一种用于检测β-乳球蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用与流程

一种用于检测
β
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乳球蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及乳品检测技术领域，具体涉及一种用于检测β
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乳球蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用。


背景技术：

2.营养学研究表明，羊乳及其制品具有营养丰富、易吸收、不易导致过敏等优点。近年来羊乳产业不断发展，已成为我国乳业的重要组成部分。但是我国奶羊场规模小，奶羊生长慢，泌乳期短，产乳量少，且极易受季节的影响，因此羊乳资源相对匮乏，市场价格较高。由于牛乳在外观、营养成分上与羊乳极为相似，所以市场中存在羊乳中掺入牛乳来降低生产成本，达到盈利目的现象。这种行为不仅扰乱经济秩序，欺骗消费者，更损害了牛乳过敏者的身心健康。为了保证羊乳产品的质量，维护消费者利益，急需建立一种能够现场检测羊乳中是否掺入牛乳的快速检验方法。
3.而目前的检验方法有非免疫学方法和免疫学方法，非免疫学方法包括色谱技术、电泳技术、聚合酶链式反应（pcr）技术，检测过程耗时较长，对技术人员和机器设备要求高，检测成本高，不易普及；免疫学方法能够克服非免疫学方法的不足，如酶联免疫吸附（elisa）法和胶体金免疫层析技术等，但是现有的检测方法最低检测线高、准确度低限制了其推广应用。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供一种用于检测β
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乳球蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用。
5.本发明采用胶体金免疫层析试纸制备试纸条，该试纸条包括样品垫、金标垫、nc膜和吸水垫；其中金标垫中含有胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体，nc膜上设置有t检测线和c质控线，其中t检测线喷涂有鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体，c质控线喷涂有羊抗鼠igg的抗体。
6.本发明采用的技术方案之一为：一种用于检测β
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乳球蛋白的胶体金免疫层析试纸，所述试纸包括金标垫、样品垫、吸水垫和nc膜，所述金标垫中含有胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体，所述金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体以鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体量记为0.25μg/cm2，所述nc膜上设置有t检测线，所述t检测线上鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体以牛β
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乳球蛋白单克隆抗体量计为0.00625μg/cm2。
7.进一步地，所述nc膜上还设置有c质控线，所述c质控线上含有羊抗鼠igg的抗体，所述c质控线上羊抗鼠igg的抗体以羊抗鼠igg抗体量计为0.00625μg/cm2。
8.本发明采用的技术方案之二为：一种本发明所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括：
s1：将胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体溶液喷涂至金标垫上；s2：将鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体溶液喷涂至nc膜的t检测线上；s3：将羊抗鼠igg抗体溶液喷涂至nc膜的c质控线上；s4：将金标垫、样品垫、吸水垫、nc膜组装成试纸；所述金标垫上胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体以鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体量记为0.25μg/cm2；所述t检测线上鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体以牛β
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乳球蛋白单克隆抗体量计为0.00625μg/cm2；所述c质控线上羊抗鼠igg的抗体以羊抗鼠igg抗体量计为0.00625μg/cm2。
9.进一步地，本发明一个实施例中，包括：s5：鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体的制备及纯化；s6：胶体金制备，鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体胶体金标记及纯化；s7：将胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体溶液喷涂至金标垫上，所述金标垫上胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体以鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体量记为0.25μg/cm2；s8：用pbs缓冲液制备鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体溶液，并采用喷金点膜仪喷涂至nc膜的t检测线上；所述t检测线上鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体以牛β
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乳球蛋白单克隆抗体量计为0.00625μg/cm2；s9：用pbs缓冲液制备羊抗鼠igg抗体溶液，并采用喷金点膜仪喷涂至nc膜的c质控线上；所述c质控线上羊抗鼠igg的抗体以羊抗鼠igg抗体量计为0.00625μg/cm2；s10：将金标垫、样品垫、吸水垫和nc膜组装成试纸。
10.进一步地，本发明一个实施例中，所述步骤s5中鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体的制备及纯化过程：s11：动物免疫：用牛乳β
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lg蛋白作为抗原免疫雌性balb/c小鼠，免疫剂量为30μg/只，第14天，注射等量量福氏不完全佐剂乳化的抗原，第21天，再次免疫；30天后，剂量减半，进行加强免疫一次；s12：细胞融合：将s11中得到的免疫小鼠脾细胞和ns
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1骨髓瘤细胞以5:1的比例混合，在50%peg作用下进行融合。将融合后的细胞悬液于37℃、5%的co2内培养；s13：杂交瘤细胞筛选：融合5天后，加入hat培养基，10天后交换ht培养基，一段时间后用间接elisa法进行抗体筛选，筛选出对牛乳β
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乳球蛋白特异性强，对羊β
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乳球蛋白亲和性低的单克隆抗体并进行单克隆抗体细胞株的鉴定；s14：将阳性的杂交瘤细胞用有限稀释法进行亚克隆，扩大培养杂交瘤细胞并进行纯化，获得单克隆抗体，所述单克隆抗体的效价＞1:204800，置于
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80℃保存。
11.进一步地，本发明一个实施例中，所述步骤s6中胶体金制备，鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体胶体金标记及纯化的具体过程：首先采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，然后取5ml制备好的胶体金，加入0.2 mol/l的k2co3溶液调节ph至7.5，边搅拌边加入浓度为1mg/ml盐析纯化抗体至浓度为10μg/ml，静置30min；加入550μl10%的bsa溶液至bsa浓度为1%，静置30 min后在4℃的条件下静置2h，在1500rpm、4℃下离心30 min，取上清液再次在12000 rpm、4℃下离心30min，取沉淀复
溶再离心，然后用0.1 ml的预冷保存液重悬沉淀，所述预冷保存液为ph=8.5的ris
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hcl、海藻糖和bsa的混合液，所述混合液中tris
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hcl浓度为0.01mol/l，海藻糖浓度为10%，bsa浓度为1%。
12.本发明的胶体金免疫层析试纸在制备检测羊乳中牛β
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乳球蛋白的检测产品中的应用。
13.一种羊乳中牛β
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乳球蛋白检测试剂盒，包含本发明所述胶体金免疫层析试纸。
14.一种羊乳中牛β
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乳球蛋白的检测方法，以本发明提供的胶体金免疫层析试纸对待检测样品进行检测。
15.本发明的胶体金免疫层析试纸检测羊乳中牛β
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乳球蛋白的检测过程为：将待测脱脂羊乳滴入样品垫中，若样品中含有牛乳β
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乳球蛋白，待测样品中的牛乳β
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乳球蛋白与胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体结合，在毛细管作用下，牛乳β
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乳球蛋白先和胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体形成复合体并沿nc膜向前移动，到达t检测线时，形成“胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体
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牛乳β
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乳球蛋白
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鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体”复合体（因为鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体可以结合牛乳β
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乳球蛋白的不同抗原表位），使得胶体金富集在t检测线上，形成红色层析线；未能和牛乳β
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乳球蛋白结合的胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体会直接通过t检测线，到达c质控线后被c质控线上的羊抗鼠igg的抗体捕获形成抗体结合物，使胶体金富集在c质控线上形成红色层析线，此时试纸条上有两条层析线，即为阳性；若样品中无牛乳β
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乳球蛋白，则无法在t检测线上形成“胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体
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牛乳β
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乳球蛋白
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鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体”复合体，此时t检测线上不会产生肉眼可见的显色反应，没有和牛乳β
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乳球蛋白结合的胶体金标记的鼠抗牛β
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乳球蛋白单克隆抗体则会直接到达c质控线后被羊抗鼠igg捕获，使胶体金富集在c质控线上形成红色层析线，此时试纸条上只有一条红色层析线，判为阴性结果。
16.本发明的有益效果：本发明的免疫胶体金层析试纸通过制备含有牛β
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乳球蛋白的单克隆抗体，并利用该抗体，制备出快速检测羊乳中牛β
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乳球蛋白的胶体金免疫层析试纸条进行牛乳β
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乳球蛋白检验；检验过程中只需一滴样品，3min即可出结果，羊乳中掺入的牛乳β
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乳球蛋白成分的最低检测线为0.4μg/ml，且对羊乳不呈现交叉反应。具有操作简单、成本低、携带方便、方便快速、灵敏度高等优点，检测过程不需要专业技术，任何人都可以现场操作，应用前景广泛。
17.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
18.构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
19.图1是本发明实施例的胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；图2是本发明实施例的试纸理论检测结果示意图；
图3是本发明实施例的部分试纸条灵敏性检测图。
具体实施方式
20.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
21.实施例1动物免疫：用牛乳β
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lg蛋白作为抗原免疫4
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6周龄的雌性balb/c 小鼠6只，免疫剂量为30μg/只，第14天，在小鼠背部皮下分点注射等体积量福氏不完全佐剂乳化的抗原，剂量不变；第21天，再次免疫；30天后，剂量减半，加强免疫一次，免疫结束三天后进行细胞融合；细胞融合：将分离的免疫小鼠脾细胞和ns
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1骨髓瘤细胞以5:1的比例混合，在50%peg作用下按照常规方法进行融合。将融合后的细胞悬液加入96孔培养板中，每孔20μl，在37℃、5%的co2的环境下培养；筛选杂交瘤细胞：融合后第5天，在培养板中每孔补加hat培养基，10天后交换ht培养基100μl。当融合细胞群落长至孔底面积的1/4时，取上清液用间接elisa法进行抗体筛选；单克隆抗体细胞株的鉴定：采用棋盘滴定法包被β
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乳球蛋白抗原，以浓度为5μg/ml，每孔150μl的量加入到96孔酶标板中，4℃下过夜，洗板三次；再用排枪加入封闭液，每孔150μl，37℃孵育30 min，洗板三次；最后吸入融合成功的细胞上清液，采用间接elisa方法检测上清液，即加入浓度为1/5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，每孔100μl，置于37℃孵育40min，洗板6次，以免疫前正常小鼠的血清作为阴性对照，在波长450 nm处测定od值，测定p/n＞2.1为阳性。
22.单克隆抗体的制备及效价检测：将阳性杂交瘤细胞孔用有限稀释法进行亚克隆。扩大培养杂交瘤细胞，将细胞浓度调至5
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106个/ml，取balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml的石蜡油，7天后注射1ml的杂交瘤细胞，7
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10天后，收集腹水，经4000rpm离心5min，去除上层脂肪和底部沉淀，吸取上清液。腹水参照hitrap protein a亲和层析说明书进行纯化，获得单克隆抗体，置于
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80℃保存。用间接elisa检测抗体效价，如表1所示，最终获得单克隆抗体的效价＞1:204800。
23.表1间接elisa法测定单克隆抗体的效价为了检验单克隆抗体的纯化及纯度，本发明采用饱和硫酸铵三步沉淀法进行抗体的纯化检验，具体步骤如下：取10ml免疫血清加入10mlpbs缓冲液混匀，逐滴缓慢加入20ml的饱和(nh4)2so4溶液，配成50%的(nh4)2so4溶液，4℃静置50min。将沉淀3000 r/min、4℃下离心30min，沉淀用
12 ml的pbs缓冲液复溶；搅拌均匀，加入8ml饱和(nh4)2so4溶液，4℃下静置1h，再次3000r/min、4℃条件下离心30min，加入12mlpbs缓冲液复溶蛋白沉淀；搅拌均匀，滴加6ml饱和(nh4)2so4溶液，4℃下静置1h，继续离心，用10ml 0.01 mol/l的pbs缓冲液溶解沉淀，转入透析袋中，以0.001mol/l的pbs缓冲液为透析液，在4℃透析4
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5次，换液2
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3次。用1