一种抗菌肽HeHampⅠ(67-92)及其应用的制作方法

一种抗菌肽hehampⅰ(67
‑
92)及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于线纹海马的抗菌肽。


背景技术：

2.海马是唯一雄性妊娠的鱼类，具有极高的经济和药用价值。近年来，海马养殖迅速发展，逐渐进入成熟的产业化阶段。随着养殖规模的不断扩大和养殖密度的增加，海马养殖受到疾病的严重打击，如水质和病原微生物引起的肠炎、皮肤溃疡等，造成巨大的经济损失。同时，排泄的粪便或鱼饲料中的大量营养物质可能通过促进水中细菌快速生长，释放大量的内毒素，危害养殖动物的健康生长。再者，海水养殖中抗生素的大量使用，药物残留和病原菌耐药性等问题日益严重，危及养殖业的发展和人类健康。
3.抗菌肽(antimicrobial peptides,amps)是先天系统中一种重要的效应因子，对细菌、真菌和病毒等具有广泛的抑制作用。水产动物生活在富含微生物的水体中，时刻面临微生物的攻击，抗菌肽在防御病原微生物入侵方面起着重要作用。与抗生素等化学药物不同，大多数抗菌肽对微生物不具有特异性，很难产生耐药性，使其成为抗生素的理想替代品。并且抗生素杀灭细菌，通常会引起细菌死亡导致内毒素的大量释放，而许多抗菌肽除了具有抗菌作用，还能中和内毒素，减少细菌毒力。
4.虽然抗菌肽有许多优点，但也存在某些不足之处，例如，相当一部分天然抗菌肽毒性较高，甚至能导致真核细胞发生溶血现象；再者，许多抗菌肽抗菌谱窄，只对一些特定类群的微生物具有抗菌活性，例如只对革兰氏阴性菌、只对革兰氏阳性菌、只对真菌或者只对某种或某几种微生物具有抗菌活性。为解决上述问题，本发明人极力于研发新的广谱、无真核细胞毒性并且能抑制细菌内毒素释放的抗菌肽，以满足实际应用的需求。


技术实现要素：

5.本发明的第一个方面是提供一种微生物凝集谱广、对真核细胞无毒性并且可以有效抑制细菌内毒释放的抗菌肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示，具体地，其氨基酸序列为：qsnlsvcywcckccrsykgcglcckf。
6.本发明的第二个方面是提供一种核酸，其编码第一个方面所述的抗菌肽。
7.本发明的第三个方面是提供一种重组表达载体，其包含第二个方面所述的核酸。
8.本发明的第四个方面是提供一种基因工程细胞，其为转导或转染了第二个方面所述的核酸或第三个方面所述的重组表达载体的细胞。
9.本发明的第五个方面是提供第一个方面所述的抗菌肽、第二个方面所述的核酸、第三个方面所述的重组表达载体或第四个方面所述的基因工程细胞在制备抗菌制剂中的应用；
10.优选地，所述抗菌为抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的一种或多种；
11.优选地，所述抗菌为抗副溶血弧菌、哈氏弧菌、大肠杆菌、多耐药大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、鲍曼不动杆菌耐药株、克雷伯氏肺炎菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、藤黄微
球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌的一种或多种。
12.本发明的第六个方面是提供一种抗菌制剂，包含第一个方面所述抗菌肽；
13.优选地，所述制剂为饲料添加剂、兽药、防腐剂或医药抑制剂。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：相对于其他抗菌肽，本发明的抗菌肽对微生物的凝集谱更广，对细菌游离内毒素的抑制效果更好，对真核细胞无毒性，可应用于水产养殖业和医药领域。
附图说明
15.图1为合成肽hehamp
ꢀⅰ
(67
‑
92)对鲍曼不动杆菌游离内毒素释放的影响，折线上的字母不同，表示不同折线之间具有显著性差异；
16.图2是合成肽hehamp
ꢀⅰ
(67
‑
92)对副溶血弧菌游离内毒素释放的影响，折线上的字母不同，表示不同折线之间具有显著性差异；
17.图3是合成肽hehamp
ꢀⅰ
(67
‑
92)对大肠杆菌游离内毒素释放的影响，折线上的字母不同，表示不同折线之间具有显著性差异；
18.图4为合成肽hehamp
ꢀⅰ
(67
‑
92)对海马胚胎细胞活性的影响。
具体实施方式
19.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
20.实施例1线纹海马抗菌肽hepcidin(hehamp
ꢀⅰ
)序列的确定
21.本发明基于线纹海马基因组和转录组数据库，筛选获得hehamp
ꢀⅰ
的cdna序列，从线纹海马组织中克隆获得该抗菌肽序列，具体步骤为：
22.以成年雄性海马的肝脏组织为材料，使用trizol试剂(invitrogen公司，waltham,ma,usa)，按照其附带的说明书，提取总rna。使用reverace qpcr rt master mix with gdna remover(toyobo,osaka,japan)试剂盒，取1微克总rna用于cdna第一链的合成。采用primer 5.00(palo alto,ca)设计该基因的特异性引物f，r(f:5'
‑
atgaaggcattcagcattgc
‑
3'；r:5'
‑
tcagaacttgcagcacaagc
‑
3')，用于扩增hehampⅰ的开放阅读框(orf)。本研究中pcr反应遵循如下循环参数:95℃5min；95℃30s,60℃30s,72℃1min共36个循环；72℃10min。使用e.z.n.a gel extraction kit(omega biotek,norcross,ga,usa)纯化相应分子质量的dna产物。挑选3个阳性克隆由生工生物技术有限公司测序(shanghai,china)。扩增获得的线纹海马hehampⅰ的cdna开放阅读框的片段为279bp,编码92个氨基酸残基(氨基酸序列如seq id no:2所示)。其氨基酸序列结构由信号肽、前导肽和成熟肽组成，与已报道的抗菌肽hepcidin家族有明显的相似性，故线纹海马hehampⅰ是hepcidin家族的一个新成员。
23.实施例2线纹海马抗菌肽hepcidin(hehamp
ꢀⅰ
)成熟肽的生物学活性检测
24.hehamp
ꢀⅰ
成熟肽的合成
25.成熟肽hehamp
ꢀⅰ
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92)的氨基酸序列为：qsnlsvcywcckccrsykgcglcckf，或如seq id no:1所示。采用固相多肽合成法，由genscript生物技术公司(南京，中国)合成。该合成肽的分子质量和纯度分别为2.986kd和95.7％。合成肽在使用前以干粉的形式储存在
‑
80℃。
26.微生物凝集试验
27.凝集实验所用革兰氏阴性菌：副溶血弧菌、哈氏弧菌、大肠杆菌、多耐药大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、鲍曼不动杆菌耐药株、克雷伯氏肺炎菌、鼠伤寒沙门氏菌；革兰氏阳性菌：苏云金芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；真菌：白假丝酵母菌。细菌(非弧菌)用营养肉汤(nb)、mh肉汤培养基进行培养，弧菌用2216e培养基进行培养，真菌用ypd培养基进行培养。最适温度培养至对数期，取微生物细胞于室温下4000
×
g离心5分钟，再用tbs缓冲液(10 mm tris
‑
hcl，150 mm氯化钠，ph值7.4)洗涤三次，然后用tbs缓冲液重悬至od
600
＝0.6。将上述合成肽溶于无菌水中，然后加入到含微生物的溶液中，再加入10mm cacl2进行混合后，使菌液od
600
值为0.3，并使微生物凝集实验时的蛋白终浓度分别为3μm、6μm和12μm。同时用bsa(牛血清白蛋白，2mg/ml)作为对照，每组设置三个重复。在光学显微镜(德国leica dmi4000b)下观察凝集反应，结果如表1所示。
28.表1 hehamp
ꢀⅰ
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92)的微生物凝集活性
29.蛋白浓度12μm6μm3μm对照苏云金芽孢杆菌
‑
枯草芽孢杆菌
‑
藤黄微球菌
‑
金黄色葡萄球菌
‑
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
‑
粪肠球菌
‑
耐甲氧西林表皮葡萄球菌
‑
副溶血弧菌
‑
哈氏弧菌
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鲍曼不动杆菌
‑
鲍曼不动杆菌耐药株
‑
大肠杆菌
‑
多耐药大肠杆菌
‑
鼠伤寒沙门氏菌
‑
克雷伯氏肺炎菌
‑
白假丝酵母菌
‑
30.其中，“ ”是指有95％
‑
100％的菌体凝集；“ ”是指有70％
‑
95％的菌体凝集；“ ”是指有30％
‑
70％的菌体凝集；
“‑”
是指有无可见菌体凝集。
31.从表1可知，合成肽hehamp
ꢀⅰ
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‑
92)对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌均具有良好的凝集作用，尤其对耐药菌株(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、多耐药大肠杆菌、鲍曼不动杆菌耐药株)同样具有良好的凝集活性，体现了该肽的抗菌广谱性；在蛋白浓度为3μm时，即出现了明显的凝集现象。
32.实施例3细菌内毒素抑制实验
33.本实验所用试剂及耗材均为无菌，无内毒素。
34.将大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌在最适温度下孵育过夜后收集菌体，用1
×
pbs洗涤3次，用1
×
pbs重悬至1
×
105cfu ml
‑1。实验组为：合成肽与菌液等体积混合(处理大肠杆菌和副溶血弧菌时，蛋白和菌液的混合液中，蛋白的终浓度为6μm；处理鲍曼不动杆菌时，蛋白和菌液的混合液中，蛋白的终浓度为6μm)；对照组为：蛋白溶剂(体积比为千分之一的dmso溶液)与菌液等体积混合，并且选择大黄鱼hepcidin的成熟肽(pc
‑
hepc)作为参照，每组设置三个重复。室温条件下，在多肽和细菌共孵育后的第0.5h,1.5h和3h，用0.22μm的滤头过滤除去细菌，用鲎试剂内毒素检测试剂盒(bioendo，中国)检测细菌游离内毒素的浓度。大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌内毒素释放结果分别如图1、图2和图3所示。
35.从图1、图2和图3可知，海马hepcidin成熟肽hehamp
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92)能够抑制细菌游离内毒素释放，并且其作用显著强于大黄鱼hepcidin成熟肽pc
‑
hepc。
36.实施例4细胞毒性实验
37.当线纹海马胚胎细胞的密度达到90％以上后，进行传代。先弃尽培养基，1ml hbss洗涤后用1ml胰蛋白酶消化30s至悬浮状态。用培养基(80％dmem，20％胎牛血清fbs，1x双抗)稀释细胞悬液，使细胞浓度为1
×
105个/ml，向96孔细胞培养板中加入稀释的细胞悬液，每孔100μl，28℃恒温过夜培养。实验前，吸出培养基，加入100μl含有hehamp
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92)多肽的dmem培养基，蛋白终浓度为96μm、48μm和24μm，每个浓度设置三个平行，并以等体积添加不含多肽的dmem培养基作为对照，28℃培养24h。吸出旧培养基，每孔加入100μl dmem新鲜培养基及10μl的cck
‑
8试剂，避光培养4h后，测定吸光度a450 nm，计算统计出细胞的存活率：
38.1.对照组(蛋白终浓度为0μm)的三个平行样a450nm吸光值为a1,a2,a3,他们的平均值为a。a1/a,a2/a,a3/a为对照组的细胞存活率。
39.2.每个实验组(蛋白终浓度为24μm，48μm，96μm)的三个平行样的a450nm吸光值分别为b1、b2、b3，分别除以a即得细胞存活率b1/a,b2/a,b3/a。
40.采用unpaired student's t检验或单因素方差分析及tukey’s检验进行统计学差异分析，p< 0.05为差异有统计学意义。结果如图4所示。
41.从图4可知，海马hepcidin成熟肽hehamp
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92)与海马胚胎细胞共孵，不会降低细胞的存活率，说明其对胚胎细胞无毒性。