本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于复合纳米酶材料可视化检测gpc3的方法。
背景技术：
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（gpc3）是近年来发现的一种新型肝癌标志物，常用的检测方法有：酶联免疫吸附测定法（elisa），电化学免疫分析法，荧光检测法和免疫组织化学法等方法。公开号cn112014577a的发明专利，涉及一种磁珠微粒偶联鼠抗人gpc3单克隆抗体与碱性磷酸酶标记兔抗人gpc3多克隆抗体检测gpc3的试剂盒，该方法的操作过程比较复杂，试剂盒成本较高。公开号cn105759051b的发明专利，涉及一种以吖啶酯为发光标物的gpc3纳米磁微球化学发光免疫分析测定gpc3的试剂盒，该方法所用仪器昂贵，对操作技能有较高的要求。因此，需要建立一种快速、操作简便的gpc3检测方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于血红素-还原氧化石墨烯-铂@钯（h-rgo-pt@pdnps）纳米酶构建检测体系，采用分光光度法可视化检测gpc3的方法。
为了解决该技术问题，采用一步还原法制备h-rgo-pt@pdnps纳米酶，利用纳米酶与gpc3适配体（gpc3-apt）的π-π共轭作用，形成h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针，以gpc3抗体（gpc3-ab）作为捕获探针，捕获gpc3蛋白，从而形成适配体-蛋白-抗体夹心型复合物。利用h-rgo-pt@pdnps的类过氧化物酶的催化性质，催化过氧化氢（h2o2）氧化显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）为tmbox，使得体系溶液由无色变成蓝色。随着gpc3浓度的增加，体系的蓝色会越来越深，从而实现gpc3的可视化检测。
本发明按照以下步骤进行：
步骤1：h-rgo-pt@pdnps纳米酶的制备
（1）还原性氧化石墨烯（rgo）的制备：
称取氧化石墨烯（go）置于超纯水中，破碎。加入抗坏血酸（aa），搅拌，得rgo溶液。
（2）血红素-还原氧化石墨烯（h-rgo）的制备：
称取血红素，用氨水和超纯水溶解，加入rgo溶液，再加入水合肼溶液，搅拌均匀后恒温水浴，离心洗涤，即得h-rgo纳米材料。
（2）h-rgo-pt@pdnps纳米酶的制备：
向h-rgo溶液中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵（pdda）溶液和氯化钠（nacl）溶液，搅拌混匀，离心洗涤得到pdda修饰的h-rgo溶液。将氯钯酸钠（na2ptcl6）和氯铂酸钠（na2pdcl4）溶液加入到pdda修饰的h-rgo溶液中，搅拌反应。向溶液中加入乙二醇溶液还原，用naoh溶液调节ph值，恒温水浴后，离心洗涤，即得h-rgo-pt@pdnps纳米酶。
步骤2：h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针的制备
取gpc3-apt与h-rgo-pt@pdnps溶液混匀孵育，离心洗涤，即得h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针。
步骤3：gpc3可视化检测体系的构建
将gpc3-ab滴加到试管内，加入bsa溶液对非特异性结合位点进行封闭，在封闭后的试管中加入不同浓度待检测的gpc3蛋白溶液，一段时间以后将h-rgo-pt@pdnps-apt加入试管中，在上述试管中加入显色底物体系tmb-h2o2，反应一段时间，形成gpc3可视化检测体系。对上述体系进行h-rgo-pt@pdnps-apt浓度、孵育温度、孵育时间、检测体系的ph值和离子强度等实验条件优化，获得最佳的gpc3可视化检测体系。
步骤4：gpc3的工作曲线绘制
在步骤3得到的最佳gpc3可视化检测体系中，获取不同浓度待检测的gpc3蛋白溶液的波长为500～800nm的紫外-可见吸收曲线，记录其最大吸收峰652nm处的吸光度。根据吸光度和gpc3蛋白浓度的关系，绘制工作曲线，计算检测限。
步骤5：实际血清样本中gpc3的检测
将已知浓度的gpc3蛋白和实际人血清样本混合，添加到根据步骤3得到的最佳gpc3可视化检测体系中，记录652nm处的吸光度值。采用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，记录其在652nm处的吸光度。利用步骤3所得到的gpc3工作曲线，计算得出实际能够检测的gpc3浓度。
其中，步骤1为gpc3的可视化检测提供一种具有高效类过氧化氢酶催化活性的纳米酶材料；步骤2为gpc3的可视化检测提供了一种能够特异性识别gpc3蛋白的检测探针。步骤3为gpc3的可视化测定提供了可行性条件。步骤4的gpc3的工作曲线为步骤5的实际血清样本中gpc3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-5相互支撑，共同作用，才能利用h-rgo-pt@pdnps纳米酶实现gpc3的可视化检测。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本专利形成的h-rgo-pt@pdnps纳米酶独特的网状结构以及较大的比表面积增强了对gpc3-apt的吸附效率，进一步增强了与gpc3的特异性结合，提高了对gpc3的检测效率。此外，rgo的高比表面积、hemin的过氧化物酶性质以及金属pt@pdnps的优异催化性能，三者的协同效应提高了h-rgo-pt@pdnps纳米酶的催化性能，使得检测更加灵敏，检测限可达1.801ng/ml。
、该体系采用以h-rgo-pt@pdnps-gpc3-apt为检测探针、gpc3-ab为捕获探针，利用gpc3-apt、gpc3-ab与靶标gpc3之间的较强亲和力，构建了适配体-靶标-抗体夹心型结构。该结构能够更加牢固的固定靶标分子，使得靶标分子不易于脱落，从而更加有利于靶标分子的检测。此外，利用该纳米酶所构建的检测体系不仅可以检测gpc3分子，而且可以通过改变抗体和适配体结构，用于检测如甲胎蛋白（afp）、癌胚抗原（cea）等其它靶标分子。
附图说明
图1基于h-rgo-pt@pdnps的可视化检测gpc3的原理图；
图2h-rgo（a）、h-rgo-pt@pdnps（b）的扫描电镜（sem）图；
图3h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针的紫外-可见吸收光谱（uv-vis）图；
图4不同浓度gpc3的工作曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于h-rgo-pt@pdnps纳米酶的可视化检测gpc3的方法，检测原理如图1所示。通过一步还原法制备具有类过氧化物酶催化活性的h-rgo-pt@pdnps纳米酶，利用纳米酶与gpc3适配体（gpc3-apt）的π-π共轭作用，形成h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针，并在试管中固定gpc3-ab作为捕获探针，当有目标靶标gpc3蛋白存在时，通过gpc3-apt、gpc3-ab分别与gpc3蛋白的特异性识别而结合，从而形成h-rgo-pt@pdnps-apt/gpc3/gpc3-ab夹心型复合物，该复合物催化h2o2氧化显色底物tmb，使得体系溶液由无色变成蓝色。随着gpc3浓度的增加，体系的蓝色会越来越深，从而实现gpc3的可视化检测。
具体实施步骤如下：
（1）血红素-还原性氧化石墨烯（h-rgo）纳米材料的制备
①称取30mg氧化石墨烯（go）置于烧杯中，加入30ml纯净水，使用上海比朗仪器公司生产的bilon92-iid型超声波细胞粉碎机对go进行超声破碎60min，使其充分溶解均匀，得到浓度为1.0mg/ml的go溶液。
②在溶解均匀的go溶液中加入30mg的抗坏血酸（aa），置于数显恒温磁力搅拌器上，室温条件下搅拌12h，即得还原性氧化石墨烯（rgo）溶液。
③称取30mg血红素（hemin），置于10μl氨水中溶解，然后加入30ml蒸馏水得hemin溶液，与rgo溶液按照1:1的体积比混合，混合后再向rgo和hemin混合液中加入8.0μl水合肼溶液，涡旋搅拌10min后，将混合液置于数显式电热恒温水浴锅中60oc水浴4h。
④将溶液置于湖南湘仪实验室仪器公司生产的tgl-20m型台式高速离心机以12000r/min的转速离心10min，去掉上清液，多次洗涤，即得血红素-还原性氧化石墨烯（h-rgo）溶液。将所得溶液烘干成固体，备用。
（2）h-rgo-pt@pdnps纳米酶的制备
①称取5.0mgh-rgo固体，加入蒸馏水定容至10ml，制备成0.5mg/ml的h-rgo溶液，再向溶液中加入2.0mlpdda溶液和5.0ml0.2mol/lnacl溶液，搅拌反应12h。以12000r/min转速离心10min，去掉上清液，洗涤3次以去除杂质，得到被pdda修饰的h-rgo溶液。将所得溶液烘干成固体，备用。
②称取5.0mg被pdda修饰的h-rgo固体，加入蒸馏水中定容至10ml，制备成0.5mg/ml的溶液，再向溶液中加入2.0ml20mmol/lna2ptcl6溶液和2.0ml20mmol/lna2pdcl4溶液，搅拌反应12h。
③向溶液中加入10ml乙二醇溶液作还原剂，用1.0mol/l的naoh溶液调节溶液ph到12.0，并置于水浴锅中以60oc水浴4h。
④将所得溶液置于湖南湘仪实验室仪器公司生产的tgl-20m型台式高速离心机中以12000r/min的转速离心10min，去掉上清液，多次洗涤去除杂质，即得具有类过氧化氢酶催化活性的h-rgo-pt@pdnps纳米酶。
采用日本日立公司生产的su8020扫描电镜（sem）对h-rgo-pt@pdnps纳米酶进行表征分析，如图2所示，图2(a)是h-rgo复合物的sem扫描图，其样貌如一层薄膜纱网状；图2(b)是h-rgo-pt@pdnps纳米酶的sem扫描图，从中可以清楚地看到h-rgo-pt@pdnps纳米酶的形貌，薄膜纱网状包裹着许多白色的细小颗粒，这些呈白色的颗粒状物质是尺寸在100nm左右的ptnps和pdnps，由此可知h-rgo-pt@pdnps纳米酶制备成功。
（3）h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针的制备
将5.0μmmol/l的gpc3-apt（3'-tatgagtcgggtaaccctggtgttaacgaacgttcacgggactcataaaaaaaa-5'-nh2）和1.0mg/ml的h-rgo-pt@pdnps纳米酶按照1:1的体积比超声混合，适配体上的-nh2和h-rgo-pt@pdnps上的-cooh形成酰胺键。此外，纳米酶与gpc3-apt有π-π共轭作用，从而将gpc3-apt吸附到h-rgo-pt@pdnps纳米酶表面形成h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针。
利用日本仪器有限公司的uh5300型紫外-可见分光光度计对h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针进行表征。如图3所示，gpc3-apt在260nm处有最大吸收。h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针在275.5nm有最大吸收，这是h-rgo-pt@pdnps与gpc3-apt有π-π共轭作用，吸收峰红移。这些结果表明gpc3-apt已经与h-rgo-pt@pdnps纳米酶稳定地结合形成h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针。
（4）gpc3可视化检测体系的构建
将100µl10μmgpc3-ab捕获探针滴加到空白试管中，37oc孵育2h；在包被捕获探针后的试管中分别加入100µl不同浓度的gpc3蛋白溶液（或血清），37oc孵育2h后洗涤；在上述加样的试管中加入100µl1%bsa封闭液，37oc孵育2h后洗涤。将100µlh-rgo-pt@pdnps-apt加入到封闭后的检测试管中，孵育后洗涤。最后在上述试管中加入100µl显色底物体系tmb-h2o2，反应一段时间，形成gpc3可视化检测体系。对检测体系中h-rgo-pt@pdnps-apt浓度、孵育时间、孵育温度、检测体系的ph值和离子强度等因素进行优化，获得该体系检测gpc3的最优条件。
（5）gpc3工作曲线的绘制
在最佳gpc3可视化检测体系中（h-rgo-pt@pdnps-apt浓度为5.0μg/ml，孵育时间为2h，孵育温度为37oc，离子强度为30mmol/l，ph值为4.5），采用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描，获取不同浓度的gpc3蛋白溶液的波长为500～800nm的紫外-可见吸收曲线（图4），其最大吸收峰在652nm处。随着gpc3蛋白浓度的增加，其652nm处吸光度随着增加。在10～300ng/ml的范围内，吸光度与gpc3浓度呈正相关关系，工作曲线方程为y=0.46284 0.00127x（y为652nm处的吸光度，x为gpc3浓度），r2=0.9922。通过公式clod=3sb/b计算检测限为1.801ng/ml。
（6）实际血清样本中gpc3的检测
将已知浓度为100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml的gpc3溶液和正常人血清样本按照1:1的体积比混合，在最佳gpc3可视化检测体系中，获得652nm处吸光度。对比gpc3工作曲线得出实际能够检测到的gpc3浓度，检测结果见表1。
表1实际血清样本中gpc3的检测结果
（注：实际人血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供）。
1.一种h-rgo-pt@pdnps纳米酶的制备方法，按以下步骤进行：
（1）h-rgo的制备
将rgo与hemin混合，水浴，离心、洗涤，得到h-rgo纳米复合材料；
其特征在于：还包括
（2）h-rgo-pt@pdnps纳米酶的制备
①往h-rgo溶液中加入pdda溶液和nacl溶液，搅拌反应；离心、洗涤，得到被pdda修饰的h-rgo复合纳米材料；
②将na2ptcl6和na2pdcl4溶液加入被pdda修饰的h-rgo复合纳米材料，搅拌反应；加入乙二醇溶液和naoh溶液调节ph值，恒温水浴；离心、洗涤，即得h-rgo-pt@pdnps纳米酶。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述rgo与hemin混合体积比为1:（1-4）。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述的用于h-rgo修饰的pdda为2.0ml0.2%，nacl为5.0ml0.2mol/l。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述的采用naoh调节的ph值为11-13。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述的na2ptcl6和na2pdcl4均为2.0ml20mmol/l。
6.基于权利要求1所得h-rgo-pt@pdnps纳米酶用于可视化检测gpc3的方法，其特征在于，采用如下步骤：
步骤1：h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针的制备
取gpc3-apt和h-rgo-pt@pdnps溶液超声混合，将混合液室温孵育，离心洗涤，得h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针；
步骤2：gpc3可视化检测体系的构建
将捕获探针gpc3-ab滴加到试管内，加入bsa溶液进行封闭，加入gpc3蛋白溶液；加入h-rgo-pt@pdnps-apt检测探针；再加入显色底物体系tmb-h2o2，形成gpc3可视化检测体系；
步骤3：gpc3的工作曲线绘制
将待测的不同浓度gpc3滴加到步骤2得到的最佳gpc3可视化检测体系中，采用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，记录其在652nm处的吸光度，根据吸光度和gpc3蛋白浓度的关系，绘制工作曲线，计算检测限；
步骤4：实际血清样本中gpc3的检测
将已知浓度的gpc3蛋白和实际人血清样本混合，添加到根据步骤2得到的最佳gpc3可视化检测体系中，采用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，记录其在652nm处的吸光度；利用步骤3所得到的gpc3工作曲线，计算得出实际能够检测的gpc3浓度。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2中所述gpc3-apt浓度为5.0μmol/l；h-rgo-pt@pdnps浓度为1.0mg/ml；混合体积比为1:（1-5）。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2中所述的gpc3-ab溶液为100μl10μmol/l；所述的gpc3溶液为100μl；所述的bsa溶液为100μl1%；所述的h-rgo-pt@pdnps-apt为100μl；所述的100µltmb-h2o2中tmb为12.84mmol/l；h2o2为28.44mmol/l。
9.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述的h-rgo-pt@pdnps-apt浓度为1.0-7.0μg/ml，孵育时间为0.3-3h、孵育温度为15-45oc。
10.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述的离子强度为5.0-35mmol/l、检测体系的ph值为2.5-5.5。
技术总结