靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及超声分子影像学技术领域，特别涉及一种靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂及其制备方法。


背景技术：

2.甲状腺癌是一种内分泌系统的高发病率恶性肿瘤。2016年发表于《英国医学杂志》(british medical journal,bmj)的研究报道表明，90％的甲状腺癌新发病例为微小乳头状癌，生长非常缓慢，几乎不会导致死亡，然而，其具有典型“小病灶，大转移”的临床表现：对周围组织浸润，导致颈、肺部等淋巴结转移，且临床预后较差。
3.大量研究表明，人半乳糖凝集素
‑
3(galectin
‑
3)是一种伴随乳头状甲状腺癌高表达的细胞胞质和包膜抗原。血清学检测结果显示甲状腺癌患者的血清galectin
‑
3水平显著高于对照组。
4.超声成像技术作为一种非侵入性的检查方法，具有方便、快捷、无创、无放射性等优点，已成为甲状腺疾病诊断的首选影像学检查手段，对于甲状腺结节的筛查及鉴别诊断具有显著的优势。近年来发展迅速的超声分子成像技术，可通过显示超声造影剂微气泡的运动、分布，获得甲状腺组织的血管走形、分布及微循环血流灌注，能够客观地反映甲状腺血管的形态学及生物学特征。
5.各肿瘤发生早期的内部新生血管壁通常不完整，其内皮细胞之间存在许多380nm至780nm大小的裂隙；另外，其新生血管缺乏基底膜和平滑肌组织。所以，相比正常组织血管，肿瘤新生血管具有高通透性。
6.不同于大粒径尺度微米级微气泡超声造影剂的显影靶点仅能作用在血管内皮，纳米微气泡超声造影剂的纳米级气泡平均粒径小于肿瘤血管管壁裂隙，能够穿过肿瘤组织的毛细血管壁而进入组织内部聚集，产生整个肿瘤组织的超声增强显影。如果将肿瘤标记分子的特异性配体与纳米微气泡相连接，则会出现更多的纳米微气泡靶向地聚集到肿瘤细胞表面，从而实现针对此肿瘤的高质量特异性超声造影增强。
7.目前尚缺乏一种靶向甲状腺癌、实现高质量特异性超声造影成像的纳米微气泡超声造影剂。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过提供靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，可以实现甲状腺肿瘤的特异性高质量超声造影成像。
9.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
10.本发明提供一种靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，将脂质混悬液微气泡化后，采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂；
11.其中，所述脂质混悬液中包含以下组分：二棕榈磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇
胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物和生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000。
12.优选的是，脂质混悬液中，二棕榈磷脂酰胆碱：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物：生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000的摩尔比为(2
‑
6)：(0.5
‑
1.5)：(0.5
‑
1.5)。
13.本发明提供一种所述的靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
14.步骤1，制备脂质混悬液：按照二棕榈磷脂酰胆碱(dppc)：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物(dspe
‑
peg2000
‑
cooh)：生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000(dspe
‑
peg2000
‑
biotin)的摩尔比为(2
‑
6)：(0.5
‑
1.5)：(0.5
‑
1.5)混合，形成薄膜，再利用薄膜水化法制备成脂质混悬液；
15.步骤2，普通脂质纳米微气泡化造影剂的制备：是将步骤1制备的脂质混悬液经振荡处理进行微气泡化制备得到；
16.步骤3，靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备：是将步骤2制备的普通脂质纳米微气泡化造影剂先后依次加入链霉亲和素和galectin
‑
3抗体，轻微震荡而得到。
17.优选的是，步骤1中二棕榈磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物、生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000按比例混合后，加入氯仿充分溶解混合，然后使氯仿充分挥发后，形成一层厚度均匀的干性脂质薄膜；然后再用预热的水合液水化薄膜，即得到所述的脂质混悬液。
18.优选的是，步骤2中脂质混悬液在注入c3f8惰性气体的真空条件下进行。
19.优选的是，步骤3中，向制备的普通脂质纳米微气泡化造影剂中加入足量链霉亲和素，4℃轻微振荡20
‑
30min后，保留上层的纳米微气泡悬液；然后将galectin
‑
3抗体加入上层的纳米微气泡悬液中，混合均匀，4℃轻微震荡20
‑
30min，获取靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.(1)本发明所制备的脂质纳米微气泡超声造影剂，其纳米微气泡内核的惰性气体c3f8使微气泡具有了优良的稳定性。
22.(2)本发明基于生物素
‑
亲和素桥接法，实现了galectin
‑
3抗体与脂质纳米微气泡壳膜主要组成成分dspe
‑
peg2000
‑
biotin有效、稳定、可靠的偶联；携载galectin
‑
3抗体的脂质纳米微气泡超声造影剂经静脉注入体内后，纳米微气泡可针对甲状腺肿瘤特异性寻靶，靶向地穿越甲状腺肿瘤血管管壁裂隙而进入肿瘤组织聚集，在体外超声的辐照下可获得显著的甲状腺肿瘤组织靶向超声造影增强显影。
23.(3)本发明所制备的靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂中，作为脂质纳米微气泡壳膜另一主要组成成分dspe
‑
peg2000
‑
cooh，可用于连接甲状腺癌抑制药物；在纳米微气泡桥接galectin
‑
3抗体靶向甲状腺癌的前提、以及超声靶向破坏微气泡(utmd)技术综合作用下，可以实现定向靶向甲状腺癌，这为甲状腺癌的筛查提供了重要的依据。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1是通过机械振荡法合成普通脂质纳米微气泡超声造影剂示意图；
26.图2是通过生物素
‑
亲和素法制备桥接galectin
‑
3抗体特异性靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂示意图。
具体实施方式
27.现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
29.二棕榈磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物(dspe
‑
peg2000
‑
cooh)、生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000均购自西安瑞禧生物科技有限公司；galectin
‑
3抗体购自武汉艾美捷科技有限公司。
30.实施例1靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂
31.将脂质混悬液微气泡化后，采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂；
32.其中，所述脂质混悬液中包含以下组分：二棕榈磷脂酰胆碱(dppc)：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物(dspe
‑
peg2000
‑
cooh)：生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000(dspe
‑
peg2000
‑
biotin)的摩尔比为2：0.5：0.5。
33.实施例2靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂
34.将脂质混悬液微气泡化后，采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂；
35.其中，所述脂质混悬液中包含以下组分：二棕榈磷脂酰胆碱(dppc)：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物(dspe
‑
peg2000
‑
cooh)：生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000(dspe
‑
peg2000
‑
biotin)的摩尔比为5：1：1。
36.实施例3靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂
37.将脂质混悬液微气泡化后，采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂；
38.其中，所述脂质混悬液中包含以下组分：二棕榈磷脂酰胆碱(dppc)：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物(dspe
‑
peg2000
‑
cooh)：生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000(dspe
‑
peg2000
‑
biotin)的摩尔比为6：1.5：1.5。
39.实施例4靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法
40.1)采用薄膜水化法配制脂质混悬液：首先，按照摩尔比为2：0.5：0.5，将dppc、dspe
‑
peg2000
‑
cooh和dspe
‑
peg2000
‑
biotin加入旋蒸瓶；随后将氯仿加入旋蒸瓶，使用铝箔纸包裹旋蒸瓶并均匀晃动，使瓶中物质充分地混合溶解；之后，将旋蒸瓶置于旋转蒸发仪上，温度、转速、时间分别设定为50℃、100rpm、10min，促使瓶中的氯仿充分挥发，并在瓶壁上形成一层均匀厚度的干性脂质薄膜；最后，为使薄膜水化，向旋蒸瓶中加入已被预热至37℃的水合液(甘油：pbs＝1:5体积比)，将其置于恒温摇床上，温度、转速、时间分别设定为35
℃、100rpm、50min，直至瓶壁上薄膜脱落，均匀的脂质混悬液形成。
41.2)采用机械振荡法促使脂质纳米微气泡成形，从而合成高浓度脂质纳米微气泡超声造影剂，如图1所示。具体实施过程为：首先，将脂质混悬液置入盖有橡胶瓶塞西林瓶中；然后，使用50ml注射器抽真空后注入惰性气体c3f8，再将西林瓶放置于银汞胶囊调和器上振荡50s，即完成高浓度脂质纳米微气泡超声造影剂制备，完成制备后对造影剂进行
60
co照射30min消毒，置入冰箱冷藏(4℃)保存。
42.3)采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，如图2所示。具体实施过程为：首先，已制备的普通脂质纳米微气泡超声造影剂中加入足量链霉亲和素并轻微振荡，温度置于4℃，30min；然后，加入pbs缓冲液清洗多余的链霉亲和素后静置15min，去除底层较清亮的部分，保留上层的纳米微气泡悬液，整个过程重复3次；进一步，将稀释过的生物素化兔抗山羊galectin
‑
3抗体加入已含有亲和素的脂质纳米微气泡悬液中均匀混合，温度置于4℃，30min，同时轻微振荡；之后，pbs缓冲液清洗多余的galectin
‑
3抗体后静置15min，整个过程重复3次，即获得偶联galectin
‑
3抗体特异性锚定甲状腺的靶向脂质纳米微气泡超声造影剂；最后，对造影剂进行
60
co照射30min消毒，置入冰箱冷藏(4℃)保存。
43.实施例5靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法
44.1)采用薄膜水化法配制脂质混悬液：首先，按照摩尔比摩尔比为5：1：1，将dppc、dspe
‑
peg2000
‑
cooh和dspe
‑
peg2000
‑
biotin加入旋蒸瓶；随后将氯仿加入旋蒸瓶，使用铝箔纸包裹旋蒸瓶并均匀晃动，使瓶中物质充分地混合溶解；之后，将旋蒸瓶置于旋转蒸发仪上，温度、转速、时间分别设定为55℃、130rpm、15min，促使瓶中的氯仿充分挥发，并在瓶壁上形成一层均匀厚度的干性脂质薄膜；最后，为使薄膜水化，向旋蒸瓶中加入已被预热至37℃的水合液(甘油：pbs＝1:9体积比)，将其置于恒温摇床上，温度、转速、时间分别设定为37℃、120rpm、60min，直至瓶壁上薄膜脱落，均匀的脂质混悬液形成。
45.2)采用机械振荡法促使脂质纳米微气泡成形，从而合成高浓度脂质纳米微气泡超声造影剂，如图1所示。具体实施过程为：首先，将脂质混悬液置入盖有橡胶瓶塞西林瓶中；然后，使用50ml注射器抽真空后注入惰性气体c3f8，再将西林瓶放置于银汞胶囊调和器上振荡100s，即完成高浓度脂质纳米微气泡超声造影剂制备，完成制备后对造影剂进行
60
co照射30min消毒，置入冰箱冷藏(4℃)保存。
46.3)采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，如图2所示。具体实施过程为：首先，已制备的普通脂质纳米微气泡超声造影剂中加入足量链霉亲和素并轻微振荡，温度置于4℃，30min；然后，加入pbs缓冲液清洗多余的链霉亲和素后静置15min，去除底层较清亮的部分，保留上层的纳米微气泡悬液，整个过程重复3次；进一步，将稀释过的生物素化兔抗山羊galectin
‑
3抗体加入已含有亲和素的脂质纳米微气泡悬液中均匀混合，温度置于4℃，30min，同时轻微振荡；之后，pbs缓冲液清洗多余的galectin
‑
3抗体后静置15min，整个过程重复3次，即获得偶联galectin
‑
3抗体特异性靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂；最后，对造影剂进行
60
co照射30min消毒，置入冰箱冷藏(4℃)保存。
47.实施例6靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法
48.1)采用薄膜水化法配制脂质混悬液：首先，按照摩尔比摩尔比为6：1.5：1.5，将dppc、dspe
‑
peg2000
‑
cooh和dspe
‑
peg2000
‑
biotin加入旋蒸瓶；随后将氯仿加入旋蒸瓶，使
用铝箔纸包裹旋蒸瓶并均匀晃动，使瓶中物质充分地混合溶解；之后，将旋蒸瓶置于旋转蒸发仪上，温度、转速、时间分别设定为60℃、120rpm、10min，促使瓶中的氯仿充分挥发，并在瓶壁上形成一层均匀厚度的干性脂质薄膜；最后，为使薄膜水化，向旋蒸瓶中加入已被预热至37℃的水合液(甘油：pbs＝1:9体积比)，将其置于恒温摇床上，温度、转速、时间分别设定为39℃、150rpm、60min，直至瓶壁上薄膜脱落，均匀的脂质混悬液形成。
49.2)采用机械振荡法促使脂质纳米微气泡成形，从而合成高浓度脂质纳米微气泡超声造影剂，如图1所示。具体实施过程为：首先，将脂质混悬液置入盖有橡胶瓶塞西林瓶中；然后，使用50ml注射器抽真空后注入惰性气体c3f8，再将西林瓶放置于银汞胶囊调和器上振荡120s，即完成高浓度脂质纳米微气泡超声造影剂制备，完成制备后对造影剂进行
60
co照射30min消毒，置入冰箱冷藏(4℃)保存。
50.3)采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，如图2所示。具体实施过程为：首先，已制备的普通脂质纳米微气泡超声造影剂中加入足量链霉亲和素并轻微振荡，温度置于4℃，30min；然后，加入pbs缓冲液清洗多余的链霉亲和素后静置15min，去除底层较清亮的部分，保留上层的纳米微气泡悬液，整个过程重复3次；进一步，将稀释过的生物素化兔抗山羊galectin
‑
3抗体加入已含有亲和素的脂质纳米微气泡悬液中均匀混合，温度置于4℃，30min，同时轻微振荡；之后，pbs缓冲液清洗多余的galectin
‑
3抗体后静置15min，整个过程重复3次，即获得偶联galectin
‑
3抗体特异性靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂；最后，对造影剂进行
60
co照射30min消毒，置入冰箱冷藏(4℃)保存。
51.实施例7靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的应用
52.参照文献“israel ms,ellis ri.the neoplastic potentialities of mouse thyroid under extreme stimulation[j].”，诱发大鼠甲状腺癌模型，后用3％的戊巴比妥钠腹部注射30mg/kg，待大鼠完全麻醉后，右颈部小心脱毛，对大鼠颈部进行未注射造影剂的超声检查，记录基础状态下的图像；进一步，在大鼠尾静脉建立外周静脉通道，通道末端连接三通管，其中一个通道用于注射本发明制备的纳米微气泡超声造影剂，一个通道尾随注射生理盐水；第一步，将生理盐水1ml/kg经外周静脉通道注入大鼠体内，超声条件下再次观察并记录甲状腺癌组织状态；第二步，将本发明制备的纳米微气泡超声造影剂1ml/kg经大鼠耳缘静脉团注，即刻尾随1ml生理盐水冲洗管道，在脉冲反向谐波模式下，实时动态观察并记录大鼠颈部回声强度情况。第三步，经多次、多只大鼠进行上述相同实验后，分析、对比及统计实验数据。结果发现：未注射本发明纳米微气泡超声造影剂时(仅生理盐水)，在视野仅见少量回声信号(信号/探测面积比<10％以下)；而注射纳米微气泡超声造影剂后，在体外超声的辐照下，获得显著的甲状腺肿瘤组织靶向超声造影增强显影信号。因此，纳米微气泡超声造影剂针对甲状腺肿瘤产生特异性寻靶，靶向地穿越甲状腺肿瘤血管管壁裂隙而进入肿瘤组织聚集。
[0053]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，其特征在于，将脂质混悬液微气泡化后，采用生物素
‑
亲和素桥接法制备靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂；其中，所述脂质混悬液中包含以下组分：二棕榈磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物和生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000。2.如权利要求1所述的靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，其特征在于，脂质混悬液中，二棕榈磷脂酰胆碱：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物：生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000的摩尔比为(2
‑
6)：(0.5
‑
1.5)：(0.5
‑
1.5)。3.一种如权利要求1所述的靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，制备脂质混悬液：按照二棕榈磷脂酰胆碱：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物：生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000的摩尔比为(2
‑
6)：(0.5
‑
1.5)：(0.5
‑
1.5)混合，形成薄膜，再利用薄膜水化法制备成脂质混悬液；步骤2，普通脂质纳米微气泡化造影剂的制备：是将步骤1制备的脂质混悬液经振荡处理进行微气泡化制备得到；步骤3，靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备：将步骤2制备的普通脂质纳米微气泡化造影剂先后依次加入链霉亲和素和galectin
‑
3抗体，轻微震荡而得到。4.如权利要求3所述的靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法，其特征在于，步骤1中二棕榈磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000
‑
羧基交连物、生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000按比例混合后，加入氯仿充分溶解混合，然后使氯仿充分挥发后，形成一层厚度均匀的干性脂质薄膜；然后再用预热的水合液水化薄膜，即得到所述的脂质混悬液。5.如权利要求3所述的靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法，其特征在于，步骤2中脂质混悬液在注入c3f8惰性气体的真空条件下进行。6.如权利要求3所述的靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，向制备的普通脂质纳米微气泡化造影剂中加入足量链霉亲和素，4℃轻微振荡20
‑
30min后，保留上层的纳米微气泡悬液；然后将galectin
‑
3抗体加入上层的纳米微气泡悬液中，混合均匀，4℃轻微震荡20
‑
30min，获取靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂。
技术总结
本发明公开了一种靶向甲状腺癌的纳米微气泡超声造影剂，是将脂质混悬液微气泡化后，采用生物素


技术研发人员：刘娜 范清雨 张浩 樊帆
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29