一种与鸡冠高度相关的分子标记及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物基因技术领域，特别是涉及一种与鸡冠高度相关的分子标记及其应用。


背景技术：

2.在现代养禽业中，众多研究者与养殖者均意识到种公鸡对生产水平的高低有着重要的作用，特别是影响种蛋的受精率、孵化率，进而影响种鸡的经济效益。除合格的鸡舍环境、严格的饲养管理外，繁殖性状的选育也是获得种公鸡较高种用价值非常重要的因素。公鸡外貌的第二特征比如鸡冠、肉垂等受到雄性激素的调节，相互之间有着不同程度的相关性，可以间接反映公鸡雄性化发育的程度，可作为繁殖性状的选育指标。冠高是指用卡尺测量从鸡冠基部到最高冠齿的垂直距离，冠高是家禽第二性征的重要指标之一，与睾丸总质量密切相关。通过对冠高性状进行选育可对睾丸性状进行间接选择。
3.宁都黄鸡原名为“宁都三黄鸡”，系特优质型黄羽肉鸡，是江西省著名的优良地方肉用鸡种，宝贵的家禽品种资源，列入了1999年出版的《江西省畜禽品种志》。宁都黄鸡还具有个体矮小、肉质鲜嫩特点，并且所含蛋白质、总氨基酸及单位面积鸡纤维数量等指标均优于国内多个肉鸡品种，因此，具有较大的市场需求。而目前还没有通过鸡冠高度相关性状筛选宁都黄鸡的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种与鸡冠高度相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记可以通过与鸡冠高度的相关性对地方品种种鸡公鸡进行分型，以为其繁殖性状的育种以及分子辅助选育工作提供理论基础和参考数据。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种与鸡冠高度相关的分子标记，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.优选的是，seq id no：1所示序列的snp位点g.1061处有一个a/g的碱基突变，出现aa、ag和gg不同的基因分型。
8.本发明还提供一种检测所述的与鸡冠高度相关的分子标记的引物对，包括：
9.上游引物f：5
’‑
cgagcacccccatccattt
‑3’
；
10.下游引物r：5
’‑
tttcctcactctttcccggc
‑3’
。
11.本发明还提供一种试剂盒，包括所述的引物对。
12.本发明还提供一种检测所述的与鸡冠高度相关的分子标记的方法，包括以下步骤：
13.步骤1：提取待检测鸡的基因组dna；
14.步骤2：利用权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获取扩增产物；
15.步骤3：将步骤2所得的扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；
16.步骤4：根据基因型分析与鸡冠高度的相关性，且ag或gg基因型个体的鸡冠高度高
于aa基因型个体的鸡冠高度。
17.优选的是，步骤2中，pcr扩增反应体系包括：dna 1
‑
2μl，2
×
pcr mix 7.5μl，上游引物和下游引物各1μl，h2o补至15μl。
18.优选的是，步骤2中pcr扩增反应程序为：95℃3min；94℃15s，55℃15s，72℃30s，20cycles；72℃3min。
19.本发明还提供根据所述的分子标记、所述的引物对、或所述的试剂盒在检测鸡冠高度相关性状中的应用。
20.本发明还提供根据所述的分子标记、所述的引物对、所述的试剂盒在地方品种鸡种公鸡选育中的应用。
21.本发明公开了以下技术效果：
22.本发明提供一种与鸡冠高度相关的分子标记，该分子标记是以gh基因g.1061位点进行检测位点，分析该位点多态性与鸡冠高度的相关性，通过实验发现，该位点的等位基因g有利于鸡冠高度的发育。这为通过鸡冠高度进行地方鸡种公鸡选育及分子标记辅助选择提供理论基础和参考数据。利用本发明分子标记构建的检测方法，相对于传统的通过表型数据选育，不仅成本低、操作简便，并且结果准确，并且该方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为实施例2目的位点的分型结果。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实
施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.实施例1检测与鸡冠高度相关的分子标记的方法
31.采用pcr方法对相应的变异位点进行分型，根据被检鸡血液目的位点的基因型来选择不同鸡冠高度的种公鸡。具体步骤如下：
32.步骤1：样本dna准备。
33.(1)采集339只16周龄公鸡血液，采用苯酚
‑
氯仿抽提法提取血液dna。
34.苯酚
‑
氯仿抽提法(奥斯泊f等，1998)提取基因组dna的具体步骤如下：
35.①
取全血30μl置于1.5ml离心管，分别加入470μl 1
×
set缓冲液、12.5μl 20％sds和6μl 10mg/ml蛋白酶k，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
36.②
取出样本于1.5ml离心管，加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
37.③
取上清，再次加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
38.④
取上清，加入500μl氯仿
‑
异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；
39.⑤
取上清，加入1ml冰无水乙醇(
‑
20℃)，来回摇摆以沉淀dna，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
40.⑥
用1ml75％乙醇清洗dna一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
41.⑦
待dna完全干燥后加入300μl灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解dna；
42.⑧
存放于
‑
20℃冰箱中保存备用。
43.(2)dna质量检测与稀释：取质量合格的dna样品，稀释至100ng/μl，
‑
20℃保存备用。
44.步骤2：pcr扩增
45.将合成好的引物用1
×
te溶解到浓度为10pmol，将一组中的引物加到一起，混匀，离心。pcr扩增引物如下所示：
46.上游引物f(seq id no:2):cgagcacccccatccattt；
47.下游引物r(seq id no:3):tttcctcactctttcccggc。
48.pcr反应体体系如表1所示：
49.表1 pcr反应体系
[0050][0051]
将配制的pcr总管分装到200μl pcr中，离心，每孔加入2ul dna样品，离心，上pcr仪。
[0052]
pcr反应程序如表2所示。
[0053]
表2 pcr反应程序
[0054][0055][0056]
扩增序列如下seq id no：1所示：
[0057]
cacgagcacccccatccattttaaacagacccccagctatataaggggtgtctcacctgttatcatcacctggatgaaaggaggaaacgttcaagcaacacctgagcaactctcccggcaggaatggctccaggtactttgctttatctcagttctaatgggtgttccaatgctgctgcatgctttgggtgatgggatacgatggtggggtgtgctgtggtgggctgacacacgcagagccggctctgaactaaaatgtggcaacttacagatcagtgacaaaggatctccttccctacagtgcaacttcaaaccatgagctgactcaggtaaccctgagcctaaccttgacagggggcaggaatgagctgcagaatacgaagaacaaggcaaaccagagttgtaatggtgattgctatcatacgtgttgccagggatattaaaactcagttccaaggctttaaaacggagatcaggatgatgtctaatcagactcatagaatggcccgggttgaaaagcacttcaaagatcacctaatttcaaccccttgcacttgtccaagtcctgcaggctccagggcattcctccactgaagttaaaccctactgagattaacttttgtaagcggacactcatgtg【a/g】gctggatgtcgagggttaataaccttcaggcttgacagtgacctccagatcctacaggtgtgtcccagagagccacagcgcaggtaatgcagccacttctcaccccagtgaaggcagacagtgccatggcagcagcacggtgcaaataggctcagctgagctgttcccagtcctcacccactgctctccaccctgttggctcacgcgccaaagagtgtaccgtgctctgctcaggaaggtgaaacctaccaaaaaacatcaaaaaacatgagcacgttaggggaaaataaagggacggacccacatggagcaacatgtgggcttgtgtggagggctgcactcacaggtggacacaaccctgagccccaggtgccaccaaaggacgggtaacccctctcctctccgctctgctgtaggctcgtggttttctcctctcctcatcgctgtggtcacgctgggactgccgcaggaagctgctgccaccttccctgcc
atgcccctctccaacctgtttgccaacgctgtgctgagggctcagcacctccacctcctggctgccgagacatataaagagttcgtaagtgttggccatctcctcattagcttgatgcctccaggaccgtgccacggcttcccaccctgcataaattcctgcaagcagagacttttcagctatcggtgcctcctgaggaggagaaagggtcttaatagggtaggagaggtgatgaccgaccagcctgtcctccccacagctctctgcctcctcctgcaaggagtcacctcctcctgtccatgtgttctgtgctcacctcaacccttcagtgagagcaatctctaagaccagtaggtgttgtgccaacacgtgggctctgctttcccacctgccagtcctgcacagggatgcacatcatgtcccacgtttccttcttgcaaagagcaacctgccgggaaagagtgaggaaagagtccgtgctcttctcttatcacac
[0058]
注：“【】”内为目的位点。
[0059]
(4)测序分型
[0060]
将扩增得到的pcr产物送生物公司测序。用dnastar软件的seqman模块读取实验结果，查看目的位点基因型。
[0061]
步骤3：性状关联分析
[0062]
采用sas 9.0glm程序进行统计分析gh基因位点g.1061不同基因型与鸡冠高度性状，包括4周龄冠高(mm)、6周龄冠高(mm)、8周龄冠高(mm)、10周龄冠高(mm)、12周龄冠高(mm)、14周龄冠高(mm)、16周龄冠高(mm)的相关性。结果表明该位点与4周龄至16周龄冠高性状差异显著，在4周龄至10周龄中，gg基因型的鸡冠高度极显著高于aa型个体，具体结果如下表3所示：
[0063]
表3 gh基因位点g.1061不同基因型与不同周龄鸡冠高度性状关系
[0064][0065]
实施例2与鸡冠高度相关的分子标记在选择不同鸡冠高度的种公鸡中的应用
[0066]
通过gh基因位点g.1061基因型选择不同鸡冠高度的种公鸡。
[0067]
1.样本采集与准备
[0068]
(1)孵化400只宁都黄种鸡蛋，出生当天鉴别雌雄；
[0069]
(2)采集雄性个体血液。
[0070]
2.dna提取
[0071]
采用如实施例1所述的苯酚
‑
氯仿抽提法(奥斯泊f等，1998)提取基因组dna。
[0072]
3.目的位点分型
[0073]
利用实施例1所示的引物、反应体系以及反应程序进行pcr扩增，得到扩增产物。
[0074]
4.测序分型
[0075]
将得到的pcr扩增产物送生物公司测序，采用下游引物f进行序列测序。用dnastar软件的seqman模块读取实验结果，查看目的位点基因型。
[0076]
采用chromas软件查看峰图。分型结果有如图1所示的3种结果：
[0077]
5.结果判定。
[0078]
根据分型结果，将基因型分别为aa、ag和gg个体进行标号，饲养至16周龄，测量并记录4周龄、6周龄、8周龄、10周龄、12周龄、14周龄和16周龄的鸡冠冠高，并进行相关性分析，实验数据表明，gg基因型个体的鸡冠高度与aa基因型个体差异极显著，且等位基因g有利于鸡冠高度性状，与预测结果相一致。
[0079]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。