本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法。
背景技术：
表面增强拉曼散射（sers）是一种强大的分析技术，因其超高的灵敏度，窄的光谱带以及在各种环境中的通用性性，广泛用于检测包括小分子，蛋白质和核酸在内的生物标记物。sers信号通常可以可通过金，银和铜纳米粒子（如银纳米球，金纳米球和金纳米棒）增强。与球形贵金属纳米粒子相比，银纳米立方体（agncs）由于具有其几何特征而提供了更大的电场增强。因此，agnc非常适合利用这些优势的sers应用增强的近场。例如，zhu等。通过在还原的氧化石墨烯板上包裹agncs开发出一种sers传感器，用于高度灵敏地检测二硫代氨基甲酸酯杀虫剂，检测限（lod）估计为10ppb。但据我们所知，agncs迄今尚未用作microrna（mirna）检测的sers底物。
酶辅助信号放大技术由于反应条件温和、生物相容性好和催化效率高等优点而广泛用于生化分析中。常用工具酶包括聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、连接酶等。双链特异性核酸酶（dsn）为一种核酸内切酶，因其对dna双链体和rna/dna异源双链体有极强的切割偏好，对单链dna，单链rna和双链rna的活性较小的特性，而在mirna的信号放大中突显出巨大的优势。因此人们开发了许多基于dsn信号放大的传感器用于mirna的检测。如degliangeli等将荧光标记的dna探针固定在金纳米颗粒（aunps）上。当存在目标mirna时，dna-rna异源双链形成并被dsn识别并剪切，使得荧光基团从aunps上释放出来从而检测到荧光信号。目标mirna重复循环杂交酶切，从而释放出更多的荧光基团，实现信号放大。通过荧光信号的改变来实现对目标mirna的检测。
1990年代，gründler等人开发了具有对称结构的直接电加热电极，该电极能够消除加热交流电对电化学信号的干扰，从而导致了加热电极的广泛应用和推广。现已有一系列基于不同材料的加热电极已开发并应用于痕量检测，如用将石墨加热电极用于核黄素的高灵敏检测，将玻碳加热电极用于细胞的高敏感检测。此外，将加热电极与生物酶结合可提高酶活性，从而提高检测灵敏度。例如，wu等人将加热电极与核酸外切酶iii结合使用，可对实现对hg2 的高灵敏的电化学检测。但是据我们所知，加热电极还没有与双链特异性核酸酶（dsn）相结合，进行dsn辅助的目标循环扩增，并用sers方法进行mirna的检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，包括如下步骤：
（1）sers标签agncs/4-mba/sdna的组装
取10μm10μl巯基修饰的sdna，加入5mm10μltcep，室温避光放置1h，对二硫键进行还原，然后将其混入80μl8nm的agncs溶液中，加入300μl的pbss溶液混合均匀，37℃孵育过夜得到agncs/sdna；接着向溶液中加入1mm4μl的对巯基苯甲酸溶液，继续孵育2h；然后将溶液离心，去除上清液后重新分散在400μl的pbss溶液中，重复离心3次后4℃保存备用；
（2）dsn辅助目标循环信号放大过程；
将金热电极haue依次用1μm和0.05μm的氧化铝粉在抛光布上进行抛光，然后在超纯水中超声清洗3min，置于0.5mnaoh溶液中−0.35-1.35v电位间连续扫描500圈，接着置于5mmh2so4溶液中−0.35-1.5v电位间扫描20圈，对电极进行电化学清洗，最后用超纯水清洗冲洗，氮气吹干；
在固定pdna前，将10μm5μl巯基修饰的pdna与5mm5μltcep混匀室温避光处理1h以断裂二硫键，然后取10μl滴到清洗干净的金热电极表面，4℃组装过夜得到pdna/haue；超纯水冲洗后浸泡在2mmmch溶液中，室温封闭1h得到mch/pdna/haue，同样用超纯水对电极表面进行清洗；
取179μl一定浓度的mirna-21，加入20μl的10×dsnbuffer和0.5u/μl1μldsn酶配置成总体积为200μl的酶切液；将mch/pdna/haue浸泡于酶切液中进行酶切反应60min；酶切温度控制为55℃；反应完成后，向酶切液中加入10mm50μledta于55℃恒温反应10min，对dsn酶进行失活处理，得到所需的含有rdna的酶切液；
（3）sers基底的组装及检测
按照上述金热电极haue相同的处理方法，对直径为3mm的金电极aue进行抛光清洗；取10μm5μl巯基修饰的cdna与5mm5μltcep混匀，室温避光孵育1h；再加入pbs缓冲液稀释溶液至50μl；取10μl稀释液滴在清洗干净的aue表面，4℃组装过夜得到cdna/aue；用pbs缓冲液冲洗电极表面后置于200μl2mm的mch溶液中1h，随后置于200μl1wt.%的bsa溶液中1h，得到bsa/mch/cdna/aue；将电极用pbs缓冲液冲洗干净并用n2轻轻吹干电极表面；滴加10μl步骤（2）制备获得的含rdna的酶切液在电极表面，37℃杂交反应4h得到rdna/bsa/mch/cdna/aue；同样用pbs缓冲液冲洗电极表面除去电极表面未杂交的dna，然后电极浸泡于65μl制备好的sers标签agncs/4-mba/sdna中，37℃杂交反应4h得到sers基底；然后对基底表面检测进行得到sers信号。
所述sdna为ttttttagggt(t)8-(ch2)6sh；pdna为sh-(ch2)6-gcgcccaacatcagtctgataagctaccctaaaaaaccacacggcgc；cdna为sh-(ch2)6-(t)8gcgccgtgtgg。
本发明传感器原理：
将基于热电极的dsn辅助信号放大技术与和agncs的sers增强技术相结合，构建了用于mirna-21检测的sers传感器。如图1所示，该传感器的构建主要分为三个部分：sers标签的组装、基于热电极的dsn辅助目标循环信号放大、sers基底的组装（具体步骤详见下方传感器的制备过程）。对于sers标签的组装：信号探针sdna与拉曼信号分子4-mba均通过ag-s键组装到agncs表面得到sers标签agncs/4-mba/sdna。对于dsn辅助目标循环信号放大过程：巯基修饰的pdna，通过au-s键组装到haue表面，当目标mirna-21存在时，pdna的其中一部分将与目标杂交形成异源双链结构，双链体中的dna链会被dsn识别并剪切。mirna-21和pdna中剩余未杂交的部分（rdna）将被释放出来。释放出的mirna-21可以继续与pdna杂交进行下一个酶切循环，从而产生更多的rdna片段。在此过程中，通过提高haue的温度来提高dsn酶的活性，从而使得该过程进行更快更彻底。sers基底的组装过程：rdna的3´端可以与aue表面的捕获探针cdna杂交，5′端与sers标签上的sdna杂交，将sers标签组装到aue表面制得sers基底，从而在基底表面检测到sers信号。
本发明的优点在于：
本发明将agncs与4-mba和sdna相结合以制备sers标签。并将热电极技术与dsn辅助目标循环信号放大技术相结合，在dsn辅助目标循环信号放大过程中，通过提高电极的温度来提高dsn的活性，从而使得酶切循环过程更为高效彻底。本文的sers传感器对mirna-21的检出限达到2.9fm（s/n=3），且具有很高的特异性。
附图说明
图1为检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器原理图。
图2为不同温度下sers谱图，其中a为在不同电极温度下进行dsn辅助循环放大过程所得sers谱图，a-g：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，b为相应sers谱图在1586cm−1处的峰强变化。
图3为所述dsn用量、反应时间优化以及4-mba浓度的优化图，其中a为dsn用量优化图，b为反应时间优化，c为4-mba浓度的优化图。
图4为传感器对mirna-21的高灵敏检测图。
图5为传感器的选择性图。
具体实施方式
传感器的制备过程所用碱基序列以及缓冲液
tris缓冲液：10mmtris，0.1mnacl，ph7.4；
pbs缓冲液：10mmpb，0.1mnacl，ph7.4；
pbss缓冲液：10mmpb，0.1mnacl，0.01%（wt/vol）sds，ph7.4。
实施例1
一种检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，包括如下：
（1）sers标签agncs/4-mba/sdna的组装
取10μm10μl巯基修饰的sdna，加入5mm10μltcep，室温避光放置1h，对二硫键进行还原，然后将其混入80μl8nm的agncs溶液中，加入300μl的pbss溶液混合均匀，37℃孵育过夜得到agncs/sdna；接着向溶液中加入1mm4μl的对巯基苯甲酸溶液，继续孵育2h；然后将溶液离心，去除上清液后重新分散在400μlpbss溶液中，重复离心3次后4℃保存备用。
（2）dsn辅助目标循环信号放大过程；
将金热电极依次用1μm和0.05μm的氧化铝粉在抛光布上进行抛光，然后在超纯水中超声清洗3min，置于0.5mnaoh溶液中−0.35-1.35v电位间连续扫描500圈，接着置于5mmh2so4溶液中−0.35-1.5v电位间扫描20圈，对电极进行电化学清洗，最后用超纯水清洗冲洗，氮气吹干；
在固定pdna前，将10μm5μl巯基修饰的pdna与5mm5μltcep混匀室温避光处理1h以断裂二硫键，然后取10μl滴到清洗干净的金热电极表面，4℃组装过夜得到pdna/haue；超纯水冲洗后浸泡在2mmmch溶液中，室温封闭1h得到mch/pdna/haue，同样用超纯水对电极表面进行清洗；
取179μl一定浓度的mirna-21，加入20μl的10×dsnbuffer和0.5u/μl1μldsn酶配置成总体积为200μl的酶切液；将mch/pdna/haue浸泡于酶切液中进行酶切反应60min；酶切温度控制为55℃；反应完成后，向酶切液中加入10mm50μledta于55℃恒温10min，对dsn酶进行失活处理，得到所需的含有rdna的酶切液；
（3）sers基底的组装及检测
按照上述haue相同的处理方法，对直径为3mm的金电极（aue）进行抛光清洗；取10μm5μl巯基修饰的cdna与5mm5μltcep混匀，室温避光孵育1h；向上述混合液中加入pbs缓冲液稀释溶液至50μl；取10μl稀释液滴在清洗干净的aue表面，4℃组装过夜得到cdna/aue；用pbs缓冲液冲洗电极表面后置于置于200μl2mm的mch溶液中1h，随后置于200μl1wt.%的bsa溶液中1h，得到bsa/mch/cdna/aue；将电极用pbs缓冲液冲洗干净并用n2轻轻吹干电极表面；滴加10μl步骤（2）制备获得的含rdna的酶切液在电极表面，37℃杂交反应4h得到rdna/bsa/mch/cdna/aue；同样用pbs缓冲液冲洗电极表面除去电极表面未杂交的dna，然后电极浸泡于65μl制备好的sers标签agncs/4-mba/sdna中，37℃杂交反应4h得到sers基底；然后对基底表面检测进行得到sers信号。所用激光为he-ne，激光波长为632.8nm，激光功率为最大功率的5%。
实施例2温度的影响
双链特异性核酸酶（dsn）的活性与温度密切相关，为了研究金热电极haue的温度对dsn辅助目标循环信号放大过程的影响，将mch/pdna/haue浸入在含10pmmirna-21和0.6udsn的1×dsn缓冲溶液中，在不同电极温度下酶切90min。用不同温度下酶切所得溶液进行sers基底的组装，测得sers谱图。如图2所示，当haue温度从35℃升高到55℃时，sers峰强逐渐增加，而当温度高于60℃时，峰强开始下降。表明在一定范围内，升高温度可以提高dsn的活性，酶辅助循环过程更彻底，相应的sers信号更强。因此本发明选择55℃作为最佳温度。
实施例3dsn用量、反应时间优化以及4-mba浓度的优化
为了获得更优异的检测性能，对实验过程中一些重要的条件进行了优化：dsn辅助目标循环信号放大过程中dsn的用量和反应时间，以及sers标签的组装过程中信号分子4-mba的浓度进行了优化。选择1586cm−1处的sers峰强作为效果评估的指标。首先对dsn的用量进行了探究。如图3-a所示，当dsn用量从0.1u增加到0.5u时，sers强度也随之增强，当用量超过0.5u后强度基本保持不变。因此，将0.5u作为dsn的最佳用量。
然后对反应时间进行了优化，如图3-b所示，sers强度随着反应时间的延长而增加，于60min后趋于平稳。因此，将60min作为后续实验的最佳反应时间。
另外，4-mba的浓度直接影响到检测时的sers峰强，因此对4-mba的浓度也进行了优化。如图3-c，随着4-mba浓度从1μm增加到10μm，sers强度迅速增强。由于当4-mba的浓度超过10μm时，agncs粒子会出现聚集情况而无法继续试验，因此选择10μm作为4-mba分子的最佳浓度。
实施例4传感器对mirna-21的高灵敏检测
在最优实验条件下，使用不同浓度的mirna-21对传感器的分析性能进行探究。相应的sers谱图如图4-a，可以看出当mirna-21浓度从1×10−14m增加至1×10−9m，sers强度也逐渐增强。图4-c（曲线a）为sers强度与mirna-21浓度的对数的线性关系，可以看出sers强度与mirna-21浓度在10fm至1nm范围呈良好的线性关系。线性方程为y=33631.06 2283.48lgc（m）（r2=0.998），其中y表示1586cm−1处的sers峰强，计算得到检测限（lod）为2.9fm（s/n=3）。
为了进一步探索haue的温度对传感器检测的影响，探究了haue温度为25℃，在其它条件为最优条件下，sers峰强与mirna-21浓度间的关系。如图4-c（曲线b），mirna-21浓度与sers强度在100pm至10nm范围内呈线性关系，线性方程为y=8501.46 733.18lgc（m）（r2=0.96）。计算得到lod为7.4pm（s/n=3）。表明haue温度在55℃下，比在25℃下，检测极限可以降低大约3个数量级，进一步说明了通过提高haue的温度可以极大提高dsn的活性，从而提高mirna-21检测的灵敏度。
实施例5本发明sers传感器对其它mirna的响应：
我们使用mirna-141（uaacacugucugguaaagaugg），mirna-155（uuaaugcuaaucgugauaggggu）和非互补序列作为干扰物来评估该传感器的选择性。实验在相同的最佳条件下进行（即实施例1步骤），干扰物的浓度比目标物mirna-21（1pm）高10倍。如图5所示，在存在目标物mirna-21的情况下，可以观察到明显的sers信号，而空白实验（不存在mirna-21）或加入其他干扰物质时，几乎无sers信号。这些结果清楚地表明，本申请所提出的sers传感器对于mirna-21的检测具有极好的选择性。
实施例6本发明sers传感器用于血清中加标回收率检测：
为了验证该传感器在mirna-21检测中的适用性和可靠性，采用标准添加方法在血清样品中检测了目标mirna-21，结果如表1。将不同浓度的mirna-21（0.1、1和10pm）加入稀释100倍的血清中，回收率在80.2%至90.0%的范围内，相对标准偏差（rsd）在2.8%至6.9%之间。这些结果表明，所制备的传感器选择性高，有望用于实际样品检测。
表1
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<110>福州大学
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1.一种检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于：包括如下：
（1）sers标签agncs/4-mba/sdna的组装
取10μm10μl巯基修饰的sdna，加入5mm10μltcep，室温避光放置1h，对二硫键进行还原，然后将其混入80μl8nm的agncs溶液中，加入300μl的pbss溶液混合均匀，37℃孵育过夜得到agncs/sdna；接着向溶液中加入1mm4μl的对巯基苯甲酸溶液，继续孵育2h；然后将溶液离心，去除上清液后重新分散在400μl的pbss溶液中，重复离心3次后4℃保存备用；
（2）dsn辅助目标循环信号放大过程；
将金热电极haue依次用1μm和0.05μm的氧化铝粉在抛光布上进行抛光，然后在超纯水中超声清洗3min，置于0.5mnaoh溶液中−0.35-1.35v电位间连续扫描500圈，接着置于5mmh2so4溶液中−0.35-1.5v电位间扫描20圈，对电极进行电化学清洗，最后用超纯水清洗冲洗，氮气吹干；
在固定pdna前，将10μm5μl巯基修饰的pdna与5mm5μltcep混匀室温避光处理1h以断裂二硫键，然后取10μl滴到清洗干净的金热电极表面，4℃组装过夜得到pdna/haue；超纯水冲洗后浸泡在2mmmch溶液中，室温封闭1h得到mch/pdna/haue，同样用超纯水对电极表面进行清洗；
取179μl一定浓度的mirna-21，加入20μl的10×dsnbuffer和0.5u/μl1μldsn酶配置成总体积为200μl的酶切液；将mch/pdna/haue浸泡于酶切液中进行酶切反应60min；酶切温度控制为55℃；反应完成后，向酶切液中加入10mm50μledta于55℃恒温反应10min，对dsn酶进行失活处理，得到所需的含有rdna的酶切液；
（3）sers基底的组装及检测
按照上述金热电极haue相同的处理方法，对直径为3mm的金电极aue进行抛光清洗；取10μm5μl巯基修饰的cdna与5mm5μltcep混匀，室温避光孵育1h；再加入pbs缓冲液稀释溶液至50μl；取10μl稀释液滴在清洗干净的aue表面，4℃组装过夜得到cdna/aue；用pbs缓冲液冲洗电极表面后置于200μl2mm的mch溶液中1h，随后置于200μl1wt.%的bsa溶液中1h，得到bsa/mch/cdna/aue；将电极用pbs缓冲液冲洗干净并用n2轻轻吹干电极表面；滴加10μl步骤（2）制备获得的含rdna的酶切液在电极表面，37℃杂交反应4h得到rdna/bsa/mch/cdna/aue；同样用pbs缓冲液冲洗电极表面除去电极表面未杂交的dna，然后电极浸泡于65μl制备好的sers标签agncs/4-mba/sdna中，37℃杂交反应4h得到sers基底；然后对基底表面检测进行得到sers信号。
2.根据权利要求1所述的一种检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于：所述sdna为ttttttagggt(t)8-(ch2)6sh；pdna为sh-(ch2)6-gcgcccaacatcagtctgataagctaccctaaaaaaccacacggcgc；cdna为sh-(ch2)6-(t)8gcgccgtgtgg。
3.如权利要求1或2所述的制备方法制备获得的检测microrna的表面增强拉曼光谱传感器。
技术总结