一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用的制作方法

1.本公开涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶的片段、一种分离或人工合成的核酸、插入该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、提高角蛋白酶耐高温稳定性的方法以及该角蛋白酶降解羽毛的方法。


背景技术：

2.角蛋白酶是一类能够特异性攻击角蛋白二硫键并降解角蛋白的一类酶，主要产自细菌。结构分析显示，角蛋白酶含有信号肽、n端前肽和成熟区，部分序列含有c端延伸结构。角蛋白酶成熟区也称催化结构域，由中央七股平行的β
‑
折叠和六个α
‑
螺旋组成主要的结构为活性位点中心和底物识别位点。活性位点中心为组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸组成的催化三联体。成熟区结构性质影响着角蛋白酶的性质，其能特异攻击二硫键以降解角蛋白，但热稳定性差等因素限制了角蛋白酶的工业应用。
3.目前发现的生物酶热稳定性普遍较差，不利于工业应用，因而对酶热稳定性的改良变得尤为重要。目前对酶稳定性的改造策略主要包括引入二硫键、氢键、盐桥、增加疏水作用力等方式，而在特定温度下酶的稳定性和柔性之间的平衡也是优化酶催化功能的关键。极端微生物在自然进化中适应了高温、低温、高压等极端环境，是极端酶基因资源的优质来源。
4.目前国内生产的酶制剂品种较为单一，不能满足工业需求，因而仍需要对具有特殊性能的优质酶资源进行开发。


技术实现要素：

5.本公开的目的是提供一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，该角蛋白酶通过定点突变的方式进行了耐高温稳定性的氨基酸优化，提高了角蛋白酶的耐高温稳定性，可应用于洗涤、食品、化妆品以及废弃物降解等领域。
6.第一方面，本公开提供一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，所述角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.可选地，其中，所述角蛋白酶是将如戈壁异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段后得到的蛋白；
8.戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；
9.嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
10.第二方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶，该角蛋白酶是来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶，且该角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
11.第三方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶的片段，该角蛋白酶的片段是嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段，且该角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
12.第四方面，本公开提供一种分离的或人工合成的核酸，该核酸编码第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶或第三方面所述的角蛋白酶的片段。
13.可选地，其中，所述基因是核苷酸序列为seq id no.5、7、8中任意一个所示的dna分子。
14.第五方面，本公开提供一种重组载体，其中，所述重组载体插入有第四方面所述的基因；
15.优选地，所述重组载体是重组表达载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为seq id no.9或10所示的dna分子。
16.第六方面，本公开提供一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体导入的核酸包括第四方面所述的核酸，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第五方面所述的重组载体。
17.第七方面，本公开提供一种提高角蛋白酶的耐高温稳定性的方法，其中，所述方法包括：对原始的角蛋白酶进行重组改造，所述重组改造包括：将原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段的同源片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段；
18.所述嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示；
19.所述原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段的同源片段，与嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段的一致性在80％以上。
20.第八方面，本公开提供一种降解羽毛的方法，其中，该方法包括，将羽毛与角蛋白酶接触进行酶解；
21.所述角蛋白酶为第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶，或者为第七方面所述的方法得到的角蛋白酶；
22.优选地，所述酶解的温度为60
‑
80℃，时间为0
‑
200min。
23.更优选地，所述酶解的温度为65
‑
75℃，时间为10
‑
120min。
24.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
25.图1角蛋白酶dgeker的酶活特性(a)最适温度(b)60℃热稳定性(c)最适ph(d)ph耐受性。
26.图2角蛋白酶dgeker的羽毛降解分析。
27.图3功能域asn240
‑
tyr274的序列分析。
28.图4功能域asn240
‑
tyr274提高了重组酶温度稳定性。
29.图5功能域asn240
‑
tyr274提高了重组酶高温下羽毛降解力。
30.序列表信息
31.1、seq id no.1：具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶的氨基酸序列。
32.2、seq id no.2：戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列。
33.3、seq id no.3：嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列。
34.4、seq id no.4：嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段的氨基酸序列。
35.5、seq id no.5、6、7：编码seq id no.1
‑
3的氨基酸序列的核苷酸序列。
36.6、seq id no.8：编码嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段的氨基酸序列的核苷酸序列。
37.7、seq id no.9：具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶重组表达载体的核苷酸序列。
38.8、seq id no.10：嗜热异常球菌的角蛋白酶重组表达载体的核苷酸序列。
具体实施方式
39.以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
40.第一方面，本公开提供一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，所述角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
41.可选地，其中，所述角蛋白酶是将如戈壁异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段后得到的蛋白；
42.戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；
43.嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
44.本公开中，所述戈壁异常球菌的核苷酸序列如seq id no.6所示。
45.第二方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶，该角蛋白酶是来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶，且该角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
46.本公开中，体外酶活性分析结果表明，来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶具有良好的角蛋白酶活性；来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶的羽毛降解实验结果表明，角蛋白酶能够在120min完成羽毛降解，60℃酶活性最高，60℃下角蛋白酶的酶活性稳定性是商品酶kera的3.96倍。
47.第三方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶的片段，该角蛋白酶的片段是嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段，且该角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
48.本公开中，嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段的功能域位于成熟区c端、α5螺旋结构下游第240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸残基的35个氨基酸残基，结构上包含一段α
‑
螺旋和一股β
‑
折叠，保守性较弱，在稳定蛋白结构上发挥重要作用。所述嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn240
‑
tyr274片段的氨基酸序列如seq id no.4所示。
49.第四方面，本公开提供一种分离的或人工合成的核酸，该核酸编码第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶或第三方面所述的角蛋白酶的片段。
50.可选地，其中，所述基因是核苷酸序列为seq id no.5、7、8中任意一个所示的dna分子。
51.第五方面，本公开提供一种重组载体，其中，所述重组载体插入有第四方面所述的基因；
52.优选地，所述重组载体是重组表达载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为seq id no.9或10所示的dna分子。
53.本公开中，体外酶活性分析结果表明，重组后的角蛋白酶最适温度提高了10℃，60℃下重组角蛋白酶的酶活性延长了2.39倍。实验证明角蛋白酶成熟区α5螺旋结构下游第
240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸(asn240
‑
tyr274)结构域的优化具有显著提高角蛋白酶耐高温稳定性的功能。
54.第六方面，本公开提供一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体导入的核酸包括第四方面所述的核酸，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第五方面所述的重组载体。
55.第七方面，本公开提供一种提高角蛋白酶的耐高温稳定性的方法，其中，所述方法包括：对原始的角蛋白酶进行重组改造，所述重组改造包括：将原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段的同源片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段；
56.所述嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.3所示；
57.所述原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段的同源片段，与嗜热异常球菌的角蛋白酶的asn243
‑
tyr276片段的一致性在80％以上。
58.第八方面，本公开提供一种降解羽毛的方法，其中，该方法包括，将羽毛与角蛋白酶接触进行酶解；
59.所述角蛋白酶为第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶，或者为第七方面所述的方法得到的角蛋白酶；
60.优选地，所述酶解的温度为60
‑
80℃，时间为0
‑
200min。
61.更优选地，所述酶解的温度为65
‑
75℃，时间为10
‑
120min。
62.下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
63.以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化羟基化的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。
64.凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
65.实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
66.表达质粒pet28a：为德国默克公司市售产品；
67.大肠杆菌bl21(de3)：为北京诺唯赞公司市售产品。
68.实施例1
69.本实施例用于说明角蛋白酶dgeker的功能鉴定
70.(一)实验方法
71.1、角蛋白酶表达菌株的构建
72.根据嗜热异常球菌基因组序列设计pcr特异性引物：
73.dgeker
‑
f：acccatatgaactcacgtcttgcgcttg(seq id no.11)
74.dgeker
‑
r：accctcgagtggtgtagagcaggcggttggg(seq id no.12)
75.通过pcr方法从嗜热异常球菌基因组dna中扩增出目的基因序列。
76.pcr反应程序：
[0077][0078]
pcr产物经胶回收后，通过重组酶连接于经过nde i/xho i双酶切获得的含有粘性末端的pet
‑
28a载体上，构建大肠杆菌表达载体pet28a
‑
dgeker。将该表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)，经pcr、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为bl21
‑
dgeker。
[0079]
2、角蛋白酶的诱导表达与纯化
[0080]
活化重组菌，挑取单菌落制备种子液；将种子液按od
600
＝0.1转接至新鲜lb培养基中。37℃培养至od
600
＝0.5，加入iptg，并转移至16℃进行蛋白表达(过夜)。离心收集菌体，tris
‑
hcl(ph 7.5)重悬菌体。超声破碎菌体，收集上清及沉淀。采用ni
‑
nta琼脂糖凝胶纯化目的角蛋白酶，sds
‑
page检测蛋白。
[0081]
3、角蛋白酶的酶活测定
[0082]
酶活性定义：样品比对照增加0.01个吸光值定义为1个酶活力单位(u)。
[0083]
将0.1ml可溶性角蛋白(1％)、0.08ml缓冲液与0.02ml角蛋白酶混匀，对照组加入0.2ml tca、0.08ml缓冲液及0.02ml角蛋白酶；50℃孵育15min；加入0.2ml tca终止反应，对照组加入0.1ml可溶性角蛋白(1％)；4℃、12000rpm/min离心5min；0.2ml上清与1ml na2co3及0.2ml福林混匀；40℃显色反应20min；取0.2ml上清液测680nm处吸光值。
[0084]
4、角蛋白酶温度耐受性及ph耐受性分析
[0085]
酶活性测定体系加入纯化酶液、缓冲液及1％可溶性底物，在30、40、50、60、70、80℃下反应20min，测定角蛋白酶酶活。
[0086]
酶活性测定体系加入纯化酶液、不同ph值缓冲液及底物，在角蛋白酶最适温度下测定角蛋白酶酶活。
[0087]
温度耐受性：提前将纯化角蛋白酶酶液于60℃、70℃预处理5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min后，置于冰上冷却，对照组不做处理，酶活性测定体系及步骤在最适反应温度下测定角蛋白酶残余酶活。
[0088]
ph耐受性：将纯化角蛋白酶酶液置于不同ph缓冲液中于冰上处理预处理1h，酶活性测定体系及步骤于最适温度下测定残余酶活。
[0089]
5、角蛋白酶体外羽毛降解实验
[0090]
羽毛预处理：高压蒸汽(121℃，1.034
×
105pa)灭菌30min。
[0091]
将灭菌的完整羽毛加入1.5ml纯化酶中(5mmol/l dtt)，于60℃、220rpm摇床中孵育，定时拍照观察羽毛降解情况。
[0092]
(二)实验结果
[0093]
本实施例成功构建了表达角蛋白酶dgeker的重组大肠杆菌工程菌株。蛋白诱导条
件及时间与dgeker一致，使用浓度为0.1mmol/l，于16℃条件下iptg诱导蛋白表达的dgeker以可溶形式存在，纯化后dgeker蛋白分子量约为28kda，为n端前肽切割后的成熟蛋白。
[0094]
角蛋白酶活测定结果显表明：dgeker最适反应温度为70℃，最适反应ph为9，60℃预处理60min后，dgeker残余酶活性约为69％，半衰期为103.4min。ph11缓冲液预处理60min后，dgeker残余酶活性接近100％。商品酶kera在60℃处理下，酶活性丧失较快，处理60min后,残余酶活性不足20％，半衰期为26.4min。相比之下dgeker半衰期为kera半衰期的3.91倍。
[0095]
羽毛降解实验表明：60℃处理下，角蛋白酶dgeker孵育60min时，羽毛羽枝大量脱落，反应体系溶液开始变浑浊。随后反应体系中出现更多羽枝脱落并分解成小的颗粒，孵育120min时羽片基本完成降解。
[0096]
实施例2
[0097]
本实施例用于说明角蛋白酶热稳定性功能域asn240
‑
tyr274的挖掘与分析
[0098]
(一)实验方法
[0099]
生物信息学分析
[0100]
利用blast对数据库进行相似性分析和比对。在expasy服务器上使用protparam分析了蛋白的分子量和消光系数。利用espript3.0氨基酸序列比对，进行二级结构分析。利用phyre2server对dgeker的三维结构进行了预测。使用vmd1.9.3可视化并编辑由phyre2生成的pdb文件。利用interpro软件对dgeker的蛋白结构域及催化中心进行预测。利用mega 7.0软件按照邻接法构建系统发育树。利用schema软件进行热点结构域分析与蛋白模块化重组。
[0101]
(二)实验结果
[0102]
生物信息学分析显示：角蛋白酶dgeker成熟区由279个氨基酸残基组成，由中央7股平行的β
‑
折叠和6个α
‑
螺旋组成主要的结构为活性位点中心和底物识别位，包含催化三联体asp39、his71和ser222，与kera、mtaker催化三联体结构高度保守。
[0103]
表面电荷分布分析显示：dgeker的asn240
‑
tyr274与同源蛋白差异较大。asn240
‑
tyr274功能域位于成熟区c端，α5螺旋结构下游第240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸残基的35个氨基酸残基，结构上包含一段α
‑
螺旋和一股β
‑
折叠，可变性较强，推测在稳定蛋白结构上发挥重要作用。
[0104]
实施例3
[0105]
本实施例用于说明功能域asn240
‑
tyr274在角蛋白酶优化上的应用
[0106]
(一)实验方法
[0107]
1、功能域asn240
‑
tyr274重组角蛋白酶表达菌株的构建
[0108]
利用合成生物学方法，以戈壁异常球菌角蛋白酶kerdg1为模板，人工设计将角蛋白酶dgeker功能域asn240
‑
tyr274片段替换kerdg1同源结构asn243
‑
tyr276，重组基因命名为kerdg1
‑
at。
[0109]
通过重组酶连接于pet
‑
28a载体上，构建大肠杆菌表达载体pet28a
‑
kerdg1
‑
at。将该表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)，经pcr、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为bl21
‑
kerdg1
‑
at。
[0110]
2、功能域asn240
‑
tyr274重组角蛋白酶的诱导表达与纯化
[0111]
活化重组菌，挑取单菌落制备种子液；将种子液按od600＝0.1转接至新鲜lb培养基中。37℃培养至od600＝0.5，加入iptg，并转移至16℃进行蛋白表达(过夜)。离心收集菌体，tris
‑
hcl(ph 7.5)重悬菌体。超声破碎菌体，收集上清及沉淀。采用ni
‑
nta琼脂糖凝胶纯化目的角蛋白酶，sds
‑
page检测蛋白。
[0112]
3、角蛋白酶的酶活测定
[0113]
将0.1ml可溶性角蛋白(1％)、0.08ml缓冲液与0.02ml角蛋白酶混匀，对照组加入0.2ml tca、0.08ml缓冲液及0.02ml角蛋白酶；50℃孵育15min；加入0.2ml tca终止反应，对照组加入0.1ml可溶性角蛋白(1％)；4℃、12000rpm/min离心5min；0.2ml上清与1ml na2co3及0.2ml福林混匀；40℃显色反应20min；取0.2ml上清液测680nm处吸光值。
[0114]
4、角蛋白酶温度耐受性及ph耐受性分析
[0115]
酶活性测定体系加入纯化酶液、缓冲液及1％可溶性底物，在30、40、50、60、70、80℃下反应20min，测定角蛋白酶酶活。酶活性测定体系加入纯化酶液、不同ph值缓冲液及底物，在角蛋白酶最适温度下测定角蛋白酶酶活。
[0116]
温度耐受性：提前将纯化角蛋白酶酶液于60℃、70℃预处理5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min后，置于冰上冷却，对照组不做处理，酶活性测定体系及步骤在最适反应温度下测定角蛋白酶残余酶活。
[0117]
ph耐受性：将纯化角蛋白酶酶液置于不同ph缓冲液中于冰上处理预处理1h，酶活性测定体系及步骤于最适温度下测定残余酶活。
[0118]
5、角蛋白酶体外羽毛降解实验
[0119]
将灭菌的完整羽毛加入1.5ml纯化酶中(5mmol/l dtt)，于60℃和70℃、220rpm摇床中孵育，定时拍照观察羽毛降解情况。
[0120]
(二)实验结果
[0121]
利用合成生物学方法，以戈壁异常球菌角蛋白酶kerdg1为模板，将角蛋白酶dgeker功能域asn240
‑
tyr274片段替换kerdg1同源结构asn243
‑
tyr276，重组基因命名为kerdg1
‑
at。利用大肠杆菌表达纯化了kerdg1
‑
at蛋白。体外酶活分析结果显示，重组酶kerdg1
‑
at具有良好的角蛋白酶活性。与改造前的kerdg1相比，kerdg1
‑
at的最适温度从60℃到了70℃，提高了10℃，60℃下酶活稳定性延长了2.39倍。
[0122]
高温条件下羽毛降解能力也大幅度提升。60℃处理下，改造前的角蛋白酶kerdg1孵育100min时，羽毛羽枝开始脱落，反应体系溶液开始变浑浊；而重组角蛋白酶kerdg1
‑
at孵育60min时，羽毛羽枝大量脱落，孵育100min时，羽毛仅剩羽轴残留基本完成降解。70℃处理下，改造前的角蛋白酶kerdg1孵育120min内，羽毛降解较弱，反应体系溶液未见浑浊；而重组角蛋白酶kerdg1
‑
at孵育60min时，羽毛羽枝大量脱落，孵育100min时，羽毛仅剩羽轴残留基本完成降解，热稳定性显著提升。
[0123]
本公开证明了来自嗜热异常球菌的角蛋白酶dgeker具有的高温稳定性，其成熟区α5螺旋结构下游第240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸(asn240
‑
tyr274)结构域的优化具有显著提高角蛋白酶耐高温稳定性的功能。此外角蛋白酶dgeker的asn240
‑
tyr274功能域在商用角蛋白酶热稳定性优化改造中的应用，为工业及环境用角蛋白酶优化提供更多的改良策略。
[0124]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实
施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0125]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0126]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。