本发明属于分子诊断生物学，具体地说本发明涉及ddpcr定量检测2种急性淋巴细胞白血病融合基因的方法与试剂盒。
背景技术：
1、白血病是一种危及生命的疾病，其中急性淋巴细胞白血病(all)是其中较常见的一种类型。all(acutelymphoblasticleukemia)中文全称为“急性淋巴细胞白血病”。它是一种白血病亚型，起源于淋巴母细胞，属于血液系统的恶性肿瘤。all可以发生于任何年龄，但在儿童中最为常见，占15岁以下儿童所有白血病的75％。然而，它也会在成年人中发生，尽管较为罕见，约占成人急性白血病病例的20％。all的症状包括贫血、出血、淋巴结肿大、肝脾肿大以及继发感染。患者可能会感到虚弱、乏力，出现发热等症状。以下是2种常见的all融合基因。
2、tel-aml1：tel-aml1基因融合是由tel(etv6)基因和aml1(runx1)基因的融合所形成。它是儿童all中最常见的染色体融合之一，特别在b细胞all中较为常见。携带tel-aml1融合基因的患者通常具有良好的预后，较高的治愈率和生存率。
3、e2a-pbx1：e2a-pbx1基因融合是由e2a基因和pbx1基因的融合所形成。它在儿童和成人前体b细胞急性淋巴细胞性白血病(all)中较为常见。携带e2a-pbx1融合基因的患者通常具有不良预后，其表达水平可以用于评估和追踪all的治疗效果。
4、对于白血病患者，准确检测和定量这些融合基因的表达水平对于确定白血病亚型、预后评估和制定个体化的治疗方案至关重要。这些检测方法可以帮助医生了解患者的白血病特征，并指导治疗决策和监测疗效。因此，了解白血病背景及相关融合基因的信息对于更好地理解白血病的发病机制和个体化治疗具有重要意义。
5、目前融合基因的检测方法主要包括荧光原位杂交技术和聚合酶链式反应(pcr)。以下是对这些方法的简要介绍：
6、荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，fish)：fish技术利用荧光标记的探针与目标基因或染色体特异性序列结合，从而在细胞核内形成特定的荧光信号。在融合基因的检测中，fish技术可以使用两个不同的探针，将其与融合基因所在的染色体区域结合，从而检测融合基因的存在。fish技术具有高度特异性和灵敏性，可以在细胞水平上检测融合基因的存在。
7、聚合酶链式反应(pcr)：pcr是一种常用的分子生物学技术，能够扩增特定的dna序列。在融合基因的检测中，pcr技术可使用融合基因的特异引物，扩增融合基因所在的片段。通过pcr扩增后的产物可以通过凝胶电泳等方法进行分析和检测。pcr技术具有高度特异性和灵敏性，能够快速、准确地检测融合基因的存在。
8、目前，常用的融合基因检测方法是荧光定量pcr(qpcr)。qpcr是一种灵敏度较高的核酸检测方法。然而，在实际测试样本中，例如，存在抑制剂或由于cdna超载导致的抑制，会影响qpcr扩增的效率。由于qpcr是依赖于标准曲线进行定量的，而标准曲线不会被校正，因此在qpcr检测中仍然存在较大的变异性。这可能导致临床医生做出错误的判断。
9、数字pcr(digitalpolymerasechainreaction)是一种高灵敏度的核酸检测技术，用于定量分析dna或rna的数量。其检测原理基于传统的聚合酶链反应(pcr)技术，但引入了数字化的概念，以实现更精确的分子计数。
10、数字pcr的检测原理如下：
11、样本准备：首先，从待检测的dna或rna样本中提取目标分子，并进行必要的前处理步骤，如核酸纯化和稀释。样本中的目标分子通常是一个特定的dna片段或rna序列。
12、分割样本：样本被分割成许多微小的单元，每个单元包含一定数量的目标分子或不包含任何目标分子。
13、pcr扩增：在每个单元中，进行pcr扩增反应。pcr反应包括多个循环，每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。这些步骤使dna或rna模板逐渐增加，产生越来越多的复制物。
14、监测信号：在每个pcr循环之后，检测目标分子的增量。通常，这是通过引入一个荧光探针或荧光染料，以监测pcr反应产物的累积来实现的。如果一个单元包含目标分子，它会在pcr反应中产生荧光信号。
15、数字化分析：根据每个单元是否显示荧光信号，将样本中的单元分为两个组：包含目标分子的单元和不包含目标分子的单元。通过对这两个组的数量进行计数，可以确定初始样本中目标分子的数量。
16、数字pcr的关键优势在于它可以实现非常高的精确度和灵敏度，因为每个单元都被独立地分析，避免了pcr的一些传统限制，如扩增效率不同、抑制性物质的存在等。这使数字pcr成为许多应用领域，包括基因表达分析、病毒载量测定、检测罕见突变等的有力工具。因而，期望开发一种基于数字pcr平台的白血病融合基因定量检测试剂，以提升比实时荧光定量pcr更高灵敏度、更高精确度和特异性的结果提供临床参考。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术存在的问题，本发明涉及ddpcr定量检测2种急性淋巴细胞白血病融合基因的方法与试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因进行定量检测，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。
2、为达到上述目的，本发明的技术方案为：
3、一种基于数字pcr定量检测急性淋巴细胞白血病相关融合基因表达的引物组合，包括：根据2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因tel-aml1，e2a-pbx1的基因序列设计的多条特异性引物，以及根据正常的abl1基因序列设计设计的特异性引物即内参引物。
4、用于检测tel-aml1融合基因的seq id no.1-2所示核苷酸序列的引物和seq idno.7所示核苷酸序列的探针；
5、用于检测e2a-pbx1融合基因的seq id no.3-4所示核苷酸序列的引物和seq idno.8所示核苷酸序列的探针。
6、用于检测abl1基因(内参)的seq id no.5-6所示核苷酸序列的引物和seq idno.9所示核苷酸序列的探针。
7、本发明筛选扩增效率一致且阴性阳性微滴明显分离的引物，最终选定的检测用引物和探针序列如表1所示下：
8、表1用于扩增的引物和探针序列
9、 序列号 序列名称 核酸序列(5’-3’) seq id no.1 tel-aml1-f1 gtctctgtctccccgcctg seq id no.2 tel-aml1-r1 ggcggctcgtgctggcat seq id no.3 e2a-pbx1-f1 caccagcctcatgcacaacc seq id no.4 e2a-pbx1-r1 ctgggctcctcggatactcaaaa seq id no.5 abl1-f1 gggcgtgtggaagaaata seq id no.6 abl1-r1 accaggttagggtgtttga seq id no.7 tel-aml1-p1 tctcccaatgggcatggcgtg seq id no.8 e2a-pbx1-p1 caccctccctgacctgtctcggc seq id no.9 abl1-p1 agaccttgaaggaggacacc
10、所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端淬灭基团连接；用于检测tel-aml1融合基因的探针5’端标记为hex荧光修饰，3’端标记为bhq1淬灭修饰；用于检测e2a-pbx1融合基因的探针5’端标记为cy5荧光修饰，3’端标记为bhq2淬灭修饰；用于检测abl1基因(内参)的探针5’端标记为rox荧光修饰，3’端标记为bhq2淬灭修饰。
11、本发明提供如第一方面所述的引物和探针在制备急性淋巴细胞白血病融合基因扩增检测检测试剂盒中的应用，所述试剂盒，组成成分包括dpcrbuffer混合液、酶反应液混合液、2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因阴性质控品、2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因强阳性质控品、2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因弱阳性质控品；所述dpcrbuffer混合液中包含tris-hcl(ph8.5)、kcl、mgcl2、dntps(含dutp)及上述4对引物探针对；所述酶反应液混合液中包含逆转录酶、热启动taq酶、udg酶和rnasin。
12、本发明提供一种急性淋巴细胞白血病融合基因多重数字pcr检测的方法，包括以下步骤：
13、1)分析ncbi的基因组数据库中人类tel-aml1和e2a-pbx1融合基因的序列，针对保守区设计特异性的引物和探针，提高了检测的可靠性和准确度。同时设置了abl1基因作为内参，用于整个反应体系的质量控制。
14、2)通过dpcr仪进行样本自动化检测；通过一步法dpcr反应，特异性扩增人类tel-aml1和e2a-pbx1融合基因的目标序列；
15、3)通过图像分析tel-aml1和e2a-pbx1融合基因阴性和阳性液滴数量，利用泊松分布计算所述反应体系中各融合基因的拷贝数，并得到样本各融合基因的定量检测结果。
16、4)通过tel-aml1和e2a-pbx1融合基因阳性质控品和阴性质控品的质量控制，确保检测结果的有效性。
17、基于以上技术方案发明的试剂盒包括：(1)所述试剂盒包括上述dpcrbuffer混合液、引物探针混合液、酶反应液混合液以及tel-aml1和e2a-pbx1融合基因阴性质控品、tel-aml1和e2a-pbx1融合基因强阳性质控品、tel-aml1和e2a-pbx1融合基因弱阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
18、根据本发明的一个优选实施方案，引物的浓度均为400-800nm，探针的浓度为200-400nm；优选地，引物的浓度均为600nm，探针的浓度为250nm。
19、根据本发明的另一个优选实施方案，酶反应液混合液由逆转录酶、热启动taq酶、udg酶、rnasin和酶稀释液组成。
20、根据本发明的另一个优选实施方案，逆转录酶用量为20～60u/人份、0.2～0.6uudg酶，热启动taq酶用量为2～6u/人份、rnasin用量为10～25u/人份，酶稀释液为水。
21、根据本发明的另一个优选实施方案，dpcrbuffer混合液中包含tris-hcl(ph8.5)、kcl、mgcl2、dntps(含dutp)及上述4对引物探针对。
22、根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于pcr扩增的最佳反应温度和时间为：37℃消化10min，55℃逆转录60min，1个循环；95℃，3min，1个循环；最后95℃，15s，55℃，55s，45个循环。
23、根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是外周血或骨髓。
24、相对于现有技术，本发明的有益效果为：
25、(1)通过定量检测急性淋巴细胞白血病(all)等血液系统中tel-aml1和e2a-pbx1融合基因表达水平，有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。
26、(2)提取rna以后，使用一步法直接用于ddpcr检测，这不仅大大方便了用户操作，而且还提高了检测指标的一致性，实用性和可靠性均得到改善。
27、(3)由于内参基因abl1在细胞中的表达相对恒定，因此，本试剂盒中选择abl1作为内参，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。
28、(4)采用上述方案，采用本发明的急性淋巴细胞白血病融合基因扩增检测检测试剂盒是一种操作简单、稳定性好且准确度高的试剂盒及检测方法。
1.一种基于数字pcr定量检测急性淋巴细胞白血病相关融合基因表达的引物组合，其特征在于，包括：根据2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因：tel-aml1和e2a-pbx1的基因序列设计的多条特异性引物，以及根据正常的abl1基因序列设设计的内参引物；
2.基于权利要求1所述引物组合的急性淋巴细胞白血病融合基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒，包括dpcrbuffer混合液、酶反应液混合液、2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因阴性质控品、2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因强阳性质控品和2种急性淋巴细胞白血病相关融合基因弱阳性质控品；所述dpcrbuffer混合液中包含tris-hcl(ph8.5)、kcl、mgcl2、dntps(含dutp)及上述4对引物探针对；所述酶反应液混合液中包含逆转录酶、热启动taq酶、udg酶和rnasin。
3.一种急性淋巴细胞白血病融合基因多重数字pcr检测方法，包括以下步骤：
4.基于权利要求3方法的急性淋巴细胞白血病融合基因多重数字pcr检测试剂盒包括：包括dpcrbuffer混合液、酶反应液混合液以及tel-aml1和e2a-pbx1融合基因阴性质控品、tel-aml1和e2a-pbx1融合基因强阳性质控品、tel-aml1和e2a-pbx1融合基因弱阳性质控品。
5.根据权利要求2所述试剂盒，其特征还在于，dpcrbuffer混合液中，引物的浓度均为400-800nm，探针的浓度为200-400nm。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征还在于，引物的浓度均为600nm，探针的浓度为250nm。
7.根据权利要求2所述试剂盒，其特征还在于，酶反应液混合液由逆转录酶、热启动taq酶、udg酶、rnasin和酶稀释液组成。
8.根据权利要求2所述试剂盒，其特征还在于，逆转录酶用量为20～60u/人份、0.2～0.6uudg酶，热启动taq酶用量为2～6u/人份、rnasin用量为10～25u/人份，酶稀释液为水。
9.根据权利要求2所述试剂盒，其特征还在于，dpcrbuffer混合液包含10mmol/ltris-hcl(ph8.5)、50mmol/lkcl、3mmol/lmgcl2、dntps浓度为0.20mmol/l。
10.根据权利要求2所述试剂盒，其特征还在于，用于pcr扩增的最佳反应温度和时间为：37℃消化10min，55℃逆转录60min，1个循环；95℃，3min，1个循环；最后95℃，15s，55℃，55s，45个循环。
