生物传感器和使用了该生物传感器的测定方法与流程

1.本发明涉及生物传感器和使用了该生物传感器的测定方法。


背景技术：

2.生物传感器通常包括载置有包含氧化还原酶、电子传递物质等的试剂的电极，作为该电极材料，通常使用碳、金和钯等。碳的价格低，但需要进行丝网印刷，具有在电极制造中不容易控制取决于制造时的环境的电阻值的偏差的问题。另外，金、钯等贵金属虽然容易进行高精度的电极加工，但与碳相比，价格昂贵。因此考虑使用低成本且容易加工的贱金属(离子化倾向大于氢的金属)作为电极，但贱金属具有劣化速度快、施加电压时容易溶出的问题。
3.专利文献1～3中公开了使用属于贱金属合金的镍铬合金、镍铜合金等作为生物传感器的电极材料。但是，从对电子传递物质等试剂中的成分的响应性、降低背景电流等方面出发还有改良的余地。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本特表2018
‑
503080号公报
7.专利文献2：国际公开2015060119号小册子
8.专利文献3：日本特表2013
‑
518264号公报


技术实现要素：

9.本发明的课题在于提供一种生物传感器，其能够低成本且简便地制作，能够进行再现性高的葡萄糖等测定对象物质的浓度测定。
10.本发明人为了解决上述课题进行了深入研究。结果发现，在至少在工作电极上载置有具有氧化还原酶和电子传递物质的试剂的生物传感器中，通过使用特定的镍合金作为工作电极的电极材料，尽管是贱金属的合金，也能够低成本且简便地制造具有接近于贵金属电极的电子传递物质的响应性的生物传感器，从而完成了本发明。
11.本发明的一个方式涉及一种生物传感器，其包含绝缘性基材、设于上述绝缘性基材上的电极对、以及载置在上述电极对中的至少工作电极上的具有氧化还原酶和电子传递物质的试剂，该生物传感器用于使用上述试剂对供给至上述电极对的试样中的测定对象物质进行测定，该生物传感器的特征在于，上述工作电极由选自镍
‑
钒合金、镍
‑
钨合金和镍
‑
钌合金中的一种以上的镍合金构成。
12.本发明的另一方式涉及一种测定对象物质的测定方法，其包括下述步骤：对上述生物传感器所具有的上述电极对供给包含上述测定对象物质的上述试样的步骤；在该电极对之间施加电压的步骤；测定在该电极对之间流动的电流的值的步骤；以及基于所测定的电流值计算出上述测定对象物质的量的步骤。
13.发明的效果
14.根据本发明，通过在生物传感器的工作电极中使用特定的镍合金，能够得到接近于贵金属电极的电子传递物质的响应性。由此，能够低成本且简便地制作能以高再现性测定葡萄糖等测定对象物质的生物传感器。
附图说明
15.图1是示出本发明的一个实施方式的生物传感器的制造方法的一例的流程图，(a)～(f)示出了各步骤中的生物传感器的示意图。
16.图2示出图1的生物传感器制造步骤中(b)的状态下的b
’‑
b’线切断部截面图。
17.图3是示出具备本发明的生物传感器的测定装置的一个方式的示意图。
18.图4是示出使用具备本发明的生物传感器的测定装置的测定程序的一个方式的流程图。
19.图5是示出使用在试剂中包含电子传递物质、且具备以au、ni或各种ni合金作为材料的电极对的生物传感器进行循环伏安法时的峰电流值的测定结果的图。使用改变了电子传递物质的浓度的电极进行测定，将峰电流值作图。(a)是使用钌络合物作为电子传递物质时的结果，(b)是使用铁氰化物作为电子传递物质时的结果。
20.图6是示出使用具有在试剂中使用了各种缓冲剂(200mm)的电极的生物传感器进行测定并对葡萄糖浓度与电流值的关系进行调查的结果的图。
21.图7是示出在葡萄糖低浓度域(0～67mg/dl)和高浓度域(67～134mg/dl)对图6的图中的斜率进行调查的结果的图。
22.图8示出了在由钛构成的接触金属上利用镍
‑
钒合金形成了电极的生物传感器中改变镍
‑
钒合金和钛各自的厚度时的响应电流值的调查结果。*、
×
、
△
、〇分别表示在5秒以内发生响应电流值骤跌、在5秒以内发生响应电流值中途上升、5秒值有20μa以上的响应电流值偏差、没有问题。
具体实施方式
23.下面对本发明进行说明。需要说明的是，关于数值范围，在记载为“a～b”的情况下，是指a以上、b以下。
24.(生物传感器)
25.本发明的生物传感器包括基材、设于上述基材上的电极对、以及载置在上述电极对中的至少工作电极上的试剂，该生物传感器用于使用上述试剂对供给至上述电极对的试样中的测定对象物质进行测定，该生物传感器的特征在于，
26.上述工作电极由选自镍
‑
钒合金(ni
‑
v合金)、镍
‑
钨合金(ni
‑
w合金)和镍
‑
钌合金(ni
‑
ru合金)中的一种以上的镍合金(以下有时也称为ni合金)构成。
27.(电极对)
28.本发明的生物传感器中的电极对包含工作电极和对电极，但电极的数量没有限定。例如，本发明的生物传感器也可以为除了包含工作电极和对电极的电极对以外还包含参比电极的三电极体系的生物传感器。本发明的生物传感器还可以为除了具有上述包含工作电极和对电极的电极对(以下有时称为第一电极对)以外，还具有用于对测定对象物质以外的物理数值(试样中的其他测定对象物质的数值、试样的温度等)进行测定的包含工作电
极和对电极的电极对(以下有时称为第二电极对)的生物传感器。
29.工作电极中可以使用镍合金，本发明中，使用选自由镍
‑
钒合金、镍
‑
钨合金和镍
‑
钌合金组成的组中的一种以上的镍合金。
30.镍
‑
钒合金中的镍与钒的比例以重量比计优选为80:20～95:5、更优选为85:15～95:5、进一步优选为90:10～94:6、最优选为92:8。
31.镍
‑
钨合金中的镍与钨的比例以重量比计优选为70:30～90:10、更优选为75:25～85:15、进一步优选为80:20～82:18、最优选为81:19。
32.镍
‑
钌合金中的镍与钌的比例以重量比计优选为60:40～40:60、更优选为55:45～45:55、进一步优选为52:48～48:52、最优选为50:50。
33.需要说明的是，对电极的电极材料没有特别限定，例如可以使用铂等金属电极、碳电极。需要说明的是，作为对电极，可以使用银/氯化银电极，也可以使用上述的镍合金电极。从低成本且能够简便地制作的方面出发，优选为与工作电极相同的镍合金。
34.另外，参比电极等其他电极的电极材料没有特别限定，例如可以使用铂等金属电极、碳电极、银/氯化银电极、标准氢电极、甘汞电极、钯
·
氢电极等，从低成本且能够简便地制作的方面出发，优选可以为与工作电极相同的镍合金。
35.需要说明的是，在本发明的生物传感器为具有上述第一电极对和上述第二电极对的生物传感器的情况下，该第二电极对中的工作电极和对电极的电极材料也可以分别为上述说明的工作电极用电极材料和对电极用电极材料，从低成本且能够简便地制作的方面出发，优选上述第一电极对中的工作电极和对电极、以及上述第二电极对中的工作电极和对电极全部为相同的镍合金。
36.(基材)
37.包含电极对的电极设于基材上，作为基材，使用绝缘性基材。绝缘性基材的种类没有特别限制，例如由聚醚酰亚胺(pei)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯(pe)之类的各种热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂之类的各种热固性树脂、玻璃、陶瓷、纸之类的绝缘性材料形成。从提高电极或后述的接触金属在基材上的固定力的方面出发，优选表面的算术平均粗糙度ra值为1μm以上的材料。在ra值小于1μm的基材的情况下，由于表面平坦，因此电极或接触金属的粘接性降低。需要说明的是，电极和基材的尺寸、厚度可以适当地设定，但特别优选电极的厚度为1μm～100μm。
38.(接触金属)
39.包含电极对的电极层积设置在基材上，但优选在基材与电极之间层积设置接触金属。在绝缘性基材上设置镍合金的情况下，从外部对生物传感器施加力时或者施加电压时，镍合金可能从绝缘性基材上剥离、或者可能在镍合金中产生孔。因此，为了提高镍合金在绝缘性基材上的粘接力，优选设置接触金属。
40.本发明的生物传感器中，在仅工作电极由镍合金形成的情况下，在工作电极与基材之间层积设置接触金属即可，在工作电极和对电极均由镍合金形成的情况下，优选在工作电极与基材之间、以及对电极与基材之间层积设置接触金属。
41.关于接触金属的种类，只要能够将构成电极的镍合金牢固地固定于基材就没有特别限制，例如由钛、钼、钨、铬、铁中的任一种金属形成，优选由钛形成。需要说明的是，接触金属的厚度可以适当地设定，从固定力的方面出发优选为5μm～100μm。另外，关于镍合金与
接触金属的合计厚度，为了不受基材的凹凸的影响，优选为10μm～55μm。
42.在电极为镍
‑
钒合金、接触金属为钛的情况下，设钛的厚度为x、镍
‑
钒合金为y时，优选满足下述范围。
43.1)7μm≦x≦52μm
44.2)3μm≦y≦25μm
45.3)y＝
‑
11/16x 155/4
46.(试剂)
47.本发明的生物传感器中，试剂载置在电极对中的至少工作电极上。
48.工作电极上的载置试剂的位置没有特别限制，优选为与连接至用于对工作电极施加电压的电源的端部不同的另一端部或其附近。
49.需要说明的是，试剂也可以载置在构成电极对的工作电极和对电极两者上，此外也可以进一步载置在工作电极或者工作电极和对电极周边的基材上、或者工作电极和对电极之间的基材上。另外，试剂优选连续地载置在工作电极上，并且优选以具有厚度的层结构进行载置。需要说明的是，在本发明的生物传感器除了具有用于进行测定对象物质的测定的包含工作电极和对电极的上述第一电极对以外还具有用于对测定对象物质以外的物理数值进行测定的包含工作电极和对电极的上述第二电极对的情况下，在该第二电极对上可以载置试剂、也可以不载置试剂。例如，在测定对象物质以外的物理数值为血细胞比容值的情况下，可以为国际公开2005/103669中公开的那样仅在对电极上载置一部分试剂的构成，也可以为日本特开2019
‑
035748中公开的那样不载置试剂的构成。
50.试剂中包含的试剂只要是在测定对象物质的检测反应中使用的试剂就没有特别限制，至少包含氧化还原酶和电子传递物质。
51.(氧化还原酶)
52.氧化还原酶只要是以测定对象物质作为底物并可将测定对象物质进行氧化还原的酶即可，可例示出包含吡咯并喹啉醌(pqq)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)中的至少一者作为催化亚基和催化结构域的氧化还原酶。
53.在测定对象物质为葡萄糖的情况下，例如可以使用葡萄糖脱氢酶或葡糖氧化酶，作为葡萄糖脱氢酶，具体可以举出pqq葡萄糖脱氢酶(pqqgdh)、具有包含fad的α亚基的细胞色素葡萄糖脱氢酶(cygdh)。此外还可以举出来自根瘤农杆菌(agrobacterium tumefasience)的葡萄糖
‑3‑
脱氢酶(glucose
‑3‑
dehydrogenase)。
54.另外，氧化还原酶可以包含电子传递亚基或电子传递结构域。在测定对象物质为葡萄糖的情况下，作为电子传递亚基，例如可以举出具有具备电子转移功能的血红素的亚基。作为包含该具有血红素的亚基的氧化还原酶，可以举出包含细胞色素的氧化还原酶，例如可以应用包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶、pqqgdh与细胞色素的融合蛋白。需要说明的是，pqqgdh与细胞色素的融合蛋白例如公开在国际公开2005/030807号公报中。
55.另外，在葡萄糖以外的测定对象物质的情况下，作为氧化还原酶，可以举出胆固醇氧化酶、醌血红素乙醇脱氢酶(qhedh(pqq ethanol dh))、山梨糖醇脱氢酶(sorbitoldh)、d
‑
果糖脱氢酶(fructose dh)、纤维二糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、尿酸氧化酶等。
56.因此，本发明的生物传感器不仅可用作葡萄糖传感器，还可用作胆固醇传感器、乙醇传感器、山梨糖醇传感器、果糖传感器、纤维二糖传感器、乳酸传感器、尿酸传感器等。
57.(电子传递物质)
58.试剂中包含的电子传递物质是能够接收通过测定对象物质与氧化还原酶的反应而产生的电子、进而能够将电子传递至电极的物质，也被称为介体(mediator)。
59.作为电子传递物质，只要是由氧化还原酶接收电子而被还原、在电极上被再氧化、且不具有催化作用的化合物即可，例如可以举出钌络合物、铁氰化钾等铁氰化物(也被称为六氰基铁(iii)酸盐)、醌化合物(例如，1,4
‑
萘醌、vk3、9,10
‑
菲醌、1,2
‑
萘醌、二甲基对苯醌、甲基苯醌、2,6
‑
二甲基苯醌、1,2
‑
萘醌
‑4‑
磺酸钠、1,4
‑
蒽醌、四甲基苯醌、百里醌)、苯二胺化合物(例如n,n
‑
二甲基
‑
1,4
‑
苯二胺、n,n,n’,n
’‑
四甲基
‑
1,4
‑
苯二胺二盐酸盐)、1
‑
甲氧基
‑
pms(1
‑
甲氧基
‑5‑
甲基吩嗪鎓硫酸甲酯盐)、辅酶q0、天青a氯化物、酚藏花红、6
‑
氨基喹喔啉、四硫富瓦烯等，它们可以单独使用，也可以合用2种以上。
60.需要说明的是，作为钌络合物，优选为由3价钌(ru(iii))与配体构成的钌络合物，更优选下述的钌氨络合物。
61.[ru(nh3)5x]
n
[0062]
此处，作为x，可以举出nh3、卤素离子、cn、吡啶、烟酰胺、联吡啶或h2o等，这些之中，优选nh3或卤素离子(例如cl
‑
、f
‑
、br
‑
、i
‑
)。上述化学式中的n 表示氧化型钌(iii)络合物的价数，根据x的种类适当地决定。需要说明的是，钌络合物的详细内容公开在日本特开2018
‑
013400中。
[0063]
本发明的生物传感器的试剂中的氧化还原酶的含量可以根据测定对象物质的种类适当地决定，但需要相对于测定对象物质含有充分的氧化还原酶，因此生物传感器的载置有试剂的部分的每1cm2表面积的氧化还原酶的量优选为1～10u、更优选为1～5u、特别优选为1～3u。
[0064]
试剂中的电子传递物质的含量优选比氧化还原酶的含量更多，可以根据测定试样的种类等适当地决定，例如，相对于生物传感器的载置有试剂的部分的每1cm2表面积，优选为10mmol～100mmol、更优选为10mmol～50mmol、特别优选为15mmol～20mmol。
[0065]
(其他成分)
[0066]
试剂包含氧化还原酶和电子传递物质，除了这些以外，还可以含有丁缩醛树脂系、聚酯树脂系等树脂粘结剂、日本再表2005/043146中公开的层状无机化合物之类的粘结剂、表面活性剂等。
[0067]
另外，试剂也可以追加包含缓冲剂、表面活性剂等添加剂。作为缓冲剂，可以使用tris、aces、ches、capso、taps、caps、bis
‑
tris、tapso、tes、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)和ada等胺系缓冲剂，也可以使用磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、磷酸柠檬酸缓冲剂、乙酸
‑
乙酸钠缓冲剂、苹果酸
‑
乙酸钠缓冲剂、丙二酸
‑
乙酸钠缓冲剂、琥珀酸
‑
乙酸钠缓冲剂等具有羧基的缓冲剂。缓冲剂的ph优选为6.8～7.2、更优选ph为约7.0。
[0068]
其中优选使用柠檬酸缓冲剂和磷酸柠檬酸缓冲剂。
[0069]
关于试剂中的柠檬酸缓冲剂或磷酸柠檬酸缓冲剂中的柠檬酸的摩尔浓度，在工作电极上的载置有试剂的部分优选为1.5μmol/cm2～22μmol/cm2、特别优选为7.5μmol/cm2～15μmol/cm2。在向这样的生物传感器的电极对供给试样且试剂被上述试样溶解时，关于上述试剂与上述试样的混合溶液中的工作电极上的扩散前的柠檬酸浓度，在包含柠檬酸1.5μmol/cm2～22μmol/cm2的试剂的情况下为约20mm～约300mm，在包含柠檬酸7.5μmol/cm2～15
μmol/cm2的试剂的情况下为约100mm～约200mm。需要说明的是，工作电极上的试剂与试样的混合溶液包括以物理方式存在于工作电极上的混合溶液，是在工作电极上存在于试剂与测定对象物质发生反应的区域的溶液。另外，上述混合溶液为流体，也存在浓度梯度，因此此处所说的柠檬酸浓度的数值是指平均浓度。
[0070]
作为表面活性剂，可以举出triton x
‑
100、十二烷基硫酸钠、全氟辛磺酸或硬脂酸钠、烷基氨基羧酸(或其盐)、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱和磷酸甜菜碱等。
[0071]
需要说明的是，生物传感器中，除了基材、接触金属、电极对、试剂以外，还可以包括设置在基材的具有电极对的面侧的覆盖电极的罩、设置在基材与罩之间的用于在基材与罩之间形成规定空间的间隔物、设置在至少包含电极对中的工作电极的试剂载置部的区域上的具有规定空间的试样供给部等。上述试样供给部可以通过对上述罩或间隔物进行加工来形成。
[0072]
需要说明的是，生物传感器也可以包含上述以外的部件。
[0073]
下面基于图1对可用于本发明的生物传感器的一例进行说明。
[0074]
图1(a)～(f)是示出制造生物传感器的一系列步骤的立体图。需要说明的是，可用于本发明的生物传感器并不限于以下的方式。例如在以下的方式中使用了接触金属，但接触金属在本发明的生物传感器中并非必要的构成。
[0075]
如图1(f)所示，该生物传感器a具备：基材10；电极系统，由对电极11和工作电极12构成，该对电极11具有第1端部、与后述的测定装置连接的第2端部、以及连接第1端部和第2端部的引出部，该工作电极12具有与对电极11的第1端部相邻的第1端部、与后述的测定装置连接的第2端部、以及连接第1端部和第2端部的引出部(图1(b))；形成在基材10与电极系统之间的接触金属19(图1(a))；绝缘层14；具有开口部的间隔物15；以及具有贯通孔18的罩16。如图1(c)所示，在工作电极12的第1端部上载置有试剂13。并且，如图1(d)所示，在基材10上，在电极对的引出部上层积有绝缘层14。并且，如图1(e)所示，在绝缘层14上配置有间隔物15，该间隔物15的对应于工作电极12的第1端部(包含试剂的部分)以及与其对置的对电极的包含第1端部的区域的部位形成为开口部。在间隔物15上进一步配置有罩16，该罩16在对应于上述开口部的一部分具有贯通孔18(图1(f))。该生物传感器中，作为上述开口部的空间部分的、被上述工作电极、对电极、绝缘层14以及罩16所夹的空间部分形成毛细管结构的试样供给部17。该试样供给部17在包含电极对中的至少工作电极的第1端部的试剂载置部的区域上形成为规定的空间。并且，上述贯通孔18成为用于通过毛细管现象吸入试样的空气孔。需要说明的是，也可以为下述的生物传感器a：不具备绝缘层14，间隔物15由绝缘性部件形成而兼具绝缘层14的功能，被间隔物15和罩16所夹的空间部分成为毛细管结构的试样供给部17。
[0076]
(生物传感器的制作方法)
[0077]
本发明的生物传感器例如如下制作。即，在表面的算术平均粗糙度ra值为约2μm的绝缘性基材的单面，通过成膜室压力0.1～0.5pa、氩气流入量160～300sccm、7800w的条件下的溅射层积接触金属。接着，继续通过成膜室压力0.1～0.5pa、氩气流入量160～300sccm、8000w的条件下的溅射分别形成作为工作电极和对电极发挥功能的金属层。接着，在电极上(至少工作电极的第1端部上)涂布试剂制备液，使其干燥，由此可以将试剂载置在电极上。
[0078]
以下例示出更具体的生物传感器的制作法，但本发明的生物传感器的制作法并不限于以下所述。
[0079]
首先，如图1(a)所示，通过基于溅射的物理蒸镀(pvd)在上述条件下在基材10上涂布接触金属19。接着，如图1(b)所示，通过溅射在上述条件下在接触金属19上层积由具有第1端部、第2端部和引出部的对电极11以及具有第1端部、第2端部和引出部的工作电极12构成的电极系统。工作电极12通过在接触金属上层积上述镍合金而形成。
[0080]
图2示出图1(b)中的b
’‑
b’线切断部的截面图。在基材10上层积有接触金属19，在接触金属19上分别层积有工作电极12和对电极11。
[0081]
需要说明的是，除了溅射以外，也可以通过例如基于薄膜镀覆、其他物理蒸镀方法、化学蒸镀(cvd)的成膜等手段在基材上涂布接触金属或电极材料。接着，可以通过实施使用激光的钻削或使用掩模的蚀刻来形成电极系统。例如，可以通过物理蒸镀在绝缘性基材上形成接触金属的层，通过物理蒸镀在该接触金属层上形成镍合金层，从该绝缘性基材上部分除去该接触金属和该镍合金，由此形成包含电极对的电极组。
[0082]
另外，工作电极12也可以通过利用丝网印刷等将镍合金印刷在基材上来形成。
[0083]
关于对电极11，也可以通过利用相同的方法将对电极材料同时涂布在基材上并实施钻削或蚀刻、或者通过利用丝网印刷等将对电极材料印刷在基材上来形成。需要说明的是，在具有参比电极等其他电极的情况下，也可以一并形成。
[0084]
接着，如图1(c)所示，将试剂载置在工作电极12上的一部分上、优选载置在工作电极12的第1端部上。试剂的载置方法没有特别限制，例如可以通过将试剂的溶液点到工作电极12的一部分上、优选点到工作电极12的第1端部上并使其干燥来进行。更具体地说，试剂13例如可以通过制备分散有氧化还原酶、电子传递物质以及必要时的缓冲剂和粘结剂的分散液，将其分注到工作电极12上并使其干燥来形成。作为在上述分散液的制备中使用的溶剂，例如可以使用水、缓冲液醇、n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)等。
[0085]
接着，如图1(d)所示，在形成有上述电极对11、12的基材10上形成绝缘层14。该绝缘层形成在电极对11、12的引出部上。换言之，形成在除了工作电极12的第1端部的包含试剂的部分以及与其对置的对电极的包含第1端部的部分的区域以外的基材10上。上述绝缘层14例如可以通过将绝缘性树脂溶解在溶剂中而成的绝缘糊料印刷在上述基材10上，并对其进行加热处理或紫外线处理来形成。作为绝缘性树脂，例如可以举出聚酯、丁缩醛树脂、酚树脂等，作为上述溶剂，例如可以举出卡必醇乙酸酯、二元酸酯系混合溶剂(dbe溶剂)等。
[0086]
接着，如图1(e)所示，在绝缘层14上配置间隔物15。如图中所示，间隔物15的对应于上述工作电极12的第1端部的包含试剂的部分以及与其对置的对电极的包含第1端部的部分的区域的部位形成为开口部。作为间隔物15的材料，例如可以使用树脂制膜、带等。另外，若为双面胶带，则不仅可与上述绝缘层14粘接，而且还可容易地与后述的罩16粘接。除此以外，也可以通过例如抗蚀剂印刷等手段来形成间隔物。
[0087]
接着，如图1(f)所示，在上述间隔物15上配置罩16。作为上述罩16的材料没有特别限制，例如可以使用各种塑料等，优选可以举出pet等透明树脂。需要说明的是，在pet等透明树脂上也可以涂布有亲水剂(例如噌啉等)。
[0088]
(生物传感器的用途)
[0089]
本发明的生物传感器能够适合用于试样中的测定对象物质的测定。
[0090]
(试样)
[0091]
试样只要是包含测定对象物质的试样就没有特别限制，优选生物体试样，可以举出血液、尿等。
[0092]
(测定对象物质)
[0093]
测定对象物质例如可以举出葡萄糖、胆固醇、乙醇、山梨糖醇、果糖、纤维二糖、乳酸、尿酸等。
[0094]
(测定原理)
[0095]
使包含测定对象物质的试样与本发明的生物传感器的工作电极的第1端部的试剂载置部接触时，测定对象物质与试剂发生反应。反应后在电极对间施加电压，由此生成基于反应的信号。通过检测该信号，能够对测定对象物质进行测定。
[0096]
具体地说，在生物传感器的试剂包含氧化还原酶和电子传递物质的情况下，通过氧化还原酶与测定对象物质的氧化反应或还原反应而生成的电子被传递至电子传递物质，电子传递物质被还原。然后，通过在电极对间施加电压，还原型的电子传递物质在工作电极表面被氧化，由此产生取决于试样中的测定对象物质的量的氧化电流。通过测定该电流值，能够基于该电流值对试样中的测定对象物质浓度进行测定。
[0097]
在计算测定对象物质的浓度的情况下，采用伏安法、安培法、库伦法等。伏安法为下述方法：改变施加至电极的电压，测量变化的响应电流值的图形，基于该图形中的电流峰值等计算出测定对象物质的浓度。安培法为下述方法：对电极施加一定的电压，获得反应开始一定时间后的响应电流值，基于该响应电流值计算出测定对象物质的浓度。库伦法为下述方法：对电极施加一定的电压，使试样中的几乎全部的测定对象物质发生反应后，获得响应电流值的累计值，基于累计值计算出测定对象物质的浓度。
[0098]
(测定对象物质的测定方法)
[0099]
本发明的测定对象物质的测定方法包括下述步骤：
[0100]
对生物传感器所具有的上述电极对供给包含上述测定对象物质的上述试样的步骤；
[0101]
在该电极对之间施加电压的步骤；
[0102]
测定在该电极对之间流动的电流的值的步骤；以及
[0103]
基于所测定的电流值计算出上述测定对象物质的量的步骤。
[0104]
(试样供给步骤)
[0105]
试样向生物传感器的上述电极对的供给可以使用例如微芯片、注射器、毛细管等公知的供给手段从容纳有试样的容器中进行。试样的供给也可以通过自动化的供给手段来进行。
[0106]
需要说明的是，在生物传感器具有上述的试样供给部时，通过向试样供给部供给试样，能够使试样有效地与生物传感器反应。
[0107]
(电压施加步骤)
[0108]
接着，在电极对间施加电压。
[0109]
在进行安培法、库伦法的情况下，在电极对间施加一定的电压。
[0110]
此处，作为施加至工作电极12的电压，只要相对于对电极为正电压即可，可以适当地设定，例如相对于对电极为 50～ 500mv、优选为 100～ 250mv、特别优选为 200mv。为上
述的电压范围时，能够抑制从镍合金电极的基材的溶出，能够维持电极的稳定性，能够防止电压施加时的电极溶出，因此能够降低背景电流且能够长期使用。
[0111]
使试样与试剂接触后，可以在不施加电压的状态下保持规定的时间后对电极系统施加电压，也可以在上述试样与试剂接触的同时对电极系统施加电压。作为在不施加电压的状态下保持时的保持时间，例如为30秒以下或10秒以下，另一方面，在进行循环伏安法测定的情况下，以一定的速度对对工作电极进行电位扫描。电位扫描的循环可以为多个循环。
[0112]
需要说明的是，在使用如上所述包含第一电极对和第二电极对的生物传感器的情况下，施加至第二电极对的工作电极的电压与施加至上述第一电极对的工作电极的电压可以为不同的电压。例如，在使用上述的wo2005/103669中公开的具备仅在对电极上载置一部分试剂的构成的电极对的生物传感器、或者日本特开2019
‑
035748中公开的具备不载置试剂的构成的电极对的生物传感器对作为测定对象物质以外的物理数值的血细胞比容值进行测定的情况下，有时也对第二电极对的工作电极施加比第二电极对的对电极高 1.0～ 7.0v的电压。
[0113]
(电流测定步骤)
[0114]
关于电流测定，在安培法的情况下为了测定电压施加一定时间后的响应电流值，在库伦法的情况下为了得到响应电流的累计值，经时地测定响应电流值。另一方面，在循环伏安法的情况下，为了得到循环伏安法波形，持续地测定与扫描中的电压相应的电流值。响应电流值的测定可以使用通常的电流计等来进行。
[0115]
(浓度计算步骤)
[0116]
基于所测定的响应电流值，计算出测定对象物质的浓度。
[0117]
在安培法的情况下，可以预先利用校正曲线等求出响应电流值与测定对象物质的浓度的关系，将所测定的响应电流值代入到校正曲线中，计算出测定对象物质的浓度。
[0118]
在库伦法的情况下，可以预先利用校正曲线等求出响应电流值的累计值与测定对象物质的浓度的关系，将所测定的响应电流值的累计值代入到校正曲线中，计算出测定对象物质的浓度。
[0119]
另外，在循环伏安法的情况下，可以预先利用校正曲线等求出循环伏安法波形中的峰值与测定对象物质的浓度的关系，将所测定的响应电流值代入到校正曲线中，计算出测定对象物质的浓度。
[0120]
(测定装置)
[0121]
根据本发明的一个方式，本发明的生物传感器组装到测定装置中来使用。测定装置可以包括用于控制电位的控制部22、恒电位仪25、用于测定电流的检测部24、基于电流值的运算部23、输出测定结果的输出部21、以及2个以上的连接端子26等。还可以进一步包括用于向生物传感器的电极对施加电压的电力供给部。
[0122]
接着，使用附图对使用本发明的生物传感器进行测定的测定装置的一个方式进行说明。此处例示出了具备葡萄糖传感器的测定装置的一个方式，但具备本发明的生物传感器的测定装置并不限于以下的方式。
[0123]
图3示出测定装置b的构成例。测定装置b包括控制计算机20和恒电位仪25，在安装生物传感器a时，各个连接端子26与生物传感器的工作电极和对电极的相应的第2端部电连接。控制计算机20在硬件上包括cpu(中央运算处理装置)之类的处理器、存储器(ram
(random access memory，随机存取存储器)、rom(read onlymemory，只读存储器))之类的记录介质、以及通信单元，处理器将记录介质(例如rom)中存储的程序加载至ram并执行，由此作为具备输出部21、控制部22、运算部23和检测部24的装置发挥功能。
[0124]
控制部22对电压施加的时机、施加电压值等进行控制。恒电位仪25是使工作电极的电位相对于对电极恒定的装置，由控制部22进行控制，在生物传感器a的工作电极与对电极之间施加规定的电压(50mv～500mv)，测定工作电极的响应电流，将响应电流的测定结果送至检测部24。
[0125]
运算部23由检测出的电流值进行测定对象物质的浓度的运算并进行存储。输出部21与未图示的显示单元之间进行数据通信，将由运算部23得到的测定对象物质的浓度的运算结果发送至显示单元。
[0126]
下面举出试样为全血、测定对象物为葡萄糖、氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶、电子传递物质为钌(iii)化合物的示例对该测定装置的使用方法的一个方式进行说明。
[0127]
图4是示出利用测定装置进行的葡萄糖浓度测定处理的示例的流程图。
[0128]
首先，将生物传感器a安装到测定装置中，接着，向生物传感器a所具有的电极对供给包含测定对象物质的试样(试样供给步骤)。
[0129]
具体地说，例如，使全血试样与生物传感器a的试样供给部17的一端接触。该试样供给部17如上所述形成为毛细管结构，在与另一端对应的位置，在罩16上设有空气孔18，因此通过毛细管现象将上述试样抽吸到内部。被抽吸的上述试样到达设于检测部13的工作电极12上的试剂表面。之后，到达表面的试样中的葡萄糖优先与葡萄糖脱氢酶反应，被转换成葡萄糖酸内酯。通过此时所生成的电子，钌(iii)化合物被还原，生成钌(ii)化合物。
[0130]
接着，在电极对间施加电压(电压施加步骤)。
[0131]
具体地说，例如，当控制计算机20的cpu(控制部22)接收到葡萄糖浓度测定的开始指示时，控制部22控制恒电位仪25，向工作电极施加规定的电压，开始测定(步骤s01)。需要说明的是，也可以为浓度测定开始指示。
[0132]
通过对电极施加正电压，在试剂中存在的该钌(ii)化合物与电极之间进行电子转移，响应电流流动，因此对该电流进行检测(响应电流测定步骤)。
[0133]
具体地说，例如，恒电位仪25测定通过电压施加得到的响应电流、即基于来自试样内的测定对象物质(葡萄糖)的电子向电极的移动而产生的电流，例如测定电压施加1～20秒后的稳态电流，送至检测部24(步骤s02)。
[0134]
该氧化电流的值与试样中的葡萄糖的浓度成比例，因此若利用上述运算手段将其运算成葡萄糖浓度，则能够计算出试样中的葡萄糖浓度(浓度计算步骤)。
[0135]
具体地说，例如，运算部23基于电流值进行运算处理，计算出葡萄糖浓度(步骤s03)。例如，控制计算机20的运算部23预先保持有葡萄糖浓度的计算式或葡萄糖浓度的校正曲线数据，使用这些计算式或校正曲线将电流值换算成葡萄糖浓度，计算出葡萄糖浓度。
[0136]
输出部21通过在其与显示部25之间形成的通信链路将葡萄糖浓度的计算结果发送到显示部25(步骤s04)。另外，也可以将计算结果保存到运算部23，以后调出计算结果，显示在显示部并进行确认。
[0137]
实施例
[0138]
下面举出实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的方式。
[0139]
(实施例1)
[0140]
为了比较各电极的各种金属的电流响应性的性能，生物传感器使用了简单地与图1所示的生物传感器相比通过以下过程制作的简易的生物传感器。首先，作为葡萄糖传感器的绝缘性基材10，准备pet制基材(长度50mm、宽度6mm、厚度250μm)，在其一个表面的整面上溅射各种金属(金(au)、镍(ni)、ni
‑
v(92:8)、ni
‑
w(81:19)、ni
‑
ru(50:50))，对其进行修整，由此形成具有第1端部、第2端部和引出部的工作电极12以及具有第1端部、第2端部和引出部的对电极11。
[0141]
在工作电极12上仅载置钌化合物([ru(nh3)6]cl3、同仁化学研究所公司制造)或铁氰化钾中的任一种电子传递物质。即，将上述电子传递物质0.45μl分注在工作电极12的第1端部上。之后将其在30℃进行干燥，由此载置电子传递物质。
[0142]
接着，藉由胶带在上述电极对上载置间隔物，形成规定的空间。即，间隔物的开口部的规定空间形成毛细管结构，因此将其作为试样供给部。
[0143]
需要说明的是，作为试剂可以使用葡萄糖氧化还原酶，这种情况下，可以使用葡萄糖脱氢酶。在使用葡萄糖脱氢酶的情况下，如下制备试剂制作用制备液。首先，在10mm或50mm的钌化合物([ru(nh3)6]cl3、同仁化学研究所公司制造)或者10mm或50mm的铁氰化钾中添加葡萄糖脱氢酶(3.0单位/条)，将其作为试剂制作用制备液即可。
[0144]
<循环伏安法测定>
[0145]
对于如上所述制作的在试剂中包含电子传递物质、具备以au、ni或各种ni合金作为材料的电极(工作电极)的生物传感器，通过调查循环伏安法波形来测定电子传递物质的电响应性，对电极响应特性进行评价。循环伏安法波形如下进行调查：向葡萄糖传感器的试样供给部导入试样(100mmpbs(磷酸缓冲生理盐水)ph7.0)后，使扫描速度为20mv/秒、使向工作电极施加的电压相对于对电极为
‑
400mv
→
400mv(钌络合物的情况下)、
‑
800mv
→
800mv(铁氰化物的情况下)而进行3圈扫描，通过测定扫描时的响应电流来进行调查。图5示出对各个生物传感器测定第1、2和3圈的峰电流值并计算出它们的平均值而得到的结果。
[0146]
结果可知，在使用ni
‑
v电极、ni
‑
w电极、ni
‑
ru电极中的任一者作为工作电极的情况下，尽管不及au电极，但仍显示出优于ni电极的电流响应性。因此可知，根据本发明，通过在生物传感器的工作电极中使用ni
‑
v电极、ni
‑
w电极、ni
‑
ru电极中的任一种镍合金电极，能够得到接近于贵金属电极的电子传递物质的响应性。由此，通过使用上述的镍合金，能够低成本且简便地制作能以高再现性对葡萄糖等测定对象物质进行测定的生物传感器。
[0147]
(实施例2)
[0148]
接着研究了电极的试剂中使用的缓冲剂对背景的影响。为了比较缓冲剂的性能，使用了简单地与实施例1的生物传感器相比除了在检测部13的工作电极12的第1端部上不载置试剂(电子传递物质和氧化还原酶)以外其余相同的生物传感器。即，对于ni
‑
v电极、ni
‑
w电极或ni电极，在试样中使用柠檬酸(最终浓度20mm、50mm、100mm或200mm)作为缓冲剂进行循环伏安法(0
→
1.0v)，测定 0.5v(该电压为容易掌握特性的电压)时的电流值。作为比较例，在试样中使用磷酸(最终浓度20mm、50mm、100mm或200mm)作为缓冲剂，利用同样的测定方法测定电流值。本实验中，在检测部13上仅有缓冲剂存在于电极上，因此通过施加电压而得到的电流值仅归因于由仅包含缓冲剂的溶液引起的电流值。因此，可以评价各缓冲剂对背景、即噪声成分的影响。将结果示于表1。其结果可知，与使用磷酸缓冲剂的情况相
比，使用柠檬酸缓冲剂时能够降低背景电流值，该倾向在ni
‑
v电极中显著。背景电流的原因之一被认为是由电压施加引起的电极的腐蚀。其原因在于，由于ni和v(钒)为贱金属，因此容易腐蚀。认为通过使用柠檬酸缓冲剂，柠檬酸与ni形成络合物，抑制了钝化覆膜的破坏，降低了背景电流值。需要说明的是，由于依赖于柠檬酸的浓度，因此在使用磷酸柠檬酸缓冲剂的情况下也能够得到相同的效果。另外，浓度越高则背景电流值越低，因此可知，即使在柠檬酸浓度高于200mm的情况下、例如即使为200mm～300mm，也能够得到相同的效果。
[0149]
[表1]各种电极中的柠檬酸或磷酸浓度与背景电流值(μa)的关系
[0150]
(实施例3)
[0151]
接着进行了葡萄糖浓度测定中的再现性的评价。使用与实施例1的生物传感器相比除了使电极仅为ni
‑
v电极、并在工作电极的第1端部载置下述表2的构成的试剂以外其余相同的生物传感器(在工作电极中具有ni
‑
v电极的图1所示的生物传感器)，在ni
‑
v电极中实施了基于不同缓冲剂的检测灵敏度的评价。缓冲剂使用磷酸、柠檬酸、磷酸柠檬酸、pipes、hepes(分别为ph7.0)，调整至利用各试样将试剂溶解时在工作电极上的试剂与试样的混合溶液中的浓度为约100mm。在柠檬酸和磷酸柠檬酸的情况下，使每1条(strip)中的柠檬酸的存在量为17.2μg。将其换算成柠檬酸的物质量时相当于90nmol，工作电极上的载置有试剂的部分为0.006cm2，因此柠檬酸的摩尔浓度相当于15μmol/cm2。使用这样的生物传感器，利用图3所示的测定装置，使用静脉全血样本将葡萄糖浓度变为0mg/dl、67mg/dl、134mg/dl、336mg/dl、600mg/dl、1000mg/dl来进行测定，对工作电极施加 0.2v的电压，电压施加8秒后测定电流值。将结果示于图6。
[0152]
[表2]实施例3的试剂构成
[0153][0154]
其结果可知，在使用利用了柠檬酸缓冲剂和磷酸柠檬酸缓冲剂的电极的情况下，
与磷酸的情况下同样地显示出与葡萄糖浓度相应的高响应电流值，响应电流值的线性良好。另一方面，在使用pipes、hepes时，响应电流值相对于葡萄糖浓度的线性变差，因此可知葡萄糖浓度测定中的再现性显著变差。该现象的原因在于，在使用pipes、hepes的试剂的情况下，对样本的溶解性降低。
[0155]
接着，使用相同的数据，分成葡萄糖低浓度域(glu0
‑
glu67)和葡萄糖中浓度域(glu67
‑
glu134)来观察校正曲线的斜率，将结果示于图7。图7的横轴分别排列了磷酸、柠檬酸、磷酸柠檬酸、pipes、hepes缓冲剂的葡萄糖低浓度域和葡萄糖中浓度域，纵轴排列了各校正曲线的斜率。校正曲线的斜率越大，葡萄糖浓度换算值的再现性越高，表示检测灵敏度高。如图7所示，可知在使用试剂中包含柠檬酸缓冲剂和磷酸柠檬酸缓冲剂的电极的情况下，在低浓度域，斜率大于磷酸，在低浓度域和中浓度域，斜率大于pipes和hepes。因此可知，试剂中包含柠檬酸缓冲剂和磷酸柠檬酸缓冲剂的电极在葡萄糖低浓度域的检测灵敏度高。
[0156]
另外，使用同样的生物传感器，对葡萄糖浓度67mg/dl、134mg/dl、336mg/dl的试样(全血)进行测定(n＝10)，求出各自的变异系数(cv)。将结果示于表3。其结果可知，具有使用了柠檬酸缓冲剂和磷酸柠檬酸缓冲剂的电极的生物传感器在葡萄糖低浓度区域的测定值的再现性良好。
[0157]
[表3]缓冲剂的种类与cv(％)的关系
[0158] glu67glu134glu336磷酸2.101.871.74pipes15.9916.6711.97hepes9.4621.2510.77柠檬酸0.932.552.81磷酸柠檬酸1.221.871.94
[0159]
需要说明的是，在使用pipes、hepes的情况下，根据未记载的与实施例2同样的实验可以确认背景成分的影响低。根据实施例3的实验，校正曲线的斜率小、cv值也大，因此可知高检测灵敏度和测定再现性对柠檬酸具有特异性。
[0160]
根据以上内容，通过在试剂中使用柠檬酸缓冲剂或磷酸柠檬酸缓冲剂，能够降低背景的电流值，并且能够提高测定的再现性。由此能够再现性高且高精度地进行测定。
[0161]
在使用本发明的生物传感器进行测定时发现了下述课题：在流动的电流值大的条件下、具体地说在施加电压为1.0v以上这样施加高电压的情况下或使用血浆之类的电阻值低(即电流容易流动)的样本的情况下，由于作为贱金属的镍合金的溶出而使电极从基材剥离、或者在电极中产生孔，无法得到正的响应电流值。并且发现，生物传感器的电极的厚度越厚、和/或接触金属的厚度越薄，该现象的发生越显著。特别是在使用具备均由接触金属和镍合金形成的第一电极对和第二电极对、且具备仅在对电极上载置一部分试剂的构成的第二电极对的生物传感器；或具备在工作电极和对电极中的任一者上均未载置试剂的构成的第二电极对的生物传感器，为了测定血细胞比容值而施加 1.0～ 7.0v的高电压的情况下，确认到显著地发生该现象。
[0162]
因此，如下述实施例4所记载，在通过在绝缘性基材上层积由钛构成的接触金属、在该接触金属上层积镍
‑
钒合金而形成了电极系统的生物传感器中，对改变镍
‑
钒合金和钛
各自的厚度时的响应电流值进行了评价，并进行了深入研究，结果查明，在电极和接触金属均为规定的厚度范围、且两者具有一定的关系的情况下，能够使该现象不会发生。即，确认到以下的至少四个现象。
[0163]
(1)电极越薄，膜越稳定，但若过薄，则电极本身的电阻值变得过高，或者电阻值的个体间差异的偏差变得过大，因此需要为一定范围以上的厚度。
[0164]
(2)接触金属的目的在于将电极固定在基材上，为了使电极层稳定，需要一定以上的厚度，但若过厚，则变得不稳定。
[0165]
(3)为了不受基材的凹凸的影响(在薄的情况下，电极的表面带有凹凸，电阻值增高)，电极与接触金属的合计厚度最低限度需要为10μm以上的厚度。
[0166]
(4)截至一定范围内，接触金属越厚，载置的电极的厚度越增加，但若超出一定范围，则会对测定值产生影响，因此载置的电极减少，合计厚度为55μm以下。
[0167]
在电极为镍
‑
钒合金、接触金属为钛的情况下，如实施例4所示，确认到在设钛的厚度为x、镍
‑
钒合金为y的情况下，通过满足以下的范围，能够使该现象不会发生。
[0168]
1)7μm≦x≦52μm
[0169]
2)3μm≦y≦25μm
[0170]
3)y＝
‑
11/16x 155/4
[0171]
(实施例4)
[0172]
在绝缘性基材上层积由钛构成的接触金属，在该接触金属上层积镍
‑
钒合金，由此形成电极对，制作出生物传感器(在工作电极
·
对电极上无试剂)。改变接触金属和镍
‑
钒合金的厚度来准备多个生物传感器，添加下述的样本后，施加电压，对响应电流进行评价。
[0173]
<测定条件>
[0174]
电压：3.5v
[0175]
施加时间：10秒
[0176]
温度：40℃
[0177]
样本：血细胞比容值20％的血液
[0178]
响应电流值：100～300μa
[0179]
<验证结果的判定基准>
[0180]
*在5秒以内发生响应电流值骤跌
[0181]
×
在5秒以内发生响应电流值中途上升
[0182]
△
5秒值有20μa以上的响应电流值偏差
[0183]
〇没有问题
[0184]
将结果示于图8。
[0185]
下面对图8的结果进行考察。在实施图8的实验之前，首先对在各电极
·
接触金属的厚度条件下制作的生物传感器进行观察，目视确认电极表面的凹凸。其结果，如上述现象(3)所述，在镍
‑
钒合金与接触金属的合计厚度小于10μm的情况下，受到了基材的凹凸的影响，预料到对测定结果产生影响，判断为不适合作为生物传感器。
[0186]
这样，制作多个为了不受基材的凹凸的影响而使镍
‑
钒合金与接触金属的合计厚度为10μm以上的生物传感器，按照测定条件得到的结果为图8。由图8的结果确认到，在镍
‑
钒合金的厚度为3μm以上且25μm以下、以及钛的厚度为7μm以上且小于20μm的条件下，即使
是这样的厚度条件，也能够稳定地进行测定。由此可以确认，如上述现象(1)和(2)所述，电极和接触金属具有厚度条件。另一方面，在钛的厚度为20μm以上的条件下，得到了钛越厚则在其上载置的镍
‑
钒合金的厚度越薄的结果。可以确认，若钛为50μm、镍
‑
钒合金为5μm，则能够进行测定，发现了上述3)y＝
‑
11/16x 155/4的关系式，并且确定了上述现象(4)的条件。
[0187]
符号的说明
[0188]
a
···
生物传感器
[0189]
10
···
基材
[0190]
11
···
对电极
[0191]
12
···
工作电极
[0192]
13
···
试剂
[0193]
14
···
绝缘层
[0194]
15
···
间隔物
[0195]
16
···
罩
[0196]
17
···
试样供给部
[0197]
18
···
空气孔
[0198]
19
···
接触金属
[0199]
b
···
测定装置
[0200]
20
···
控制计算机
[0201]
21
···
输出部
[0202]
22
···
控制部
[0203]
23
···
运算部
[0204]
24
···
检测部
[0205]
25
···
恒电位仪
[0206]
26
···
连接端子