本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种核酸组合产品、检测试剂盒及微流控芯片。
背景技术：
：随着社会经济水平和人类精神水平的提高，饲养宠物猫的人越来越多。据了解，2019年全国城镇宠物犬猫数量达到9915万只，比2018年增长766万只；其中宠物猫只数为4412万只，比2018年增长8.6％。然而，目前的宠物医疗行业的疾病检测技术水平普遍较低，猫的常发病和新发病也在呈逐年上升趋势，常见猫传染性病毒包括猫细小病毒、猫冠状病毒、猫疱疹病毒i型、猫杯状病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫星状病毒、猫轮状病毒、猫牛痘病毒、猫呼肠弧病毒等数十种，这些可传染性病毒容易影响猫的健康。此外，猫传染性病毒存在人兽共患的风险，也容易影响人类的身体健康。因此，为了有效防止猫病毒性疾病的蔓延扩大，研制出能够快速、准确地判断猫传染性病毒的种类的产品，对猫健康和人类身体健康具有重要的现实意义。目前针对猫传染性病毒的检测方法主要有免疫法和荧光pcr法。免疫法是通过抗原抗体的特异性结合来检测目的蛋白，免疫法检测试剂的检测对象为样本中病毒产生的抗体或者病毒表面抗原，此检测方法的窗口期较长，对于疾病的早起筛查作用有限，同时其灵敏度及检测特异性都相对较低，容易产生结果错判。荧光pcr法是在pcr过程中通过检测荧光信号的实时变化，对目的基因进行检测分析。传统的荧光pcr法的通量低，基本上只能针对一种病原体进行检测。技术实现要素：基于此，有必要提供一种能够同时检测至少两种寄生于猫的致病性病毒且检测灵敏度高的核酸组合产品。一种核酸组合产品，包括检测引物对，所述检测引物对包括如下引物对中的至少两种：序列如seqidno.1及seqidno.2所示的猫细小病毒引物对、序列如seqidno.4及seqidno.5所示的猫冠状病毒引物对、序列如seqidno.7及seqidno.8所示的猫疱疹病毒i型引物对、序列如seqidno.10及seqidno.11所示的猫杯状病毒引物对、序列如seqidno.13及seqidno.14所示的猫白血病病毒引物对、序列如seqidno.16及seqidno.17所示的猫免疫缺陷病毒引物对、序列如seqidno.19及seqidno.20所示的猫星状病毒引物对、序列如seqidno.22及seqidno.23所示的猫轮状病毒引物对、序列如seqidno.25及seqidno.26所示的猫牛痘病毒引物对、和序列如seqidno.28及seqidno.29所示的猫呼肠弧病毒引物对。上述核酸组合产品能够一次性检测待测样品中的至少两种猫传染性病毒，特异性好且检测灵敏度较高。在其中一个实施例中，还包括与所述检测引物对对应的检测探针，与所述检测引物对对应的检测探针包括：序列如seqidno.3所示的猫细小病毒探针、序列如seqidno.6所示的猫冠状病毒探针、序列如seqidno.9所示的猫疱疹病毒i型探针、序列如seqidno.12所示的猫杯状病毒探针、序列如seqidno.15所示的猫白血病病毒探针、序列如seqidno.18所示的猫免疫缺陷病毒探针、序列如seqidno.21所示的猫星状病毒探针、序列如seqidno.24所示的猫轮状病毒探针、序列如seqidno.27所示的猫牛痘病毒探针、和序列如seqidno.30所示的猫呼肠弧病毒探针；与所述检测引物对对应的检测探针上连接有荧光基团。在其中一个实施例中，所述检测引物对包括所述猫细小病毒引物对、所述猫冠状病毒引物对、所述猫疱疹病毒i型引物对、所述猫杯状病毒引物对、所述猫白血病病毒引物对、所述猫免疫缺陷病毒引物对、所述猫星状病毒引物对、所述猫轮状病毒引物对、所述猫牛痘病毒引物对、和所述猫呼肠弧病毒引物对；所述检测引物对分为多组，同一组内的不同检测引物对对应的检测探针上连接的荧光基团不同。在其中一个实施例中，所述检测引物对分为五组；第一组包括所述猫细小病毒引物对和所述猫冠状病毒引物对，第二组包括所述猫疱疹病毒i型引物对和所述猫杯状病毒引物对，第三组包括所述猫白血病病毒引物对和所述猫免疫缺陷病毒引物对，第四组包括所述猫星状病毒引物对和所述猫牛痘病毒引物对，第五组包括所述猫轮状病毒引物对和所述猫呼肠弧病毒引物对。在其中一个实施例中，各组内的各检测引物对对应的所述检测探针上连接的荧光基团选自fam、hex、vic、cy5、rox、texsared及quasar705中的一种。在其中一个实施例中，所述核酸组合产品还包括序列如seqidno.31及seqidno.32所示的内标引物对，和序列如seqidno.33所示的内标探针，所述内标探针上连接有与所述检测探针不同的荧光基团。一种检测试剂盒，包括上述的核酸组合产品。一种微流控芯片，包括至少一个微流控单元，所述微流控单元包括反应腔，所述反应腔内设有上述的核酸组合产品中的检测引物对和与所述检测引物对对应的检测探针。在其中一个实施例中，所述微流控单元还包括样本腔、裂解腔、裂解液储存腔、洗脱液储存腔、清洗液储存腔、缓冲腔及废液腔；所述样本腔、所述裂解腔、所述缓冲腔及所述反应腔依次连通，所述裂解液储液腔与所述裂解腔连通，所述洗脱液储存腔和所清洗液储存腔均与所述缓冲腔连通，所述缓冲腔与所述反应腔之间设有用于纯化核酸的滤件。在其中一个实施例中，所述反应腔设有五个反应室，其中至少有两个所述反应室中的检测引物对不同。附图说明图1为一实施方式的微流控单元的结构示意图。附图标记：10、微流控单元；100、样本腔；101、加样孔；102、第一阀；110、裂解液储液腔；120、裂解腔；130、清洗液储存腔；131、第一腔；132、第二腔；140、缓冲腔；150、洗脱液储存腔；160、选择腔；170、核酸腔；180、反应腔；181、进样通道；182、分样室；183、反应室；191、第一废液室；192、第二废液室；193、第三废液室；194、第二阀。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文中，猫致病性病毒是指寄生于猫中且容易使得猫患病的病毒。本发明一实施方式提供了一种核酸组合产品，该核酸组合产品能够一次性检测待测样品中的至少两种猫传染性病毒，且检测灵敏度较高；该核酸组合产品能够用于制备检测猫致病性病毒的微流控芯片或者检测试剂盒。具体地，待测样品为肛拭子、呼吸道拭子或血液。具体地，核酸组合产品包括检测引物对，检测引物对包括如下引物对中的至少两种：序列如seqidno.1及seqidno.2所示的猫细小病毒引物对、序列如seqidno.4及seqidno.5所示的猫冠状病毒引物对、序列如seqidno.7及seqidno.8所示的猫疱疹病毒i型引物对、序列如seqidno.10及seqidno.11所示的猫杯状病毒引物对、序列如seqidno.13及seqidno.14所示的猫白血病病毒引物对、序列如seqidno.16及seqidno.17所示的猫免疫缺陷病毒引物对、序列如seqidno.19及seqidno.20所示的猫星状病毒引物对、序列如seqidno.22及seqidno.23所示的猫轮状病毒引物对、序列如seqidno.25及seqidno.26所示的猫牛痘病毒引物对、和序列如seqidno.28及seqidno.29所示的猫呼肠弧病毒引物对。猫细小病毒引物对用于检测猫细小病毒(felinepanleucopeniavirus，fpv)，猫冠状病毒引物对用于检测猫冠状病毒(felinecoronavirus，fcov)，猫疱疹病毒i型引物对用于检测猫疱疹病毒i型(felineherpesvirus，fhv-1)，猫杯状病毒引物对用于检测猫杯状病毒(felinecalicivirus，fcv)，猫白血病病毒引物对用于检测猫白血病病毒(felineleukemiavirus，felv)，猫免疫缺陷病毒引物对用于检测猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus，fiv)，猫星状病毒引物对用于检测猫星状病毒(felineastrovirus，fastv)，猫轮状病毒引物对用于检测猫轮状病毒(felinerotavirus，frov)，猫牛痘病毒引物对用于检测猫牛痘病毒(felinecowpoxvirus，fcowv)，猫呼肠弧病毒引物对用于检测猫呼肠弧病毒felinereovirus，frev)。在其中一个实施例中，核酸组合产品还包括与检测引物对对应的检测探针，检测探针上连接也有荧光基团。进一步地，与检测引物对对应的检测探针包括：序列如seqidno.3所示的猫细小病毒探针、序列如seqidno.6所示的猫冠状病毒探针、序列如seqidno.9所示的猫疱疹病毒i型探针、序列如seqidno.12所示的猫杯状病毒探针、序列如seqidno.15所示的猫白血病病毒探针、序列如seqidno.18所示的猫免疫缺陷病毒探针、序列如seqidno.21所示的猫星状病毒探针、序列如seqidno.24所示的猫轮状病毒探针、序列如seqidno.27所示的猫牛痘病毒探针、和序列如seqidno.30所示的猫呼肠弧病毒探针。在其中一个实施例中，与检测引物对对应的检测探针的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。优选地，荧光基团位于检测探针的5’端，淬灭基团位于检测探针的3’端。在其中一个实施例中，检测探针上连接的荧光基团选自fam、hex、vic、cy5、rox、texsared及quasar705中的一种。优选地，检测探针上连接的荧光基团选自fam、hex、cy5及rox中的一种。需要说明的是，荧光基团不限于上述指出的荧光基团，也可以为其他荧光基团。在其中一个实施例中，检测引物对包括序列如seqidno.1及seqidno.2所示的猫细小病毒引物对、序列如seqidno.4及seqidno.5所示的猫冠状病毒引物对、序列如seqidno.7及seqidno.8所示的猫疱疹病毒i型引物对、序列如seqidno.10及seqidno.11所示的猫杯状病毒引物对、序列如seqidno.13及seqidno.14所示的猫白血病病毒引物对、序列如seqidno.16及seqidno.17所示的猫免疫缺陷病毒引物对、序列如seqidno.19及seqidno.20所示的猫星状病毒引物对、序列如seqidno.22及seqidno.23所示的猫轮状病毒引物对、序列如seqidno.25及seqidno.26所示的猫牛痘病毒引物对、和序列如seqidno.28及seqidno.29所示的猫呼肠弧病毒引物对。进一步地，检测引物对分为多组，同一组内的不同检测引物对对应的检测探针上连接的荧光基团不同。更进一步地，检测引物对分为五组；第一组包括猫细小病毒引物对和猫冠状病毒引物对，第二组包括猫疱疹病毒i型引物对和猫杯状病毒引物对，第三组包括猫白血病病毒引物对和猫免疫缺陷病毒引物对，第四组包括猫星状病毒引物对和猫牛痘病毒引物对，第五组包括猫轮状病毒引物对和猫呼肠弧病毒引物对，各组内的检测探针上连接的荧光基团选自fam、hex、vic、cy5、rox、texsared及quasar705中的一种。按照上述的分组，能够避免各组引物探针间的相互干扰，检测结果易读。当然，在一些实施例中，检测引物对也可以为一组，只要不同检测引物对对应的检测探针上连接的荧光基团不同，以能够区分不同检测引物对即可。在其中一个实施例中，上述核酸组合产品还包括序列如seqidno.31及seqidno.32所示的内标引物对，和序列如seqidno.33所示的内标探针，内标探针上连接有与检测引物对对应的检测探针不同的荧光基团。上述核酸组合产品通过检测引物对及检测探针的巧妙设计，避免了多个检测引物对和对应的检测探针的相互干扰，能够一次性同时检测至少两种猫致病性病毒。并且经证实，使用上述核酸组合产品检测时特异性好，抗干扰能力强，检测结果准确性高，灵敏度达到100copies/ml。上述核酸组合产品能够同时检测至少两种寄生于猫的致病性病毒，且检测灵敏度较高，抗干扰能力强，能够用于制备检测猫致病性病毒的微流控芯片或者检测试剂盒。基于此，本发明一实施方式还提供了一种上述核酸组合产品在制备检测猫致病性病毒的微流控芯片或者检测试剂盒中的应用。此外，本发明一实施方式提供了一种检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述核酸组合产品。在其中一个实施例中，还包括核酸提取试剂、清洗液、洗脱液及pcr反应试剂中的至少一种。具体地，核酸提取试剂包括裂解液。进一步地，裂解液包括终浓度为1.5mol/l～6.5mol/l的盐酸胍、终体积百分数为35％～55％的c2h5oh、终浓度为10mmol/l～100mmol/l的tris-hcl及终体积百分数为5％～25％的曲拉通x-100。曲拉通x-100的作用是作为一种表面活性剂参与病毒结构裂解。优选地，裂解液包括终浓度为4.5mol/l～6.5mol/l的盐酸胍，终体积百分数为40％～50％的c2h5oh、终浓度为30mmol/l～50mmol/l的tris-hcl及终体积百分数为15％～20％的曲拉通x-100。具体地，清洗液用于清洗纯化核酸。清洗液包括第一清洗液和第二清洗液。第一清洗液用于清洗样本裂解后的蛋白质、脂类等大分子物质；第二清洗液用于清洗残留的盐分。进一步地，第一清洗液包括终浓度为0.5mol/l～5mol/l的盐酸胍、终浓度为20mmol/l～250mmol/l的nacl、终浓度为5mmol/l～30mmol/l的tris-hcl和终浓度为30％～50％的c2h5oh。第二清洗液包括终浓度为60mmol/l～250mmol/l的nacl和终体积百分数为50％～80％的c2h5oh。更进一步地，第一清洗液包括终浓度为2mol/l～4mol/l的盐酸胍、终浓度为100mmol/l～200mmol/l的nacl、终浓度为10mmol/l～20mmol/l的tris-hcl和终浓度为35％～45％的c2h5oh。第二清洗液包括终浓度为100mmol/l～200mmol/l的nacl和终体积百分数为60％～80％的c2h5oh。具体地，洗脱液用于洗脱核酸。洗脱液包括终浓度为2mmol/l～20mmol/l的tris-hcl和终浓度为0.2mmol/l～2mmol/l的edta。进一步地，洗脱液包括终浓度为10mmol/l～15mmol/l的tris-hcl和终浓度为0.5mmol/l～1mmol/l的edta。具体地，pcr反应试剂包括datp、dttp、dctp、dgtp、mgcl2、海藻糖、甘露醇、热启动taq酶及逆转录酶。海藻糖在pcr扩增体系中的浓度为10mg/ml～200mg/ml；甘露醇在pcr扩增体系中的浓度为1mg/ml～100mg/ml；datp、dttp、dctp、dgtp在pcr扩增体系中的终浓度为0.1mmol/l～6mmol/l；mgcl2在pcr扩增体系中的终浓度为1mmol/l～20mmol/l；热启动酶在pcr扩增体系中的终浓度为0.01u/μl～0.5u/μl；逆转录酶在pcr扩增体系中的终浓度为0.1u/μl～5u/μl。优选地，海藻糖在pcr扩增体系中浓度为50mg/ml～150mg/ml；甘露醇在pcr扩增体系中的浓度为10mg/ml～50mg/ml；datp、dttp、dctp、dgtp在pcr扩增体系中的终浓度为0.5mmol/l～3mmol/l；mgcl2在pcr扩增体系中的终浓度为5mmol/l～15mmol/l；热启动酶在pcr扩增体系中的终浓度为0.1u/μl～0.3u/μl；逆转录酶在pcr扩增体系中的终浓度为0.5u/μl～3u/μl。上述检测试剂盒包括上述核酸组合产品，能够一次性检测至少两种猫致病性病毒，检测灵敏度较高，抗干扰能力强。本发明一实施方式提供了一种微流控芯片，该微流控芯片包括基体，基体具有旋转中心且基体上设有至少一个微流控单元，旋转中心可以位于基体上，也可以位于基体外。该微流控芯片的检测灵敏较高、抗干扰能力强，能够同时检测至少两种猫致病性病毒。微流控芯片是将生物和化学领域所涉及的基本操作单位集成在一块几平方厘米的芯片上，由微通道网络连接而成，能够极大地缩短样本处理了时间，并通过精密控制液体流动，实现低试剂损耗、低样本量。微流控技术具有高度自动化、高度集成化、消耗样本和试剂量少、污染小等优点。请参阅图1，微流控单元10还包括样本腔100、裂解液储液腔110、裂解腔120、清洗液储存腔130、缓冲腔140、洗脱液储存腔150、选择腔160、核酸腔170、反应腔180及废液腔。具体地，样本腔100用于接收样本。样本腔100上开设有用于加样和连通外界环境的加样孔101。可选地，样本腔100内还预置有内标。通过在样本腔100中预置内标来反应核酸提取及pcr反应体系的有效性，减少假阴性，提高检测的准确度。进一步地，内标包括上述内标引物对及上述内标探针。在一个具体示例中，内标为冻干粉。裂解液储存腔用于储裂解液。裂解液的组成如上文所述，此处不再赘述。裂解腔120与样本腔100和裂解液储存腔均通过微通道连通。裂解腔120为裂解样本的场所。在裂解腔120中，从裂解液储存腔中流入的裂解液作用于从样本腔100流入的样本，在裂解液的作用下，样本中的核酸被释放。可选地，在连通裂解腔120与样本腔100的微通道中设有第一阀102(例如石蜡阀)。通过第一阀102的设置，能够控制样本腔100的样本与内标混合的时间，从而使得样本与内标在充分混合均匀后才流入裂解腔120。可以理解的是，在其他实施例中，裂解腔120与样本腔100之间设有第一阀102的微通道可以用虹吸微通道替代。可以理解的是，在一些实施例中，样本腔100可以省略。当样本腔100省略时，在裂解腔120上开设加样孔101，内标预置于裂解腔120中即可。清洗液储存腔130用于存储清洗液。在图示的实施方式中，清洗液储存腔130包括用于存储第一清洗液的第一腔131和用于存储第二清洗液的第二腔132，第一腔131与第二腔132通过u形微通道而连通，u形微通道的底部到旋转中心的最小距离小于第二腔132到旋转中心的距离，第一腔131和第二腔132均与缓冲腔140连通。u形微通道的设置使得在第一腔131中还存储有第一清洗液时，第一腔131与第二腔132相互隔离，而在第一腔131中的第一清洗液排出到缓冲腔140后，第二腔132与大气连通而储存在第二腔132中的第二清洗液流向缓冲腔140。第一清洗液和第二清洗液的组成如上文所述，此处不再赘述。缓冲腔140与裂解腔120、第一腔131及第二腔132均连通，缓冲腔140为裂解后的样本与清洗液及洗脱液的混合提供场所。裂解腔120中裂解后的样本进入缓冲腔140后，与第一清洗液和第二清洗液混合，清洗释放出的核酸。洗脱液储存腔150与缓冲腔140连通，用于存储洗脱液。洗脱液的组成如上文所述，此处不再赘述。具体地，选择腔160与缓冲腔140连通，且在缓冲腔140与选择腔160之间还设有用于纯化核酸的滤件(例如硅胶膜)。选择腔160与第一废液室191和核酸腔170通过y形管道连通。通过y形管道的设置及控制离心的方向，可以实现裂解样本后的废液及清洗液清洗后的废液到达第一废液室191，而采用洗脱液清洗后的核酸能够到达核酸腔170。核酸腔170与选择腔160连通，为核酸进入反应腔180提供一个缓冲的场所。反应腔180与核酸腔170连通，反应腔180内设有上述核酸组合产品中的检测引物对和与检测引物对对应的检测探针。反应腔180是纯化后的核酸进行pcr反应的场所。具体地，反应腔180包括进样通道181、多个分样室182及与多个分样室182对应的多个反应室183，上述核酸组合产品中的检测引物对和与检测引物对对应的检测探针设于反应室183中。进样通道181具有进口端和出口端，进口端与核酸腔170连通。分样室182用于定量进入反应腔180中的核酸。多个分样室182沿进样通道181的延伸方向依次间隔排布，多个分样室182位于进样通道181的同侧并均与进样通道181连通，反应室183与分样室182连通。可选地，进样通道181为弧形通道，多个分样室182位于进样通道181的外侧且沿进样通道181的周向依次排布，且分样室182沿进样通道181的径向自进样通道181的外周缘向外延伸。弧形通道便于离心时样本的流通。进一步地，多个分样室182的体积相等，且从进样通道181的进口端至出口端方向，分样腔的深度依次减小。这样设置便于核酸样本顺利填满分样腔且分样体积均等。可以理解的是，分样室182可以省略。此时，多个反应室183在进样通道181的延伸方向依次间隔排布，且位于进样通道181的同侧并与进样通道181连通。可选地，在反应室183中，每种检测引物对的上游引物和下游引物的浓度均为50nmol/l～1000nmol/l，每种检测探针的浓度为25nmol/l～500nmol/l。当然，可以理解的是，当内标引物对及内标探针设于样本腔100时，则反应室183中无内标引物对及内标探针。在其中一个实施例中，反应室183内还设有pcr反应试剂。pcr反应试剂如上文所述，此处不再赘述。可选地，至少有两个不同的反应室183中的检测引物对不同，这样设置便于进行高通量检测。当然，不同反应室183中的检测引物对也可以相同，可以根据实际情况进行调整。在一个具体示例中，分样室182为五个，对应地，反应室183为五个，各个反应室183均预置有pcr反应试剂、检测引物对和与检测引物对对应的检测探针。具体地，猫细小病毒引物对、猫冠状病毒引物对和对应的检测探针设置于同一反应室183中；猫疱疹病毒i型引物对、猫杯状病毒引物对和对应的检测探针设置于同一反应室183中；猫白血病病毒引物对、猫免疫缺陷病毒引物对和对应的检测探针设置于同一反应室183中；猫星状病毒引物对、猫牛痘病毒引物对和对应的检测探针设置于同一反应室183中；猫轮状病毒引物对、猫呼肠弧病毒引物对和对应的检测探针设置于同一反应室183中。废液腔包括第一废液室191、第二废液室192和第三废液室193。第一废液室191与第一腔131能连通，且在连通第一废液室191与第一腔131的微通道中设有第二阀194(例如石蜡阀)。通过在连通第一废液室191与第一腔131的微通道中设第二阀194，来控制第一腔131中的第一清洗液流向缓冲腔140的时机。第一废液室191还与样本腔100和第二废液室192连通，使得样本在离心力作用下向反应腔180的方向流动时，原来处于这些微通道中的气体能够向样本腔100移动，从而平衡上述微流控芯片内的气压。此外，样本腔100、裂解液储存腔及样本裂解腔120之间也设置有供气体流动的微通道，进而促进样本向反应腔180流动。第二废液室192用于收集反应腔180溢出的核酸溶液。可以理解的是，在一些实施方式中，第一废液腔可以省略。此时，该第二废液腔与选择腔160直接连通，并与进样通道181的出口端连通，能够同时承装缓冲腔140纯化核酸之后的废液和反应腔180溢出的核酸溶液，并与样本腔100连通。第三废液室193与大气连通，能与洗脱液储存腔150连通，且在连通第三废液室193与洗脱液储存腔150的微通道上设有第三阀(例如石蜡阀)，从而使得在需要将洗脱液流入缓冲腔140时，第三阀开启，从而使洗脱液储存腔150与大气连通而洗脱液存储腔中的洗脱液流入缓冲腔140中。可以理解的是，在一些实施方式中，核酸腔170可以省略。当核酸腔170省略时，选择腔160与反应腔180直接连接。当然，选择腔160也可以同时省略。可选地，微流控芯片大致呈圆片形，微流控芯片包括多个绕圆心均匀分布的微流控单元10。当然，在其他一些实施方式中，微流控芯片的形状还可以是其他形状，例如扇形、矩形、多边形等。微流控芯片上的微流控单元10的数据可以是一个、三个、四个、五个、七个等。上述微流控芯片至少包括以下优点：(1)上述微流控芯片的反应腔180中设有上述检测引物对和与检测引物对对应的检测探针，能够同时识别猫细小病毒、猫冠状病毒、猫疱疹病毒i型、猫杯状病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫星状病毒、猫轮状病毒、猫牛痘病毒、猫呼肠弧病毒，灵敏度高、特异性好。经证实，该微流控芯片对上述病毒的检测灵敏度均可达到100copies/ml，达到了单重实时荧光rt-pcr检测的敏感度；并且该微流控芯片只对上述病毒有扩增信号，对于其他种属相近或环境类似的病毒则没有扩增，抗干扰能力强。上述微流控芯片能快速地鉴定样本中的相关病原体，大大增加了检测项目通量，节省了成本。(2)上述微流控芯片设有储液腔及相应的控制结构，分别将清洗液、裂解液及洗脱液预置于微流控芯片上的储液腔的不同腔室中，通过控制相应的控制结构即可控制样本裂解和核酸的纯化，不需通过额外添加清洗液、裂解液及洗脱液的方式进行样本裂解与核酸的纯化，实现了核酸提取与pcr扩增反应全自动化，大大简化检测过程，节约检测时间和样本。(3)上述微流控芯片将核酸提取及pcr反应的相关试剂预置在微流控芯片上，形成一个高封闭的体系，试剂不易泄露，安全性大大加强，同时核酸也不容易被污染。(4)上述微流控芯片设置样本腔100和缓冲腔140，并将内标预置于样本腔100中，使得内标参与核酸提取和pcr扩增整个过程，降低假阴性率。此外，本发明一实施方式还提供了一种上述微流控芯片的制备方法，该制备方法包括将pcr反应试剂、内标和上述检测引物对及检测引物对对应的检测探针制备成冻干粉的步骤。具体地，分别将pcr反应试剂、内标和上述检测引物对及检测探针在-80℃条件下冻存8h～10h。然后进行真空冷冻干燥，冷冻干燥结束后将相应的试剂置于微流控芯片的腔室中，并封装。具体真空冷冻干燥工艺参数如下表1：表1按照上述工艺进行冷冻干燥之后的pcr反应试剂、内标及和上述检测引物对及检测探针具有能常温储运、延长试剂效期。上述微流控芯片的使用方法包括步骤s110～步骤s130。具体为：步骤s110、提取核酸。具体地，将样本加入样本腔100中，在离心力作用下，样本流入样本腔100，与预置在样本腔100中的内标干粉混合后，开启第一阀102，使得样本与内标的混合物进入裂解腔120；裂解液储存腔中的裂解液流入裂解腔120中，样本与裂解液混合，将样本裂解，释放核酸；样本经裂解液充分裂解后进入缓冲腔140，样本的核酸及内标均与滤件结合，其余组分则在离心力作用下进入第一废液室191；然后开启设置在第一腔131与第一废液时之间的第二阀194，第一腔131中的第一清洗液从第一腔131中的清洗液进入缓冲腔140，对核酸进行清洗纯化，在第一腔131中的第一清洗液排空之后，第二腔132中的第二清洗液流入缓冲腔140中，继续清洗核酸；接着开启第三阀，洗脱液储存腔150中的洗脱液进入缓冲腔140将核酸及内标从滤件上洗脱，得到核酸溶液。步骤s130、用提取的核酸进行pcr扩增pcr反应。具体地，将微流控芯片进行反向离心(与提取核酸步骤中的离心方向相反的离心，例如，提取核酸的步骤中按照顺时针离心，则此时采用逆时针离心)，使得缓冲腔140中被洗脱下的核酸及内标进入反应腔180中；核酸溶液与反应腔180中预置的pcr反应试剂、检测引物对和检测探针混合，形成pcr扩增反应体系；然后进行pcr扩增反应，并对扩增结果进行检测。进一步地，pcr反应程序为：48℃逆转录10min～30min，95℃预变性1min～10min；95℃变性5s～15s，60℃退火延伸30s～40s，40个～45个循环。上述微流控芯片的使用方法简捷易操作。具体实施例以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。实施例1实施例1的微流控芯片的微流控单元的结构如图1所示。微流控单元包括样本腔、裂解液储液腔、裂解腔、清洗液储存腔、缓冲腔、洗脱液储存腔、选择腔、核酸腔、反应腔及废液腔。微流控单元中：样本腔中设置有内标，内标为冻干粉。内标由内标引物对及内标探针组成，内标引物对及内标探针的具体序列见表2；裂解液储存腔中存储有裂解液，裂解液由终浓度为5mol/l的盐酸胍、终体积百分数为40％的c2h5oh、终浓度为40mmol/l的tris-hcl及终体积百分数为15％的曲拉通x-100组成。清洗液储存腔包括存储有第一清洗液的第一腔和存储有第二清洗液的第二腔。第一清洗液由终浓度为4mol/l的盐酸胍、终浓度为100mmol/l的nacl、终浓度为10mmol/l的tris-hcl和终体积百分数为37％的c2h5oh组成。第二清洗液由终浓度为120mmol/l的nacl和终浓度为75％的c2h5oh组成。脱液储存腔存储有洗脱液，洗脱液由终浓度为10mmol/l的tris-hcl和终浓度为0.45mmol/l的edta组成。反应腔设有五个反应室，五个反应腔从左到右依次编号为1～5。反应室中设有pcr反应试剂、检测引物对和对应的检测探针，每个反应腔的容积为20μl。检测引物对由猫细小病毒引物对、猫冠状病毒引物对、猫疱疹病毒i型引物对、猫杯状病毒引物对、猫白血病病毒引物对、猫免疫缺陷病毒引物对、猫星状病毒引物对、猫轮状病毒引物对、猫牛痘病毒引物对和猫呼肠弧病毒引物对组成。编号1的反应腔中设有猫细小病毒引物对、猫细小病毒探针、猫冠状病毒引物对及猫冠状病毒探针；编号2的反应腔中设有猫疱疹病毒i型引物对、猫疱疹病毒i型探针、猫杯状病毒引物对及猫杯状病毒探针；编号3的反应腔中设有猫白血病病毒引物对、猫白血病病毒探针、猫免疫缺陷病毒引物对及猫免疫缺陷病毒探针；编号4的反应腔中设有猫星状病毒引物对、猫星状病毒探针、猫轮状病毒引物对及猫轮状病毒探针；编号5的反应腔中设有猫牛痘病毒引物对、猫牛痘病毒探针、猫呼肠弧病毒引物对和猫呼肠弧病毒探针。检测引物对及对应的检测探针的序列具体见表2。表2其中，序列seqidno.3的5’端、序列seqidno.9的5’端、序列seqidno.15的5’端、序列seqidno.21的5’端及序列seqidno.24的5’端均连接有fam，3’端均连接有bhq1。序列seqidno.6的5’端、序列seqidno.12的5’端、序列seqidno.18的5’端、序列seqidno.27的5’端及序列seqidno.30的5’端均连接有hex，3’端均连接有bhq1。序列seqidno.33的5’端连接有rox。各检测探针的3’端均连接有bhq2。pcr反应试剂由dntps(datp、dttp、dctp和dgtp)、mgcl2、海藻糖、甘露醇、热启动taq酶及逆转录酶组成，其中，dntps的物质的量为45nmol，mgcl2的物质的量为80nmol，海藻糖的质量为2mg，甘露醇的质量为0.6mg，热启动taq酶为2.5u及逆转录酶12.5u。实施例2(1)收集10个猫致病性病毒阳性样本及8个阴性样本，并编号1～18。1号样本为猫细小病毒阳性样本，2号样本为猫冠状病毒阳性样本，3号样本为猫疱疹病毒i型阳性样本，4号样本为猫杯状病毒阳性样本，5号样本为猫白血病病毒阳性样本，6号样本为猫免疫缺陷病毒阳性样本，7号样本为猫星状病毒阳性样本，8号样本为猫轮状病毒阳性样本，9号样本为猫牛痘病毒阳性样本，10号样本为猫呼肠弧病毒阳性样本，11号样本为犬副流感病毒、12号样本为轮状病毒、13号样本为衣原体、14号样本为支原体、15号样本为犬腺病毒i型、16号样本为犬腺病毒ii型、17号样本为犬瘟热病毒、18号样本为狂犬病毒。(2)使用实施例1的微流控芯片分别检测步骤(1)的18个样本，每个样本的检测步骤具体如下：1)将200μl样本加入加样池中，在2500rpm转速下顺时针离心1min。2)在2500rpm转速下顺时针离心1min后，开启第一阀，使得样本和内标进入裂解腔与裂解液混合，随后进入第一废液室。3)在2500rpm转速下顺时针离心1min，并开启第二阀，使得第一清洗液及第二清洗液依次进入缓冲腔后进入第一废液室，清洗位于硅胶膜上的核酸。4)在2500rpm转速下逆时针离心2min，并开启第三阀，使得洗脱液进入缓冲腔，并将核酸及内标从硅胶膜上洗脱下来，形成核酸溶液。5)在2500rpm转速下顺时针离心2min，使得核酸溶液依次进入五个反应室，得到各反应室的pcr扩增反应体系，多余的核酸溶液进入第二废液室。其中，各pcr扩增反应体系的总体积为20μl，具体组成见表3。表3组分浓度dntps2.25mmol/lmgcl24mmol/l海藻糖100mg/ml甘露醇30mg/ml热启动taq酶0.125u/μl逆转录酶0.625u/μl每种病毒检测引物对的正向引物300nmol/l每种病毒检测引物对的反向引物300nmol/l每种病毒的检测探针250nmol/l核酸2.5ng/ul内标引物对的正向引物100nmol/l内标引物对的反向引物100nmol/l内标探针100nmol/l6)进行pcr扩增反应及检测，其中反应条件如下：48℃逆转录10min，95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，40个循环。7)结果判定：根据检测的荧光信号得到检测结果。其中，所有的反应室中pcr反应扩增后内标均应有扩增曲线，则检测结果有效，否则实验结果无效。18个样本的检测结果如表4所示。表4中“ ”表示有相应的荧光信号，“-”表示无相应荧光信号。表4由表4的检测结果可以看出，实施例1的微流芯片能够检测10种猫致病性病毒的特异性好，该微流控芯片只检测相应的猫致病性病毒，对其他种类或型别的病毒，例如犬副流感病毒、轮状病毒、衣原体、支原体、犬腺病毒i型、犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、狂犬病毒等，没有交叉反应或非特异性扩增，准确性高。实施例3用10种猫致病性病的质粒混合样本检测实施例1的微流控芯片的灵敏度。具体地：(1)将以下10种病毒的质粒混合，得到混合质粒样本。其中，混合质粒样本中，每种病毒的质粒的拷贝数相等。(2)将混合质粒样本进行梯度稀释，得到105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml五个浓度的混合质粒样本。(3)按照与实施例2相同的操作对步骤(2)的五个不同浓度的混合质粒样本分别进行检测，检测结果见表5所示，表5中“ ”表示有相应的荧光信号，“-”表示无相应荧光信号。表5由表5可知，实施例1的微流控芯片对于上述10种猫致病性病毒的灵敏度都很高，均达到了100copies/ml。实施例4(1)提供1号对比微流控芯片、2号对比微流控芯片、3号对比微流控芯片、4号对比微流控芯片及5号对比微流控芯片。其中：1号对比微流控芯片与实施例1的微流控芯片大致相同，其不同在于，猫细小病毒引物对的反向引物的序列为：5’-ttaccagcttcttcaatccaaatt-3’(即seqidno.34)。。2号对比微流控芯片与实施例1的微流控芯片大致相同，其不同在于，猫疱疹病毒i型引物对的反向引物的序列为：5’-tcgctcgcctctgccgag-3’(即seqidno.35)。3号对比微流控芯片与实施例1的微流控芯片大致相同，其不同在于，猫白血病病毒引物对的反向引物的序列为：5’-gcagcaactccgtctacctt-3’(即seqidno.36)。4号对比微流控芯片与实施例1的微流控芯片大致相同，其不同在于，猫星状病毒引物对的正向引物的序列为：5’-cctggtaaagtcaaagtgcagaat-3’(即seqidno.37)。5号对比微流控芯片与实施例1的微流控芯片大致相同，其不同在于，猫牛痘病毒引物对的反向引物的序列为：5’-ggagaatcgtaagatattttatcc-3’(即seqidno.38)。(2)采用1号对比微流控芯片、2号对比微流控芯片、3号对比微流控芯片、4号对比微流控芯片及5号对比微流控芯片分别检测猫细小病毒样本、猫疱疹病毒i型样本、猫白血病病毒样本、猫星状病毒样本、猫牛痘病毒样本。检测结果如表6所示表6由表6可知，将相应体系中的正向或反向引物更改后，引物间相互干扰，导致反应体系的扩增特异性降低，造成检测结果的假阳性。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>深圳市刚竹医疗科技有限公司<120>核酸组合产品、检测试剂盒及微流控芯片<160>38<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1catggaccagcaagtacaggaaa23<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acatttgctgcattataacaaccaac26<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3attgctcaagccatagcacaagctgtgg28<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcaacccgatgtttaaaactgg22<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcctattacacgtgcttaccattctg26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tccgaggaattactggtcatcgcgct26<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cgtcagatgtaagggttgctgtta24<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8agccggttaaagtggaggttgt22<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9atccactctccgcgtcctcgtcg23<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10caatcagcatgtggtaaccgtt22<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gcacatcatatgcggctctgat22<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tcggtgtttgatttggcctgggct24<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13aaaccaggagactccgtctgg21<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ggtggtcaggaggacgatatg21<210>15<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cggagacatcaaaccaagaacctcgagc28<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gacatggccacattaataatggc23<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gcgtgcgatcatattctgctg21<210>18<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18ccagggtgcgctgcagataaagaaatatt29<210>19<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19ccatcgttggtctttctttttgc23<210>20<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ggcaaagctttgtagggtttgag23<210>21<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21gccatcaatttctctggttgcgttgg26<210>22<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22gcatttaatgcttttcagtggttg24<210>23<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23cagcaactaccgcagcttcaa21<210>24<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24gctcaagatggagtctactcagcagatggc30<210>25<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25ggtgatgatgcaactctatcatgtagtag29<210>26<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26caaaatacaagacgtcacttttggc25<210>27<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27gttgttatgcgtgcttggtataaggagccc30<210>28<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28cccggattctcgatgaatggt21<210>29<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29cgacccactgctggatacaag21<210>30<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30aacgcctgtgcacgagctgaac22<210>31<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31cacatggcctccaaggagtaa21<210>32<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32tgagggtctctctcttcctcttgt24<210>33<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33ctggaccaccagccccagcaag22<210>34<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34ttaccagcttcttcaatccaaatt24<210>35<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35tcgctcgcctctgccgag18<210>36<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36gcagcaactccgtctacctt20<210>37<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37cctggtaaagtcaaagtgcagaat24<210>38<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38ggagaatcgtaagatattttatcc24当前第1页1 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技术特征：1.一种核酸组合产品，其特征在于，包括检测引物对，所述检测引物对包括如下引物对中的至少两种：
序列如seqidno.1及seqidno.2所示的猫细小病毒引物对、序列如seqidno.4及seqidno.5所示的猫冠状病毒引物对、序列如seqidno.7及seqidno.8所示的猫疱疹病毒i型引物对、序列如seqidno.10及seqidno.11所示的猫杯状病毒引物对、序列如seqidno.13及seqidno.14所示的猫白血病病毒引物对、序列如seqidno.16及seqidno.17所示的猫免疫缺陷病毒引物对、序列如seqidno.19及seqidno.20所示的猫星状病毒引物对、序列如seqidno.22及seqidno.23所示的猫轮状病毒引物对、序列如seqidno.25及seqidno.26所示的猫牛痘病毒引物对、和序列如seqidno.28及seqidno.29所示的猫呼肠弧病毒引物对。
2.根据权利要求1所述的核酸组合产品，其特征在于，还包括与所述检测引物对对应的检测探针，与所述检测引物对对应的检测探针包括：
序列如seqidno.3所示的猫细小病毒探针、序列如seqidno.6所示的猫冠状病毒探针、序列如seqidno.9所示的猫疱疹病毒i型探针、序列如seqidno.12所示的猫杯状病毒探针、序列如seqidno.15所示的猫白血病病毒探针、序列如seqidno.18所示的猫免疫缺陷病毒探针、序列如seqidno.21所示的猫星状病毒探针、序列如seqidno.24所示的猫轮状病毒探针、序列如seqidno.27所示的猫牛痘病毒探针、和序列如seqidno.30所示的猫呼肠弧病毒探针；
与所述检测引物对对应的检测探针上连接有荧光基团。
3.根据权利要求2所述的核酸组合产品，其特征在于，所述检测引物对包括所述猫细小病毒引物对、所述猫冠状病毒引物对、所述猫疱疹病毒i型引物对、所述猫杯状病毒引物对、所述猫白血病病毒引物对、所述猫免疫缺陷病毒引物对、所述猫星状病毒引物对、所述猫轮状病毒引物对、所述猫牛痘病毒引物对、和所述猫呼肠弧病毒引物对；所述检测引物对分为多组，同一组内的不同检测引物对对应的检测探针上连接的荧光基团不同。
4.根据权利要求3所述的核酸组合产品，其特征在于，所述检测引物对分为五组；第一组包括所述猫细小病毒引物对和所述猫冠状病毒引物对，第二组包括所述猫疱疹病毒i型引物对和所述猫杯状病毒引物对，第三组包括所述猫白血病病毒引物对和所述猫免疫缺陷病毒引物对，第四组包括所述猫星状病毒引物对和所述猫牛痘病毒引物对，第五组包括所述猫轮状病毒引物对和所述猫呼肠弧病毒引物对。
5.根据权利要求3所述的核酸组合产品，其特征在于，各组内的各检测引物对对应的所述检测探针上连接的荧光基团选自fam、hex、vic、cy5、rox、texsared及quasar705中的一种。
6.根据权利要求1～5任一项所述的核酸组合产品，其特征在于，所述核酸组合产品还包括序列如seqidno.31及seqidno.32所示的内标引物对，和序列如seqidno.33所示的内标探针，所述内标探针上连接有与所述检测探针不同的荧光基团。
7.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～6任一项所述的核酸组合产品。
8.一种微流控芯片，其特征在于，包括至少一个微流控单元，所述微流控单元包括反应腔，所述反应腔内设有权利要求1～6任一项所述的核酸组合产品中的检测引物对和与所述检测引物对对应的检测探针。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控单元还包括样本腔、裂解腔、裂解液储存腔、洗脱液储存腔、清洗液储存腔、缓冲腔及废液腔；所述样本腔、所述裂解腔、所述缓冲腔及所述反应腔依次连通，所述裂解液储液腔与所述裂解腔连通，所述洗脱液储存腔和所清洗液储存腔均与所述缓冲腔连通，所述缓冲腔与所述反应腔之间设有用于纯化核酸的滤件。
10.根据权利要求9所述的微流控芯片，其特征在于，所述反应腔设有五个反应室，其中至少有两个所述反应室中的检测引物对不同。
技术总结本发明涉及一种核酸组合产品、检测试剂盒及微流控芯片，该核酸组合产品包括以下检测引物对中的至少两种：猫细小病毒引物对、猫冠状病毒引物对、猫疱疹病毒I型引物对、猫杯状病毒引物对、猫白血病病毒引物对、猫免疫缺陷病毒引物对、猫星状病毒引物对、猫轮状病毒引物对、猫牛痘病毒引物对和猫呼肠弧病毒引物对。上述核酸组合产品能够一次性检测待测样品中的至少两种猫致病性病毒，特异性好且检测灵敏度较高。
技术研发人员：游腾飞
受保护的技术使用者：深圳市刚竹医疗科技有限公司
技术研发日：2021.04.01
技术公布日：2021.07.02
