定根分化和剪切后，转接至培养基上培养，即得一种魔芋试管芋。优选地，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织的制备：1)无菌体系的建立：将魔芋切块、洗净和消毒后，转接至芽分化培养基，培养获得芽苗；2)外植体的制备：对所述芽苗进行剪切，获得外植体；3)愈伤组织的诱导：将所述外植体转接至第一诱导培养基，在黑暗条件下25-30℃下诱导，即得魔芋胚性愈伤组织；(2)魔芋微球茎的制备：：魔芋微球茎的诱导：将所述魔芋胚性愈伤组织转接至第二诱导培养基，在黑暗条件下25-30℃下诱导，即得魔芋微球茎；(3)试管芋的制备：1)魔芋微球茎的增殖：将所述魔芋微球茎切割，转接至增殖培养基中，在黑暗条件下25-30℃下培养；2)不定根分化：将所述步骤1)增殖后的魔芋微球茎经赤霉素浸泡0.5-1h后，转接至根分化培养基，在黑暗条件下25-30℃下培养，即得分化的魔芋微球茎；3)将所述分化的魔芋微球茎转接至第三诱导培养基，在1000lx的绿色散射光25-30℃条件下培养10-14d后，再转接至生根培养基中，即得一种魔芋试管芋。本方法将植物组织培养技术与魔芋试管芋制备技术相结合，利用魔芋微球茎分化不定根，并进一步诱导魔芋试管芋，摆脱了魔芋传统种植中软腐病、品种退化等问题，可以在短时间内获得大量脱毒效果良好的试管芋，生产效率高，质量好。优选地，步骤(1)所述芽分化培养基为ms 6-ba1.0-2.0mg/l naa0.1-0.5mg/l 3％蔗糖的固体培养基。本发明采用培养基中6-ba、naa两种激素的比例较高，不定芽分化率及成苗率达100％；且在魔芋无菌苗生长过程中，外层苞片质地较厚，且易发生展开现象，利于后续实验过程苞片外植体的取材及提高苞片外植体对胚性愈伤组织的诱导率；此外，6-ba激素比例超过2mg/l或低于1.0mg/l，会降低不定芽成苗率、延长成苗时间、或产生簇芽但不能成苗现象。优选地，步骤(1)所述外植体为叶片、叶柄或苞片的外植体；其中，所述叶片外植体选用魔芋发芽7-10d的芽苗，所述叶柄外植体选用魔芋发芽15-20d的芽苗，所述苞片外植体选用魔芋发芽10-15d的芽苗。本发明利用叶片、叶柄、苞片为外植体诱导魔芋胚性愈伤组织，并对三种外植体诱导胚性愈伤组织进行优化，选择其各自对应的最优方式，例如叶片诱导胚性愈伤组织时选择稍带叶柄的叶片，正面水平接种在诱导胚性愈伤组织培养基中，此种方式较常规仅用叶片诱导胚性愈伤组织方法，其叶片依靠叶柄吸收营养与水分，活力保持持久，脱分化能力更强，胚性愈伤组织诱导率可提高近30％；叶柄选取魔芋植株发芽15-20d后的叶柄，直径约1.0mm左右，此极端叶柄活力强切木质化水平低，脱分化能力强，其较其它时期叶柄诱导胚性愈伤组织，诱导率可提高50％，用剪刀将叶柄倾斜45°角剪成1cm左右的小段，此种方式可以叶柄与培养基的接触面积，诱导率较竖直剪段可增加10％；苞片要选取魔芋植株发芽后10-15d后的苞片，将其剪成1.0×1.0cm左右小块，此阶段魔芋苞片颜色呈微粉红色，质地较嫩，活力较强，较其它时期苞片诱导胚性愈伤组织可提高30％。优选地，所述叶片外植体的第一诱导培养基为ms 6-ba1.0-2.0mg/l naa0.1-0.5mg/l 3％蔗糖的固体培养基；所述叶柄外植体的第一诱导培养基为ms 6-ba0.5-1.0mg/l naa0.5-1.0mg/l 2,4-d1.0-2.0mg/l 3％蔗糖的固体培养基；所述苞片外植体的第一诱导培养基为ms 6-ba0.5-1.0mg/l naa0.1-0.5mg/l 2,4-d0.5-1.0mg/l 3％蔗糖的固体培养基。本发明所用第一诱导培养基，其激素组成为6-ba、naa和2,4-d，本领域技术人员公知，在此阶段中，存在三种类型魔芋胚性愈伤组织，从三种外植体诱导形成的魔芋胚性愈伤组织中，本发明通过挑选出结构紧密，颜色呈粉红色或黄绿色，外观为小瘤状的ⅲ型魔芋胚性愈伤组织，其增殖能力与分化能力均最强，同时本发明通过优化此三种激素配比，可提高ⅲ型魔芋胚性愈伤组织诱导率，在此激素配比中另外添加植物组织培养关于愈伤组织诱导中常用的激素zt、kt、aba等，若在合理水平内，胚性愈伤组织诱导率无明显提高，若超出合理性水平则会降低诱导率，在三种类型魔芋胚性愈伤组织中，ⅲ型魔芋胚性愈伤组织占比可达80％。优选地，步骤(2)中所述第二诱导培养基为ms iba0.1-0.5mg/l naa0.1-0.5mg/l 5％蔗糖 0.3％活性炭的固体培养基。本发明中第二诱导培养基使用iba、naa激素，并优化其配比，采用本发明所述培养基诱导出微球茎，在后续不定根分化过程中，可以减缓微球茎对iba、naa激素的适应期，缩短不定根分化时间，较常规微球茎根分化时间可提前7-10d；同时本发明中魔芋微球茎由ⅲ型魔芋胚性愈伤组织诱导所得，诱导率可实现100％，且所得微球茎分化能力强，易于进行后续不定根分化及试管芋诱导，对比其它类型愈伤组织诱导所得微球茎，其试管芋诱导率可提高30％。优选地，步骤(2)中所述赤霉素的浓度为1-5mol/l。本发明采用先将微球茎用1mol/l无菌赤霉素浸泡30min-1h，可以打破微球茎休眠期，快速进入下一个阶段。优选地，步骤(2)中所述根分化培养基为ms iba1.0-3.0mg/l iaa0.05-0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基。采用本发明培养基的魔芋微球茎不定根分化率可达100％，根密度较大且外观粗壮；iba激素在低于1.0mg/l或高于3.0mg/l时，不定根分化密度降低，且根直径减小，不利于后期实验过程试管芋的诱导。优选地，步骤(3)中所述第三诱导培养基为ms iba3.0-5.0mg/l iaa0.5-1.0mg/l 5％蔗糖 3％活性炭的固体培养基。根状茎膨大期，是由魔芋内源激素iba主导，iaa激素水平稍许变化，所以本发明试管芋第三诱导培养基上述培养基，诱导率可达到70％-90％，且在前期微球茎诱导、不定根分化过程中，同样采用iba、iaa激素，可以减短适应期。优选地，步骤(3)中所述生根培养基为ms iba0.5-1.0mg/l iaa0.1-0.5mg/l 5％蔗糖 3％活性炭的固体培养基。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1)本发明获得的试管芋，是良好的脱毒种子，可以用于魔芋种植业作原原种，提高魔芋生产质量；此外可以直接用于魔芋加工业，满足魔芋精粉需求。2)本发明将植物组织培养技术与魔芋试管芋制备技术相结合，利用魔芋微球茎分化不定根，并进一步诱导魔芋试管芋，摆脱了魔芋传统种植中软腐病、品种退化等问题，可以在短时间内获得大量脱毒效果良好的试管芋，生产效率高，质量好，可以满足市场需求，具有重大的推广价值。3)本发明实验操作简单且周期短，魔芋试管芋收获方便；常规魔芋种植，从块茎播种-苗-魔芋收获，需要近7个月，且需要追肥、除草、灌溉等操作，耗费人力物力；相关魔芋试管芋研究，外植体-愈伤组织-试管苗-生根、倒苗-试管芋，需要近3个月，且由于实验条件限制，每棵试管苗最多可产试管芋3-8个；本发明中外植体-胚性愈伤组织-微球茎-生根-试管芋，周期为近2个月，且每个微球茎根分化数量多，每个微球茎可产试管芋10-20个；此外本发明试管芋收获时，仅需将试管芋从根段剪切即可，所留稍带不定根微球茎还可进行后续试管苗研究。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1培养组织图；图2为本发明实施例2培养组织图；图3为本发明实施例3培养组织图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织诱导：1)魔芋无菌体系建立：先将魔芋切块在自来水下冲洗1h，再用无菌水浸泡30min，在无菌操作台中经75％的酒精消毒20s，再用naclo溶液消毒15min，再用无菌水冲洗三遍，后将无菌的魔芋切块芽点朝上转接至芽分化培养基中，其中芽分化培养基为ms 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基；2)魔芋外植体获取：叶片要选取魔芋植株发芽20d的叶片，其叶片质地厚、活力强，在无菌操作台中取魔芋无菌苗，用剪刀将叶片周边剪去，但保留少许叶柄；3)魔芋胚性愈伤组织诱导：在无菌操作台中，将带有少许叶柄、剪去周边的叶片转接至ms 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基中，将叶片外植体叶柄朝下竖直插入培养基中，保证叶片与培养基表面接触，黑暗条件25℃下诱导28d，即得魔芋胚性愈伤组织；从叶片外植体诱导形成的魔芋胚性愈伤组织中，挑选出结构紧密，颜色呈粉红色或黄绿色，外观为小瘤状的ⅲ型魔芋胚性愈伤组织，其增殖能力与分化能力均最强；(2)魔芋微球茎的制备：魔芋微球茎诱导：在无菌操作台中，将所得ⅲ型魔芋胚性愈伤组织转接至ms 0.5mg/liba 0.1mg/lnaa 5％蔗糖 0.3％活性炭固体培养基，黑暗条件下25℃诱导25d，即得魔芋微球茎；(3)试管芋的制备：1)魔芋微球茎分割：在无菌操作台中，将魔芋微球茎用镊子和切片刀平均切割成0.5g左右块状；2)魔芋微球茎增殖：在无菌操作台中，将微球茎块转接至ms 0.5mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖液体培养基，黑暗条件25℃下培养15d，进行魔芋微球茎增殖培养，获得大量魔芋微球茎，增殖培养3个周期后进行不定根分化；3)不定根分化：在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的有机膜将1mol/l赤霉素溶液除菌过滤，然后将3)增殖的微球茎在其浸泡30min，打破魔芋微球茎休眠期；后将已打破休眠期的微球茎转接至ms iba1.0mg/l iaa0.05mg/l 3％蔗糖固体培养基，黑暗条件25℃下诱导25d，进行不定根分化；然后在无菌操作台中，用剪刀将微球茎分化的弦状不定根剪去1/3，根状茎全部保留，剪去1/3弦状不定根，可以保证微球茎可以持续吸收培养基养分与水分的同时，又能造成代谢物质积累通路的堵塞，使分化出的根状茎顶端短时期内膨大形成试管芋；4)将分化的微球茎转接至ms iba3.0mg/l iaa0.5mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，在1000lx的绿色散射光25℃条件下培养，此阶段为根状茎的顶端膨大时期；培养14d后，将所得的成熟期的微球茎转接至ms iba0.5mg/l iaa0.1mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，培养即得到魔芋试管芋；其中，如图1，依次为叶片外植体、胚性愈伤组织、微球茎、不定根分化、试管芋的组织图。实施例2一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织诱导：1)魔芋无菌体系建立：先将魔芋切块在自来水下冲洗1h，再用无菌水浸泡30min，在无菌操作台中经75％的酒精消毒20s，再用naclo溶液消毒15min，再用无菌水冲洗三遍，后将无菌的魔芋切块芽点朝上转接至芽分化培养基中，其中芽分化培养基为ms 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基；2)魔芋外植体获取：叶柄要选取魔芋植株发芽30d的叶柄，直径约1.0mm左右，在无菌操作台中取材魔芋无菌苗，用剪刀将叶柄倾斜45°角剪成1cm左右的小段；3)魔芋胚性愈伤组织诱导：在无菌操作台中，将叶柄外植体水平放入培养基表面，培养基为ms 6-ba1.0mg/l naa1.0mg/l 2,4-d2.0mg/l 3％蔗糖固体培养基，黑暗条件25℃下诱导28d，即得魔芋胚性愈伤组织；从叶柄外植体诱导形成的魔芋胚性愈伤组织中，挑选出结构紧密，颜色呈粉红色或黄绿色，外观为小瘤状的ⅲ型魔芋胚性愈伤组织，其增殖能力与分化能力均最强；(2)魔芋微球茎的制备：魔芋微球茎诱导：在无菌操作台中，将所得ⅲ型魔芋胚性愈伤组织转接至ms 0.2mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖 0.3％活性炭固体培养基，黑暗条件下25℃诱导25d，即得魔芋微球茎；(3)试管芋的制备：1)魔芋微球茎分割：在无菌操作台中，将魔芋微球茎用镊子和切片刀平均切割成0.5g左右块状；2)魔芋微球茎增殖：在无菌操作台中，将微球茎块转接至ms 0.5mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖液体培养基，黑暗条件25℃下培养15d，进行魔芋微球茎增殖培养，获得大量魔芋微球茎，增殖培养2个周期后进行不定根分化；3)不定根分化：在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的有机膜将1mol/l赤霉素溶液除菌过滤，然后将3)增殖的微球茎在其浸泡40min，打破魔芋微球茎休眠期；后将已打破休眠期的微球茎转接至ms iba1.0mg/l iaa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基，黑暗条件25℃下诱导25d，进行不定根分化；在无菌操作台中，用剪刀将微球茎分化的弦状不定根剪去1/3，根状茎全部保留，剪去1/3弦状不定根，可以保证微球茎可以持续吸收培养基养分与水分的同时，又能造成代谢物质积累通路的堵塞，使分化出的根状茎顶端短时期内膨大形成试管芋；4)将分化的微球茎转接至ms iba4.0mg/l iaa0.5mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，在1000lx的绿色散射光25℃条件下培养，此阶段为根状茎的顶端膨大时期；培养14d后，将所得的成熟期的微球茎转接至ms iba1.0mg/l iaa0.5mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，培养即得到魔芋试管芋，其中，如图2，依次为叶柄外植体、胚性愈伤组织、微球茎、不定根分化、试管芋的组织图。实施例3一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织诱导：1)魔芋无菌体系建立：先将魔芋切块在自来水下冲洗1h，再用无菌水浸泡30min，在无菌操作台中经75％的酒精消毒20s，再用naclo溶液消毒15min，再用无菌水冲洗三遍，后将无菌的魔芋切块芽点朝上转接至芽分化培养基中，其中芽分化培养基为ms 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基；2)魔芋外植体获取：苞片要选取魔芋植株发芽后15d后的苞片，在无菌操作台中，取材魔芋无菌苗，用剪刀将其剪成1.0×1.0cm左右小块；3)魔芋胚性愈伤组织诱导：在无菌操作台中，在无菌操作台中，将苞片外植体水平放入培养基表面，ms 6-ba0.2mg/l naa0.5mg/l 2,4-d1.0mg/l 3％蔗糖固体培养基中，黑暗条件25℃下诱导28d，即得魔芋胚性愈伤组织；从苞片外植体诱导形成的魔芋胚性愈伤组织中，挑选出结构紧密，颜色呈粉红色或黄绿色，外观为小瘤状的ⅲ型魔芋胚性愈伤组织，其增殖能力与分化能力均最强；(2)魔芋微球茎的制备：魔芋微球茎诱导：在无菌操作台中，将所得ⅲ型魔芋胚性愈伤组织转接至ms 0.5mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖 0.3％活性炭固体培养基，黑暗条件下25℃诱导25d，即得魔芋微球茎；(3)试管芋的制备：1)魔芋微球茎分割：在无菌操作台中，将魔芋微球茎用镊子和切片刀平均切割成0.5g左右块状；2)魔芋微球茎增殖：在无菌操作台中，将微球茎块转接至ms 0.5mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖液体培养基，黑暗条件25℃下培养15d，进行魔芋微球茎增殖培养，获得大量魔芋微球茎，增殖培养2个周期后进行不定根分化；3)不定根分化：在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的有机膜将1mol/l赤霉素溶液除菌过滤，然后将3)增殖的微球茎在其浸泡50min，打破魔芋微球茎休眠期；后将已打破休眠期的微球茎转接至ms iba2.0mg/l iaa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基，黑暗条件25℃下诱导25d，进行不定根分化；在无菌操作台中，用剪刀将微球茎分化的弦状不定根剪去1/3，根状茎全部保留，剪去1/3弦状不定根，可以保证微球茎可以持续吸收培养基养分与水分的同时，又能造成代谢物质积累通路的堵塞，使分化出的根状茎顶端短时期内膨大形成试管芋；4)将分化的微球茎转接至ms iba5.0mg/l iaa0.5mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，在1000lx的绿色散射光25℃条件下培养，此阶段为根状茎的顶端膨大时期；培养14d后，将所得的成熟期的微球茎转接至ms iba1.0mg/l iaa0.3mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，培养即得到魔芋试管芋，其中，如图3，依次为苞片外植体、胚性愈伤组织、微球茎、不定根分化、试管芋的组织图。实施例4一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织诱导：1)魔芋无菌体系建立：先将魔芋切块在自来水下冲洗1h，再用无菌水浸泡30min，在无菌操作台中经75％的酒精消毒20s，再用naclo溶液消毒15min，再用无菌水冲洗三遍，后将无菌的魔芋切块芽点朝上转接至芽分化培养基中，其中芽分化培养基为ms 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基；2)魔芋外植体获取：叶片要选取魔芋植株发芽20d的叶片，其叶片质地厚、活力强，在无菌操作台中取魔芋无菌苗，用剪刀将叶片周边剪去，但保留少许叶柄；3)魔芋胚性愈伤组织诱导：在无菌操作台中，将带有少许叶柄、剪去周边的叶片转接至ms 6-ba1.5mg/l naa0.2mg/l 3％蔗糖固体培养基中，将叶片外植体叶柄朝下竖直插入培养基中，保证叶片与培养基表面接触，黑暗条件25℃下诱导28d，即得魔芋胚性愈伤组织；从叶片外植体诱导形成的魔芋胚性愈伤组织中，挑选出结构紧密，颜色呈粉红色或黄绿色，外观为小瘤状的ⅲ型魔芋胚性愈伤组织，其增殖能力与分化能力均最强；(2)魔芋微球茎的制备：魔芋微球茎诱导：在无菌操作台中，将所得ⅲ型魔芋胚性愈伤组织转接至ms 0.5mg/liba 0.4mg/lnaa 5％蔗糖 0.3％活性炭固体培养基，黑暗条件下25℃诱导25d，即得魔芋微球茎；(3)试管芋的制备：1)魔芋微球茎分割：在无菌操作台中，将魔芋微球茎用镊子和切片刀平均切割成0.5g左右块状；2)魔芋微球茎增殖：在无菌操作台中，将微球茎块转接至ms 0.5mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖液体培养基，黑暗条件25℃下培养15d，进行魔芋微球茎增殖培养，获得大量魔芋微球茎，增殖培养2个周期后进行不定根分化；3)不定根分化：在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的有机膜将1mol/l赤霉素溶液除菌过滤，然后将3)增殖的微球茎在其浸泡50min，打破魔芋微球茎休眠期；后将已打破休眠期的微球茎转接至ms iba2.0mg/l iaa0.08mg/l 3％蔗糖固体培养基，黑暗条件25℃下诱导25d，进行不定根分化；在无菌操作台中，用剪刀将微球茎分化的弦状不定根剪去1/3，根状茎全部保留，剪去1/3弦状不定根，可以保证微球茎可以持续吸收培养基养分与水分的同时，又能造成代谢物质积累通路的堵塞，使分化出的根状茎顶端短时期内膨大形成试管芋；4)将分化的微球茎转接至ms iba5.0mg/l iaa0.6mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，在1000lx的绿色散射光25℃条件下培养，此阶段为根状茎的顶端膨大时期；培养14d后，将所得的成熟期的微球茎转接至ms iba1.0mg/l iaa0.4mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，实施例5一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织诱导：1)魔芋无菌体系建立：先将魔芋切块在自来水下冲洗1h，再用无菌水浸泡30min，在无菌操作台中经75％的酒精消毒20s，再用naclo溶液消毒15min，再用无菌水冲洗三遍，后将无菌的魔芋切块芽点朝上转接至芽分化培养基中，其中芽分化培养基为ms 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基；2)魔芋外植体获取：苞片要选取魔芋植株发芽后15d后的苞片，在无菌操作台中，取材魔芋无菌苗，用剪刀将其剪成1.0×1.0cm左右小块；3)魔芋胚性愈伤组织诱导：在无菌操作台中，在无菌操作台中，将苞片外植体水平放入培养基表面，ms 6-ba0.8mg/l naa0.2mg/l 2,4-d1.0mg/l 3％蔗糖固体培养基中，黑暗条件25℃下诱导28d，即得魔芋胚性愈伤组织；从苞片外植体诱导形成的魔芋胚性愈伤组织中，挑选出结构紧密，颜色呈粉红色或黄绿色，外观为小瘤状的ⅲ型魔芋胚性愈伤组织，其增殖能力与分化能力均最强；(2)魔芋微球茎的制备：魔芋微球茎诱导：在无菌操作台中，将所得ⅲ型魔芋胚性愈伤组织转接至ms 0.5mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖 0.3％活性炭固体培养基，黑暗条件下25℃诱导25d，即得魔芋微球茎；(3)试管芋的制备：1)魔芋微球茎分割：在无菌操作台中，将魔芋微球茎用镊子和切片刀平均切割成0.5g左右块状；2)魔芋微球茎增殖：在无菌操作台中，将微球茎块转接至ms 0.5mg/liba 0.5mg/lnaa 5％蔗糖液体培养基，黑暗条件25℃下培养15d，进行魔芋微球茎增殖培养，获得大量魔芋微球茎，增殖培养2个周期后进行不定根分化；3)不定根分化：在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的有机膜将1mol/l赤霉素溶液除菌过滤，然后将3)增殖的微球茎在其浸泡50min，打破魔芋微球茎休眠期；后将已打破休眠期的微球茎转接至ms iba3.0mg/l iaa0.05mg/l 3％蔗糖固体培养基，黑暗条件25℃下诱导25d，进行不定根分化；在无菌操作台中，用剪刀将微球茎分化的弦状不定根剪去1/3，根状茎全部保留，剪去1/3弦状不定根，可以保证微球茎可以持续吸收培养基养分与水分的同时，又能造成代谢物质积累通路的堵塞，使分化出的根状茎顶端短时期内膨大形成试管芋；4)将分化的微球茎转接至ms iba4.0mg/l iaa0.8mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，在1000lx的绿色散射光25℃条件下培养，此阶段为根状茎的顶端膨大时期；培养14d后，将所得的成熟期的微球茎转接至ms iba0.6mg/l iaa0.3mg/l 5％蔗糖 3％活性炭固体培养基，培养即得到魔芋试管芋。应用例将实施例1-5微球茎诱导、不定根分化、试管芋诱导结果进行统计，得到的结果如下，见表1：表1实施例1-5统计结果表实施案例微球茎诱导率不定根分化率试管芋诱导率实施例1100％100％85％实施例2100％100％73％实施例3100％100％86％实施例4100％100％80％实施例5100％100％82％通过表1数据可知，本发明微球茎诱导率、不定根分化率和试管芋诱导率均可达到较高水平，显著优于现有技术，具有显著的进步。各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)魔芋胚性愈伤组织的制备：将魔芋切块、洗净、消毒和培养后，获得外植体，将所述外植体转接至分化培养基中，得到魔芋胚性愈伤组织；
(2)魔芋微球茎的制备：将所述魔芋胚性愈伤组织进行诱导、分割和增殖后，即得魔芋微球茎；
(3)试管芋的制备：将所述魔芋微球茎进行不定根分化和剪切后，转接至培养基上培养，即得一种魔芋试管芋。
2.根据权利要求1所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)魔芋胚性愈伤组织的制备：
1)无菌体系的建立：将魔芋切块、洗净和消毒后，转接至芽分化培养基，培养获得芽苗；
2)外植体的制备：对所述芽苗进行剪切，获得外植体；
3)愈伤组织的诱导：将所述外植体转接至第一诱导培养基，在黑暗条件下25-30℃下诱导，即得魔芋胚性愈伤组织；
(2)魔芋微球茎的制备：魔芋微球茎的诱导：将所述魔芋胚性愈伤组织转接至第二诱导培养基，在黑暗条件下25-30℃下诱导，即得魔芋微球茎；
(3)试管芋的制备：
1)魔芋微球茎的增殖：将所述魔芋微球茎切割，转接至增殖培养基中，在黑暗条件下25-30℃下培养；
2)不定根分化：将所述步骤1)增殖后的魔芋微球茎经赤霉素浸泡0.5-1h后，转接至根分化培养基，在黑暗条件下25-30℃下培养，即得分化的魔芋微球茎；
3)将所述分化的魔芋微球茎转接至第三诱导培养基，在1000lx的绿色散射光25-30℃条件下培养10-14d后，再转接至生根培养基中，即得一种魔芋试管芋。
3.根据权利要求2所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(1)所述芽分化培养基为ms 6-ba1.0-2.0mg/l naa0.1-0.5mg/l 3％蔗糖的固体培养基。
4.根据权利要求2所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(1)所述外植体为叶片、叶柄或苞片的外植体；其中，所述叶片外植体选用魔芋发芽7-10d的芽苗，所述叶柄外植体选用魔芋发芽15-20d的芽苗，所述苞片外植体选用魔芋发芽10-15d的芽苗。
5.根据权利要求4所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，所述叶片外植体的第一诱导培养基为ms 6-ba1.0-2.0mg/l naa0.1-0.5mg/l 3％蔗糖的固体培养基；所述叶柄外植体的第一诱导培养基为ms 6-ba0.5-1.0mg/l naa0.5-1.0mg/l 2,4-d1.0-2.0mg/l 3％蔗糖的固体培养基；所述苞片外植体的第一诱导培养基为ms 6-ba0.5-1.0mg/l naa0.1-0.5mg/l 2,4-d0.5-1.0mg/l 3％蔗糖的固体培养基。
6.根据权利要求2所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)中所述第二诱导培养基为ms iba0.1-0.5mg/l naa0.1-0.5mg/l 5％蔗糖 0.3％活性炭的固体培养基。
7.根据权利要求2所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)中所述赤霉素的浓度为1-5mol/l。
8.根据权利要求2所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)中所述根分化培养基为ms iba1.0-3.0mg/l iaa0.05-0.1mg/l 3％蔗糖固体培养基。
9.根据权利要求2所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(3)中所述第三诱导培养基为ms iba3.0-5.0mg/l iaa0.5-1.0mg/l 5％蔗糖 3％活性炭的固体培养基。
10.根据权利要求2所述的一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(3)中所述生根培养基为ms iba0.5-1.0mg/l iaa0.1-0.5mg/l 5％蔗糖 3％活性炭的固体培养基。
技术总结一种魔芋试管芋的快速繁殖方法，包括以下具体步骤：(1)魔芋胚性愈伤组织的制备；(2)魔芋微球茎的制备；(3)试管芋的制备。本发明将植物组织培养技术与魔芋试管芋制备技术相结合，利用魔芋微球茎分化不定根，并进一步诱导魔芋试管芋，摆脱了魔芋传统种植中软腐病、品种退化等问题，可以在短时间内获得大量脱毒效果良好的试管芋，生产效率高，质量好，可以满足市场需求，具有重大的推广价值。
技术研发人员：张宗申;金瑞;李丹丹
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：2021.05.26
技术公布日：2021.08.03
