本发明属于生化
技术领域：
：，具体来说涉及一种dna连接酶的活性测定方法。
背景技术：
：：dna连接酶是1967年在大肠杆菌细胞中发现的，是生物体内重要的酶，其所催化的反应在dna的复制和修复过程中起着重要的作用。dna连接酶分为两大类：一类是依赖atp的dna连接酶，其利用atp的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键；另一类是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad )的dna连接酶，其利用nad 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键。pbcv-1dna连接酶(pbcv-1dnaligase)，也被称为splintr@连接酶或chorellavirusdna连接酶，是一种atp依赖的dna连接酶，它能够高效催化与一条互补的rna单链配对的两条相邻较小的dna单链的连接；这两条相邻的dna链中，提供3’羟基的被称之为受体dna链(acceptordna)，提供5’磷酸的被称之为供体dna链(donordna)；在这个连接过程中需要一条互补的rna链在两条dna单链间起“夹板”或“桥梁”的固定作用。该酶对于通过rna“夹板”介导固定的dna底物具有比t4dna连接酶更强的亲和力(km～1nm)，和随后的pcr、qpcr或滚环扩增(rollingcircleamplification)的技术相结合，能够实现在复杂的混合物中检测到亚纳摩尔级的特定rna。pbcv-1dna连接酶的这种活性使得该酶可以用于包括各种snp的mirna和mrna的界定，并用于二代测序(next-generationsequencing)和分子诊断(molecμlardiagnostics)。目前neb公司对于pbcv-1dna连接酶的活性单位有如下的定义：oneunitisdefinedastheamountofenzymeneededtoligate(to50％completion)2picomolesofatripartitefam-labeleddna:rnahybridsubstrateina20μlreactionat25℃in15minutesin1xligationbuffer。对于fam标记的连接产物的检测是采用变性后先进行毛细管电泳分离dna连接产物和连接前的dna底物和rna模板等，然后再进行fam荧光检测的方法进行定量(lohman,g.etal.(2014)efficientdnaligationindna-rnahybridhelicesbychlorellavirusdnaligase.nucleicacidsres，42(3)，1831-1844)。然而，毛细管电泳仪器昂贵，不是普通实验室的常备设备，操作复杂、对于操作人员要求高(由于进样量少，因而制备能力差；由于毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法(如紫外吸收光谱法)时，灵敏度较低；电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性)。目前对dna连接酶的活性测定常采用的是凝胶电泳(tongetal(2000)，ligationreactionspecificitiesofannad -dependentdnaligasefromthehyperthermophileaquifexaeolicus.nucleicacidsres.28(6)，1447-1454)和荧光染料染色法检测(徐晓昱等，cn104278090b，一种dna连接酶活性测定方法，2016)；但是凝胶电泳图谱分析存在操作繁琐、检测耗时长，定量分析不够精确等方面的不足。因此，本领域还需要开发新型的dna连接酶的检测方法，以期提高检测效率/精密度等。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种dna连接酶的活性测定方法。在本发明的第一方面，提供一种dna连接酶的酶活测定方法，所述方法包括：(1)提供rna单链、分别与该rna单链的3’端区域和5’端区域互补的受体dna单链和供体dna单链；且该受体dna单链的5’端携带荧光基团、该供体dna单链的3’端携带淬灭基团；(2)将(1)中各单链退火获得dna/rna杂合双链；受体dna单链的3’端羟基与供体dna单链的5’端磷酸基团相邻但存在缺刻，该杂合双链的荧光基团产生荧光；(3)以待测dna连接酶处理(2)的dna/rna杂合双链，获得缺刻处连接的完整dna/rna杂合双链，该杂合双链的荧光基团保持荧光；(4)对(3)的完整dna/rna杂合双链以核糖核酸酶(rnase)消化，留下dna连接产物、其荧光被淬灭，根据其荧光强度进行定量，从而确定待测dna连接酶的酶活。在一个优选例中，所述dna连接酶是催化两条dna链之间形成磷酸二酯键的dna连接酶；较佳地，所述dna连接酶在一条dna的3’端羟基与另一dna的5’端磷酸基团之间形成磷酸二酯键；较佳地，所述dna连接酶包括依赖atp的dna连接酶或依赖nad 的dna连接酶；更佳地，所述dna连接酶包括：pbcv-1dna连接酶、splintr@连接酶、chorella病毒dna连接酶或t4dna连接酶。在另一优选例中，所述rna单链为长度40～80个碱基的链，所述受体dna单链为长度15～35个碱基的链，所述供体dna单链为长度25～45个碱基的链。在另一优选例中，所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:3、seqidno:1和seqidno:2所示。在另一优选例中，所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:6、seqidno:4和seqidno:5所示。在另一优选例中，所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:9、seqidno:7和seqidno:8所示。在另一优选例中，(2)中，退火时，所述rna单链的摩尔数为受体dna单链和供体dna单链摩尔数之和的0.05-50倍，较佳的为0.1-10倍，更佳的为0.2-2倍，最佳的为0.5倍；其中受体dna单链的摩尔数为供体dna单链摩尔数的0.1-10倍，较佳的为0.2-5倍，更佳的为0.5-2倍，最佳的为1倍(等摩尔量)。在另一优选例中，(4)中，所述核糖核酸酶在非变性条件下是特异性消化dna/rna杂交链中rna单链的酶，或变性条件下消化rna的内切酶或外切酶；较佳地包括：rnaseh，含有rnaseh酶活性的反转录酶如m-mulv反转录酶，rnasea，rnaset1。较佳地，所述核糖核酸酶是rnaseh或rnasea。在另一优选例中，所述荧光基团包括(但不限于)选自：fam，vic，rox，cy5，cy3，hex，tet，joe，ned，texasred，lcred640，lcred705。在另一优选例中，所述淬灭基团包括(但不限于)选自：tamra，edans，bhq(包括bhq1，bhq2或bhq3)，mgb，dabcyl。在另一优选例中，所述荧光基团及相应的淬灭基团包括(但不限于)选自：fam荧光基团及tamra淬灭基团；tet荧光基团及edans淬灭基团；fam荧光基团及dabcyl淬灭基团；vic荧光基团及bhq淬灭基团；vic荧光基团及mgb淬灭基团；rox荧光基团及bhq淬灭基团；fam荧光基团及mgb淬灭基团；cy5荧光基团及bhq淬灭基团；或fam荧光基团及bhq淬灭基团。在另一优选例中，(4)中，进行荧光强度测定后，将获得的荧光强度数值进行拟合(较佳地为非线性回归曲线拟合)，获得ec50，进而确定酶活(u)。在另一优选例中，以酶标仪(荧光酶标仪)测定荧光强度。在另一优选例中，以分光光度计(荧光分光光度计)测定荧光强度。在本发明的另一方面，提供一种用于进行dna连接酶的酶活测定的试剂盒，所述试剂盒中包括：rna单链，分别与该rna单链的3’端区域和5’端区域互补的受体dna单链和供体dna单链；其中，该受体dna单链的5’端携带荧光基团，该供体dna单链的3’端携带淬灭基团；核糖核酸酶(rnase)；核酸退火试剂。在一个优选例中，所述核糖核酸酶是非变性条件下特异性消化dna/rna杂交链中rna单链的酶，或变性条件下消化rna的内切酶或外切酶；较佳地包括：rnaseh，含有rnaseh酶活性的反转录酶如m-mulv反转录酶，rnasea，rnaset1。较佳地包括：rnasea或rnaseh。在另一优选例中，所述荧光基团包括(但不限于)选自：fam，vic，rox，cy5，hex，tet，joe，ned。在另一优选例中，所述淬灭基团包括(但不限于)选自：tamra，edans，bhq(包括bhq1，bhq2或bhq3)，mgb，dabcyl。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括(但不限于)以下试剂：连接缓冲液，稀释液，depc水。在另一优选例中，所述的rna单链的核苷酸序列如seqidno:3所示，所述的受体dna单链的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述的供体dna单链的核苷酸序列如seqidno:2所示。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、本发明中dna连接酶进行dna连接活性检测的原理图。fam为荧光基团，tamra为淬灭基团。图2、所测荧光强度与splintr@连接酶酶活单位的拟合曲线。以splintr@连接酶活性单位(u)的lg值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用graphpadprism7做非线性回归曲线拟合，所有数据点可以很好地拟合出一条s型曲线。图3、7m尿素 15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。图4、所测荧光强度与t4dna连接酶酶活单位的拟合曲线。具体实施方式本发明人致力于核酸连接酶的研究、优化及生产，在深入研究及实验的基础上，揭示了一种巧妙地检测dna连接酶的酶活的方法。本发明的测活方法定量准确，操作过程简便、快速，不涉及放射性物质的运用。同时，本发明也优化设计了适用于酶活测定、灵敏度高的具体检测序列如本发明所用，所述的“dna/rna杂合双链”也称为“dna-rna杂合体”，是指一种核酸，其中一条链是dna链，另一条链是rna链，所述的dna链和rna链的核苷酸序列是互补的。如本发明所用，所述“dna连接酶”是催化两条dna链之间形成磷酸二酯键的dna连接酶，其在一条dna的3’端羟基与另一dna的5’端磷酸基团之间形成磷酸二酯键；本发明所述的dna连接酶包括依赖atp的dna连接酶或依赖nad 的dna连接酶。如本发明所用，“待测dna连接酶”是指需要进行酶活测定的dna连接酶，或含有其的核酸样本。该dna连接酶可以是天然的或是重组生产的，可以是纯化的酶或是混合物(如包括粗酶)。如本发明所用，所述的“缺刻”dna的单链缺口；所述的dna连接酶通过催化缺刻处的3’羟基跟5’磷酸基团形成完整的磷酸二酯键而把缺刻连起来。本发明中，揭示了一种简便、快速、非放射性且定量的dna连接酶测活方法，其原理如图1所示。本发明人设计两条与作为“夹板”的rna单链互补的相邻dna单链，其中一条提供3’羟基的受体dna链(acceptordna)，其5’末端有荧光基团标记(例如fam)，另一条提供5’磷酸的供体dna链(donordna)，其3’末端用荧光淬灭基团标记(例如tamra)。首先，将两条相邻的dna单链和互补的rna单链退火(较佳地等摩尔数退火)形成dna/rna杂合双链，退火后形成的dna/rna杂合双链之间形成一个缺刻(nick)。这时，由于形成了适当长度的双链，供体dna单链上的淬灭基团不能邻近受体dna单链上的荧光基团而使淬灭基团产生淬灭效应，dna/rna杂合双链可以产生与所标记的3’羟基的受体荧光基团相应的荧光(例如荧光基团为fam时为绿色荧光)。其次，利用dna连接酶处理上述的dna/rna杂合双链，通过催化连接dna/rna杂合双链缺刻中的受体dna链的3’羟基和供体dna链的5’磷酸末端形成磷酸二酯健，得到一个完整的dna/rna杂合双链。这时，该dna/rna杂合双链，由于空间结构的原因淬灭基团和荧光基团不能靠近，仍然保持荧光。此后，本发明人巧妙地加入了rnaseh以消化dna/rna杂交链中的rna，或加热变性后用rnase消化rna，最终留下dna连接产物。单链的dna连接产物可以形成一定的空间结构，使淬灭基团可以靠近荧光基团，导致荧光淬灭。从而可以利用荧光分析装置(例如荧光酶标仪或荧光分光光度计)进行荧光检测，通过荧光强度来定量分析连接产物的相对量，最终计算出酶活性。现有技术中基于毛细管电泳分离方法的检测方法，是在供体dna链的3’端区域进行了fam标记，主要是通过毛细管电泳时洗脱出不同产物的量所发出的荧光强度来判断连接效率；其产物包括了没有被连接的底物、连接的中间产物以及完全被连接的产物，降低了检测准确性。并且，本领域现有的用于pbcv-1dna连接酶活性检测用毛细管电泳仪，例如sciex公司的产品，价格昂贵(约需200多万)，一般实验室难以承担此类仪器的成本。而本发明中，主要通过dna连接酶连接缺刻使荧光和淬灭基团靠近，荧光被淬灭的强度来判断连接效率，底物序列设计容易，易于操作；这一方法操作步骤简单快速、稳定性好。本发明中，所述dna连接酶是催化两条dna链之间形成磷酸二酯键的dna连接酶。所述dna连接酶在一条dna的3’端羟基与另一dna的5’端磷酸基团之间形成磷酸二酯键。作为前提条件，且该两条dna链的其一的3’端羟基与另一的5’端磷酸基团需是相邻的。也即，所述的dna连接酶不能封闭两条dna链之间的“缺口(gap)”，只能封闭“缺刻(nick)”。dna连接酶分为两大类：一类是依赖atp的dna连接酶，其利用atp的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键；另一类是依赖nad 的dna连接酶，其利用nad 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键。本发明中，所述dna连接酶包括依赖atp的dna连接酶或依赖nad 的dna连接酶。在本发明的实施例中，所述dna连接酶包括：splintr@连接酶，t4dna连接酶；然而应理解，本发明的技术方案不限于此，其它与本发明实施例验证的酶具有接近或同样功能的dna连接酶也是适用于以本发明的方法进行酶活测定的。在本发明的优选方式中，在进行退火以形成所述dna/rna杂合双链时，所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链为等摩尔量退火。然而应理解，本发明的技术方案不限于此，当所添加的rna单链、受体dna单链和供体dna单链存在不等量的情形时，退火之后未形成双链的单链可以作为背景荧光。本发明中，所述的受体dna单链和供体dna单链的长度一般大于6nt。同时，它们与所述rna单链之间满足如前述所限定的相互互补条件、且受体dna单链与供体dna单链之间相邻的条件。从易于合成和操作的角度看，所述的rna单链的长度可以为20～100nt(例如可以为22、25、28、30、40、50、60、70、80、90nt)，较佳地30～80；更佳地40～60nt。与之相应地，所述受体dna单链或供体dna单链的长度可以为6～80nt，例如可以9、10、12、14、16、18、20、22、25、28、30、35、40、45、50、60nt(较佳地两链的碱基数之和可以等于rna单链的碱基数)，较佳地10～40nt；更佳地20～35nt。较佳地，所述供体dna链的长度比受体dna链的长度长约5～20；更佳地8～12nt。合适长度的序列设计有利于获得灵敏度高的结果。同时，本发明人也优化设计了适用于酶活测定的检测序列，具体地，所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:3、seqidno:1和seqidno:2所示；或分别如seqidno:6、seqidno:4和seqidno:5所示；或分别如seqidno:9、seqidno:7和seqidno:8所示。所述序列配合本发明设计的检测方法，检测时间短、灵敏度好。其中，最优选的检测序列组合为：所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:3、seqidno:1和seqidno:2所示。本发明中，可以采用多种荧光基团、以及与之相应的淬灭基团。尽管本发明的实施例中优选地采用了fam作为荧光基团、以tamra作为淬灭基团，但应理解，本发明的方法并不限于此。例如，所述荧光基团可包括但不限于选自：fam，vic，rox，cy5，cy3，hex，tet，joe，ned，texasred，lcred640，lcred705等；或，所述淬灭基团可包括但不限于选自：tamra，edans，bhq(包括bhq1，bhq2或bhq3)，mgb，dabcyl等。更具体的例子中，所述荧光基团及相应的淬灭基团可以包括：fam荧光基团及tamra淬灭基团；tet荧光基团及edans淬灭基团；fam荧光基团及dabcyl淬灭基团；vic荧光基团及bhq淬灭基团；vic荧光基团及mgb淬灭基团；rox荧光基团及bhq淬灭基团；fam荧光基团及mgb淬灭基团，cy5荧光基团及bhq淬灭基团，fam荧光基团及bhq淬灭基团等等。本发明中，除非另外说明，进行dna连接酶的连接反应的温度条件没有特别的限制，一般根据待测dna连接酶的特性而定。例如，splintr@连接酶的连接反应温度25℃左右，孵育15min左右；t4dna连接酶连接反应温度16℃左右，孵育4-24h左右。荧光强度的测定是本领域技术人员熟知的，可以采用实验室中的常用荧光测定仪器来进行荧光强度的测定，例如，以酶标仪(荧光酶标仪)测定荧光强度；或以分光光度计(荧光分光光度计)测定荧光强度。在进行荧光强度测定后，将获得的荧光强度数值进行拟合(较佳地为非线性回归曲线拟合)，获得ec50，进而确定酶活(u)。应用于本发明的dna连接酶的酶活测定方法的试剂可被置于试剂盒中，从而便于本领域技术人员的应用。除了rna单链，分别与该rna单链的3’端区域和5’端区域互补的受体dna单链和供体dna单链以外，所述试剂盒中还可包含：核糖核酸酶(rnase)，核酸退火试剂，连接缓冲液，稀释液，depc水等。此外，所述试剂盒中还可包括标准品、阳性对照和/或阴性对照。所述试剂盒中还可包括使用说明书。本发明的技术方案的有益效果主要在于：1.本发明设计巧妙的测定方法，通过对一条dna单链底物进行荧光基团标记(5’端荧光基团标记，3’端为羟基基团)，另外一条dna单链底物进行淬灭基团标记(5’端磷酸基团，3’端为淬灭基团标记)，以rna单链作为互补链，利用它们被dna连接酶连接后，荧光基团被淬灭基团所淬灭的原理来检测连接产物的生成。2.dna连接酶连接的产物为dna/rna杂合双链，为强荧光；本发明人利用rnase消化杂合双链中的rna链，产生弱荧光的dna单链，使得荧光变化显著，易于测得。3.本发明不仅可以用于pbcv-1dna连接酶活性的检测，也可以用于具有类似酶活性的dna连接酶如t4dna连接酶等的活性检测。4.本发明的荧光法可以对dna连接酶活性进行定量的检测分析，底物序列设计容易，易于操作；并且，该荧光法操作步骤简单快速，重复性好，稳定性强。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、pbcv-1dna连接酶/splintr@连接酶的酶活测定1、序列设计acceptordna序列：5’-famtatgactctactactaatgt-oh-3’(seqidno:1)；donordna序列：5’-pagatgcgacctacaatgtactagaagtgtc-3’tamra(seqidno:2)；配对的rna序列：5’-gacacuucuaguacauuguaggucgcaucuacauuaguaguagagucaua-3’(seqidno:3)；2、dna/rna杂合双链的退火(1)把待退火的dna、rna单链用depc水配制成80μm。(2)dna/rna杂合双链退火反应体系如表1：表1(3)如下设置pcr仪进行退火反应：1.90℃(1min)变性；2.90℃，5s，-0.1℃每个循环；3.gotostep2650cycles)退火；4℃保存。3、splintr@连接酶连接反应所使用splintr@连接酶为neb(25u/μl，m0375s)即为pbcv-1dna连接酶。将nebsplintr@连接酶25u/μl的母液用其储存液(10mmtris-hclph7.4，300mmnacl，1mmdtt，0.1mmedta，50％glycerol)进行稀释，分别稀释至12.5u/μl，10u/μl，2u/μl，1.5625u/μl，1u/μl，0.7812u/μl，0.3906u/μl，0.1953u/μl，0.0976u/μl，0.0488u/μl和0.0244u/μl，参考如表2，在反应体系中加入5μl包括splintr@连接酶25u/μl的母液及一系列稀释后的酶液进行实验。表2连接反应温度：25℃孵育15min。终止反应：每个样品分别加入10u的thermostablernaseh(nebm0523s)，65℃孵育20min使splintr@连接酶失活并同时消化rna模板。4、荧光法检测及酶活计算(1)用thermoscientificvarioskanlux3020-80314酶标仪检测，激发波长为492nm，发射波长为518nm，检测数据如表3。表3splintr@连接酶酶量(u)荧光数值(518nm)12514.162.514.35014.21015.27.812516.2518.53.90619.61.95324.50.976527.90.48829.60.24429.80.12230.1031.6(2)荧光数据拟合将荧光数据进行拟合，结果如图2。根据该图结果可见，以splintr@连接酶活性单位(u)的lg值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用graphpadprism7制作非线性回归曲线拟合，所有数据点可以很好地拟合出一条s型曲线。通过计算曲线的半最大效应浓度ec50＝2.763u。由于该反应体系是50μl(为了荧光检测的方便，将反应体系放大到了50μl，但所有反应底物的浓度保持不变，1xligationbuffer的反应组成为：(50mmtris-hclph7.5，10mmmgcl2，1mmatp，10mmdtt)，按照splintr@连接酶活性单位定义：在20μl反应体系中，1xsplintr连接酶反应缓冲液，25℃条件下，15分钟内能使2pmol三重fam标记的dna:rna杂交底物完成50％连接所需的酶量(oneunitisdefinedastheamountofenzymeneededtoligate(to50％completion)2picomolesofatripartitefam-labeleddna:rnahybridsubstrateina20μlreactionat25℃in15minutesin1xsplintr连接缓冲液)，因而对应20μl反应体系中所计算的ec50值＝2.763/2.5＝1.1u。本发明的上述荧光测定方法所测得的ec50为1.1u，与splintr@连接酶的酶活定义1u极为接近。因此本发明人将在本反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的splintr@连接酶酶量定义为1个酶活单位。5、通过聚丙烯酰胺凝胶比较连接产物的量评估荧光方法所测splintr@连接酶酶活的可靠性(1)dna连接及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：将nebsplintr@连接酶25u/μl的母液用其储存液(10mmtris-hclph7.4，300mmnacl，1mmdtt，0.1mmedta，50％glycerol)进行稀释，分别稀释至10u/μl，2u/μl，1u/μl和0.5u/μl。参考表4，在反应体系中加入1μl包括splintr@连接酶25u/μl的母液及一系列稀释后的酶液进行实验。表4连接反应温度：25℃孵育15min。终止反应：65℃孵育20min终止反应。检测：7m尿素 15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。灰度：用碧云天beyoimagertm600自带的imageanalyzer软件对凝胶图片中的条带进行灰度计算。(2)实验结果在20μl反应体系(50mmtris-hclph7.5，10mmmgcl2，1mmatp，10mmdtt)中，加入通过pcr退火产生的2pmol的dna/rna杂交链，以及图中指定量的neb公司的splintr@dna连接酶，25℃孵育15min进行连接反应，然后65℃孵育20min进行终止反应，反应终止后立即取出5μl并加入1μl6xdnaloadingbuffer，95℃变性5min，然后进行7murea 15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(室温条件下用1xtbe作为电泳液，180v电泳75min；之后用d0140gel-red溶液(5000:1)室温染色15min，拍照观察结果)。尿素变性凝胶电泳检测结果如图3。(3)用商品化的beyoimagertm600自带的imageanalyzer软件对凝胶图片中的连接条带进行灰度值计算，计算结果如表5。表525u10u2u1u0.5u1653191581691479088423140010通过灰度值的计算：splintr@连接酶(m0375s)当酶活力为1u时候的连接产物的灰度值约是底物被完全连接(25u)时灰度值的一半。因此，这一结果与本发明人用荧光测定法测得的ec50值的含义相对应，即荧光强度达到最大值一半的splintr@连接酶酶量为1个酶活单位。因此，本发明的荧光方法所测splintr@连接酶的酶活结果准确，且稳定性好。本发明的上述检测方法，从荧光检测到数据处理，所需时间仅为20min，简单便捷，无需脱盐处理等。而毛细管电泳的样品有时候需要进行脱盐处理，较为繁琐。例如，利用sciex公司的产品的毛细管电泳仪进行pbcv-1dna连接酶活性检测，上样样品(包括脱盐处理)准备加上样品出峰大约在50-90分钟。实施例2、t4dna连接酶的酶活测定待连接的序列同为实施例1中退火后获得的dna/rna杂交链。1、t4dna连接酶连接反应(1)连接反应体系所使用t4dna连接酶为商品化的beyotimet4dna连接酶(1000u/μl，d7006)。将beyotimet4dna连接酶1000u/μl的母液用其储存液(20mmtris，ph7.5，50mmkcl，1mmdtt，0.1mmedta，50％(v/v)甘油)进行稀释，分别稀释至500u/μl，250u/μl，125u/μl，62.5u/μl，31.25mu/μl，15.6u/μl，在反应体系中分别依次按照如表6加入4μl、3μl、2.5μl的t4dna连接酶1000u/μl的母液以及2.5μl的一系列被稀释后的酶液进行实验。表6连接反应温度：37℃，孵育4h。终止反应：每个样品分别加入10u的thermostablernaseh(nebm0523s)，65℃孵育15min使t4dna连接酶失活并同时消化rna模板。beyotime生产的10x连接缓冲液为：400mmtris，ph7.8，100mmmgcl2，100mmdtt，5mmatp。为了提高连接dna/rna杂合双链的效率，将atp浓度由5mm降低到100um。(2)荧光法检测及酶活计算用thermoscientificvarioskanlux3020-80314酶标仪检测，激发波长为492nm，发射波长为518nm，检测数据如表7。表7(3)荧光数据拟合所测荧光强度与t4dna连接酶酶活单位的拟合曲线如图4。通过对荧光强度的检测发现在t4dna连接酶酶量为2500u时荧光强度有很明显的变化，相当于在20μl反应体系中加入1μl的酶(1000u)就能检测到明显的荧光强度的变化。也就是说，通过荧光法可以很好的检测出t4dna连接酶连接dna/rna杂合双链的活性。以t4dna连接酶活性单位(u)的lg值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用graphpadprism7做非线性回归曲线拟合，所有数据点可以拟合出一条s型曲线。通过计算曲线的半最大效应浓度ec50＝700u，本发明中反应体系是50μl(为了荧光检测的方便，将反应体系放大到了50μl)，但所有反应底物的浓度保持不变，1x连接缓冲液的反应组成为：40mmtris，ph7.8，10mmmgcl2，10mmdtt，10μmatp。因而，对应20μl反应体系中所计算的ec50值＝700/2.5＝280u。多批次实验显示，本发明的荧光方法所测t4dna连接酶的酶活结果准确，且稳定性好。实施例3、基于其它序列的酶活检测本发明人还设计不同于实施例1中acceptordna、donordna及配对rna序列，进行连接反应。1、序列设计2acceptordna序列(seqidno:4)：5’-famagatggatgctcagactacagt-oh-3’；donordna序列(seqidno:5)：5’-pattatatgattggtactcggtctcgctaggca-3’tamra；配对的rna序列(seqidno:6)：5’-ugccuagcgagaccgaguaccaaucauauaauacuguagucugagcauccaucu-3’；如实施例1中第2～5的方法，本发明人利用这些序列进行了splintr@连接酶的酶活检测，荧光值变化灵敏，酶活结果准确。从荧光检测到数据处理，所需时间仅为约20min。2、序列设计3acceptordna序列(seqidno:7)：5’-famtagtgcataatctgagtaccct-oh-3’；donordna序列(seqidno:8)：5’-ptaagattgatttacactgaggctggctacgca-3’tamra；配对的rna序列(seqidno:9)：5’-ugcguagccagccucaguguaaaucaaucuuaaggguacucagauuaugcacua-3’；如实施例2中的方法，本发明人利用这些序列进行了t4dna连接酶的酶活检测，荧光值变化灵敏，酶活结果准确。从荧光检测到数据处理，所需时间仅为约20min。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海碧云天生物技术有限公司<120>一种dna连接酶的酶活测定方法<130>211215<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>acceptordna<400>1tatgactctactactaatgt20<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>donordna<400>2agatgcgacctacaatgtactagaagtgtc30<210>3<211>50<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(50)<223>配对的rna序列<400>3gacacuucuaguacauuguaggucgcaucuacauuaguaguagagucaua50<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>acceptordna<400>4agatggatgctcagactacagt22<210>5<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>donordna序列<400>5attatatgattggtactcggtctcgctaggca32<210>6<211>54<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(54)<223>配对的rna序列<400>6ugccuagcgagaccgaguaccaaucauauaauacuguagucugagcauccaucu54<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tagtgcataatctgagtaccct22<210>8<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8taagattgatttacactgaggctggctacgca32<210>9<211>54<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ugcguagccagccucaguguaaaucaaucuuaaggguacucagauuaugcacua54当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种dna连接酶的酶活测定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供rna单链、分别与该rna单链的3’端区域和5’端区域互补的受体dna单链和供体dna单链；且该受体dna单链的5’端携带荧光基团、该供体dna单链的3’端携带淬灭基团；
(2)将(1)中各单链退火获得dna/rna杂合双链；受体dna单链的3’端羟基与供体dna单链的5’端磷酸基团相邻但存在缺刻，该杂合双链的荧光基团产生荧光；
(3)以待测dna连接酶处理(2)的dna/rna杂合双链，获得缺刻处连接的完整dna/rna杂合双链，该杂合双链的荧光基团保持荧光；
(4)对(3)的完整dna/rna杂合双链直接或加热变性后以核糖核酸酶消化，留下dna连接产物、其荧光被淬灭，根据其荧光强度进行定量，从而确定待测dna连接酶的酶活。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dna连接酶是催化两条dna链之间形成磷酸二酯键的dna连接酶；较佳地，所述dna连接酶在一条dna的3’端羟基与另一dna的5’端磷酸基团之间形成磷酸二酯键；较佳地，所述dna连接酶包括依赖atp的dna连接酶或依赖nad 的dna连接酶；更佳地，所述dna连接酶包括：pbcv-1dna连接酶、splintr@连接酶、chorella病毒dna连接酶或t4dna连接酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rna单链为长度40～80个碱基的链，所述受体dna单链为长度15～35个碱基的链，所述供体dna单链为长度25～45个碱基的链；较佳地：
所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:3、seqidno:1和seqidno:2所示；或
所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:6、seqidno:4和seqidno:5所示；或
所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:9、seqidno:7和seqidno:8所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，退火时，所述rna单链的摩尔数为受体dna单链和供体dna单链摩尔数之和的0.05-50倍，较佳的为0.1-10倍，更佳的为0.2-2倍，最佳的为0.5倍；其中受体dna单链的摩尔数为供体dna单链摩尔数的0.1-10倍，较佳的为0.2-5倍，更佳的为0.5-2倍，最佳的为1倍。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(4)中，所述核糖核酸酶在非变性条件下是特异性消化dna/rna杂交链中rna单链的酶，或变性条件下消化rna的内切酶或外切酶；较佳地包括：rnaseh，含有rnaseh酶活性的反转录酶如m-mulv反转录酶，rnasea，rnaset1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光基团包括选自：fam，vic，rox，cy5，cy3，hex，tet，joe，ned，texasred，lcred640，lcred705；或，所述淬灭基团包括选自：tamra，edans，bhq，mgb，dabcyl；
较佳地，所述荧光基团及相应的淬灭基团包括选自：
fam荧光基团及tamra淬灭基团；
tet荧光基团及edans淬灭基团；
fam荧光基团及dabcyl淬灭基团；
vic荧光基团及bhq淬灭基团；
vic荧光基团及mgb淬灭基团；
rox荧光基团及bhq淬灭基团；
fam荧光基团及mgb淬灭基团；
cy5荧光基团及bhq淬灭基团；或
fam荧光基团及bhq淬灭基团。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(4)中，进行荧光强度测定后，将获得的荧光强度数值进行拟合，获得ec50，进而确定酶活。
8.一种用于进行dna连接酶的酶活测定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
rna单链，分别与该rna单链的3’端区域和5’端区域互补的受体dna单链和供体dna单链；其中，该受体dna单链的5’端携带荧光基团，该供体dna单链的3’端携带淬灭基团；
核糖核酸酶；
核酸退火试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述rna单链为长度40～80个碱基的链，所述受体dna单链为长度15～35个碱基的链，所述供体dna单链为长度25～45个碱基的链；较佳地：
所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:3、seqidno:1和seqidno:2所示；或
所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:6、seqidno:4和seqidno:5所示；或
所述rna单链、受体dna单链和供体dna单链的核苷酸序列分别如seqidno:9、seqidno:7和seqidno:8所示。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述核糖核酸酶是非变性条件下特异性消化dna/rna杂交链中rna单链的酶，或变性条件下消化rna的内切酶或外切酶；较佳地包括：rnaseh，含有rnaseh酶活性的反转录酶如m-mulv反转录酶，rnasea，rnaset1；
所述荧光基团包括选自：fam，vic，rox，cy5，hex，tet，joe，ned；或
所述淬灭基团包括选自：tamra，edans，bhq，mgb，dabcyl。
较佳地，所述试剂盒中还包括以下试剂：连接缓冲液，稀释液，depc水。
技术总结本发明提供了一种DNA连接酶的酶活测定方法，包括：(1)提供RNA单链及与之互补的受体DNA单链和供体DNA单链；(2)退火获得DNA/RNA杂合双链，受体DNA单链的3’端羟基与供体DNA单链的5’端磷酸基团相邻但存在缺刻，该杂合双链的荧光基团产生荧光；(3)以待测DNA连接酶处理DNA/RNA杂合双链，获得缺刻处连接的完整DNA/RNA杂合双链，该杂合双链的荧光基团保持荧光；(4)对完整DNA/RNA杂合双链直接或加热变性后以核糖核酸酶消化，留下DNA连接产物，根据其荧光强度进行定量，确定待测DNA连接酶酶活。本发明的方法定量准确，操作过程简便、快速，不涉及放射性物质的运用。同时，本发明也优化设计了适用于酶活测定、灵敏度高的具体检测序列。
技术研发人员：翟琦巍;李升建;周靖晗;杨小丽
受保护的技术使用者：上海碧云天生物技术有限公司
技术研发日：2021.04.30
技术公布日：2021.07.02
