本发明涉及化合物检测
技术领域：
，特别是涉及一种基于uplc-msms检测糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba的方法。
背景技术：
：呋喃磺草酮，2-{2-氯-4-甲磺酰基-3-[(rs)-四氢呋喃-2-基甲氧基甲基]苯甲酰基}环已烷-1,3-二酮，英文通用名tefuryltrione，cas登录号473278-76-1，是由拜耳作物科学公司和日本法库化学工业公司共同开发的一种新型水稻种植除草剂。呋喃磺草酮属三酮类除草剂，为4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶(hppd)抑制剂，可抑制植物生长中不可或缺的色素合成，通过根、茎、幼芽、叶吸收并迅速传导。hppd是目前最重要的除草剂作用靶标之一。hppd是植物体正常生长所必需的质体醌和生育酚生物合成路径中的关键酶，能够催化植株中从酪氨酸到质体醌的生化过程。呋喃磺草酮通过抑制hppd，最终影响类胡萝卜素的生物合成。呋喃磺草酮的选择性源于其在水稻和杂草中的代谢作用的不同(在作物中代谢为4-羟基衍生物)，也可能由于作物对其叶面吸收要慢于杂草。呋喃磺草酮主要通过叶面和根部吸收，并在木质部和韧皮部向顶和向基传导，分布于整个植株。杂草受药后，叶面白化，继而分生组织坏死。呋喃磺草酮主要用作水稻、玉米以及温室蔬菜的苗前或苗后除草剂。如今呋喃磺草酮被广泛应用于中国、日本、韩国等亚洲国家的水稻种植过程中以达到控制稗草、鸭舌草、陌上菜等一年生杂草及水莎草、矮慈姑等多年生阔叶杂草。与现有的磺酰脲类除草剂相比，呋喃磺草胺具有杀草谱更广，水稻除草使用期更宽的特性，对抗磺酰脲类的阔叶杂草、莎草高效防除，如萤蔺、陌上菜、鸭舌草、雨久花、白花水八角、泽泻等。随着呋喃磺草酮的专利到期，我国对呋喃磺草酮的使用量必然会大幅度增长，对于糙米、稻壳和秸秆中的呋喃磺草酮及其代谢物cmtba的定性和定量的检测方法给人们提出了挑战。目前报道的检测方法主要是高效液相色谱法检测呋喃磺草酮，然而，高效液相色谱法检测结果不够准确，也无法精确定量分析。高效液相色谱法并不能同时测定糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba。因此，寻找一种高效、准确、简便的检测新方法对于糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba残留污染的严格控制具有重要的意义。技术实现要素：本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基于uplc-msms检测糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba的方法，该方法操作简便，快捷，准确，高效，不仅可以定性分析还可以定量分析测定。解决上述技术问题的技术方案如下：基于uplc-msms检测糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba的方法，包括以下步骤：(1)提取分别称取待测糙米10.0g，待测稻壳和秸秆各5.0g于50ml离心管中，加入20ml甲酸乙腈，所述的甲酸乙腈体积浓度为0.2％，涡旋提取至少15min，加入5gnacl，涡旋至少2min，5000r/min离心至少5min，取上层有机相1ml置于2ml离心管中；(2)净化在步骤(1)所述的2ml离心管中加入50mg固体填料psa(n-丙基乙二胺)，涡旋至少1min后，于10000r/min的转速下离心至少5min，过0.22μm有机滤膜；(3)检测将步骤(2)得到的净化待测物经过uplc-msms法进行检测；uplc参数为：色谱柱：acquityhsst3(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温：35℃，流速：0.25ml/min，进样量：2μl，梯度洗脱条件如表1所示：t/min流速(ml/min)乙腈(％)0.1％甲酸水(％)0.00.3010901.00.3010901.50.3090103.00.3090103.10.3010905.00.301090msms条件为离子源：电喷雾离子源esi；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：1000l/h；锥孔气流量：150l/h；检测方式：多重反应监测(mrm)如表2所示：(4)定性测定在相同检测条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差在±2.5％之内，则判断样品中存在对应的待测物。所述的标准工作溶液中的保留时间为呋喃磺草酮为1.97min，cmtba为1.92min。所述的偏差为相对标准偏差(rsd)，计算公式如下：式中：rsd为相对标准偏差；rn为第n个重复的回收率，n＝5；为平均回收率。(5)定量测定定性判断含有对应待测物的样品进一步定量测定，具体步骤如下：标准工作液与试样交替进样，采用单点或多点校准，外标法定量；当样品的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定；样品中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba含量按公式(1)计算：式中：x为样品中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；c为从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml)；v为试样溶液定容体积，单位为毫升(ml)；m为试样的质量，单位为克(g)；平行测定结果用算术平均值表示，计算结果保留小数点后两位有效数字。本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于uplc-msms检测糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba的方法，通过uplc-msms检测出待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差数，定性分析是否含有目标物。对于含有目标物的样品溶液，进一步进行定量测定，通过uplc-msms检测出待测物监测离子峰面积，与标准曲线对比，计算出目标物在样品溶液中的浓度。通过添加回收率验证本发明的正确度，通过相对标准偏差rsd验证本发明的精密度，以最小添加回收浓度作为方法的定量限，在本发明uplc-msms条件下呋喃磺草酮在糙米中的最低检出浓度为0.01mg/kg，在稻壳中为0.01mg/kg，在秸秆中为0.01mg/kg；cmtba在糙米中的最低检出浓度为0.01mg/kg，在稻壳中为0.01mg/kg，在秸秆中为0.01mg/kg。说明该方法操作简便，快捷，准确，高效，不仅可以定性分析还可以定量分析测定。是可同时测定糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba的方法。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。图1为呋喃磺草酮的标准曲线，横坐标为样品标液浓度，纵坐标为uplc-msms的峰面积；图2为cmtba的标准曲线，横坐标为样品标液浓度，纵坐标为uplc-msms的峰面积。具体实施方式实施例1：(1)提取分别称取待测糙米10.0g，待测稻壳和秸秆各5.0g于50ml离心管中，加入浓度为0.2％的甲酸乙腈20ml，涡旋提取15min，加入5gnacl，涡旋2min，5000r/min离心5min，取上层有机相1ml置于2ml离心管中；(2)净化在步骤(1)的2ml离心管中加入50mgpsa，涡旋至少1min后，于10000r/min的转速下离心5min，过0.22μm有机滤膜；(3)检测将步骤(2)得到的净化待测物经过uplc-msms法进行检测；uplc参数为：色谱柱：acquityhsst3(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温：35℃，流速：0.25ml/min，进样量：2μl，梯度洗脱条件如下表1所示：t/min流速(ml/min)乙腈(％)0.1％甲酸水(％)0.00.3010901.00.3010901.50.3090103.00.3090103.10.3010905.00.301090msms条件为离子源：电喷雾离子源esi；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：1000l/h；锥孔气流量：150l/h；检测方式：多重反应监测(mrm)如下表2所示：(4)定性测定在相同检测条件下，待测物在样品中的保留时间与呋喃磺草酮标准工作溶液中的保留时间1.97min的偏差在±2.5％之内，因此，判断样品中至少含有呋喃磺草酮，与cmtba标准工作溶液中的保留时间1.92min的偏差在±2.5％之内，因此，判断样品中还含有cmtba。(5)进一步定量测定标准工作液与试样交替进样，采用单点或多点校准，外标法定量；当样品的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定；样品中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba含量按公式(1)计算：式中：x为样品中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；c为从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml)；v为试样溶液定容体积，单位为毫升(ml)；m为试样的质量，单位为克(g)；平行测定结果用算术平均值表示，计算结果保留小数点后两位有效数字。其中，标准曲线的制作步骤如下：(1)呋喃磺草酮的标准曲线将呋喃磺草酮标准储备液用乙腈稀释至100mg/l的工作液。将工作液用乙腈稀释配得0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mg/l系列标准溶液，在本发明所述的uplc-msms条件下进行测定，以呋喃磺草酮标准溶液浓度与监测离子峰面积作标准曲线。标样线性方程为：y＝4×107x-41197，相关系数为：r＝0.9994；其中y为呋喃磺草酮监测离子峰面积，x为呋喃磺草酮标准溶液浓度，具体数据结果如表3所示，氟酮磺草胺的标准曲线如图1所示。表3呋喃磺草酮的标准曲线(2)cmtba的标准曲线将cmtba标准储备液用乙腈稀释至100mg/l的工作液。将工作液用乙腈稀释配得0.001、0.005、0.01、0.1、0.5mg/l系列标准溶液，在本发明所述的uplc-msms条件下进行测定，以cmtba标准溶液浓度与监测离子峰面积作标准曲线。标样线性方程为：y＝6×106x 3648.4，相关系数为：r＝0.9993；其中y为cmtba监测离子峰面积，x为cmtba标准溶液浓度，具体数据结果如表4所示，cmtba的标准曲线如图2所示。表4cmtba的标准曲线通过添加回收率验证本发明的正确度，通过相对标准偏差rsd验证本发明的精密度，以最小添加回收浓度作为本发明方法的定量限。(1)添加回收率以添加回收率评价正确度。分别在空白糙米、稻壳和秸秆中添加3档浓度的呋喃磺草酮和cmtba标准溶液，每档重复5次，用本发明uplc-msms分析方法测定并计算回收率。其中，回收率(r)的计算公式如下：式中：r为回收率；are为添加回收样品的峰面积；astd为基质匹配标准溶液样品的峰面积。呋喃磺草酮在糙米中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，平均回收率为92～94％；呋喃磺草酮在稻壳中的添加浓度为0.01、0.5、1.0mg/kg，平均回收率为74～95％；呋喃磺草酮在秸秆中的添加浓度为0.01、0.5、1.0mg/kg，平均回收率为78～94％。cmtba在糙米中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，平均回收率为76～96％；cmtba在稻壳中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，平均回收率为87～104％；cmtba在秸秆中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，平均回收率为97～99％。(2)精密度以相对标准偏差(rsd)评价精密度，分别在空白糙米、稻壳和秸秆中添加3档浓度的呋喃磺草酮和cmtba标准溶液，每档重复5次，用本发明uplc-msms分析方法测定并计算相对标准偏差。计算公式如下：式中：rsd为相对标准偏差；rn为第n个重复的回收率，n＝5；为平均回收率。呋喃磺草酮在糙米中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，相对标准偏差(rsd)为0.9～1.3％；呋喃磺草酮在稻壳中的添加浓度为0.01、0.5、1.0mg/kg，相对标准偏差(rsd)为1.3～2.3％；呋喃磺草酮在秸秆中的添加浓度为0.01、0.5、1.0mg/kg，相对标准偏差(rsd)为3.6～5.9％。cmtba在糙米中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，相对标准偏差(rsd)为3.9～6.4％；cmtba在稻壳中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，相对标准偏差(rsd)为4.1～7.9％；cmtba在秸秆中的添加浓度为0.01、0.05、0.1mg/kg，相对标准偏差(rsd)为3.9～6.4％。(3)定量限以最小添加回收浓度作为方法的定量限，在本发明uplc-msms条件下呋喃磺草酮在糙米中的最低检出浓度为0.01mg/kg，在稻壳中为0.01mg/kg，在秸秆中为0.01mg/kg；cmtba在糙米中的最低检出浓度为0.01mg/kg，在稻壳中为0.01mg/kg，在秸秆中为0.01mg/kg。结果说明，该方法分析速度快，试剂用量较小，净化效果理想；方法回收率高，在85.9％～105.5％之间，检测限低，重复性好，稳定可靠，能够满足我国及欧盟的残留限量要求，应用于实际样品的检测，得到满意的结果，符合农药残留分析从繁琐的传统方法向快速、简便的方法发展趋势，具有一定的实际应用参考价值。实施例2：(1)提取分别称取待测糙米10.0g，待测稻壳和秸秆各5.0g于50ml离心管中，加入浓度为0.2％的甲酸乙腈20ml，涡旋提取15min，加入5gnacl，涡旋2min，5000r/min离心5min，取上层有机相1ml置于2ml离心管中；(2)净化在步骤(1)所述的2ml离心管中加入50mgpsa，涡旋1min后，于10000r/min的转速下离心5min，过0.22μm有机滤膜；(3)检测将步骤(2)得到的净化待测物经过uplc-msms法进行检测；uplc参数为：色谱柱：acquityhsst3(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温：35℃，流速：0.25ml/min，进样量：2μl，梯度洗脱条件如下表1所示：t/min流速(ml/min)乙腈(％)0.1％甲酸水(％)0.00.3010901.00.3010901.50.3090103.00.3090103.10.3010905.00.301090msms条件为离子源：电喷雾离子源esi；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：1000l/h；锥孔气流量：150l/h；检测方式：多重反应监测(mrm)如下表2所示：(4)定性测定在相同检测条件下，待测物在样品中的保留时间与呋喃磺草酮标准工作溶液中的保留时间1.97min的偏差在±2.5％之内，因此，判断样品中至少含有呋喃磺草酮，与cmtba标准工作溶液中的保留时间1.92min的偏差为4.5％，因此，判断样品中不含有cmtba。再进一步对样品中含有呋喃磺草酮的量进行分析。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。当前第1页1 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技术特征：1.基于uplc-msms检测糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物的方法，所述的代谢物为cmtba，其特征在于，采用甲酸乙腈对待测物样品进行萃取，萃取液经过净化后采取uplc-msms法进行检测，定性测定含有目标物的样品进一步定量测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取
分别称取待测糙米10.0g，待测稻壳和秸秆各5.0g于50ml离心管中，加入20ml甲酸乙腈，所述的甲酸乙腈体积浓度为0.2％，涡旋提取至少15min，加入5gnacl，涡旋至少2min，5000r/min离心至少5min，取上层有机相1ml置于2ml离心管中；
(2)净化
在步骤(1)所述的2ml离心管中加入50mgpsa，涡旋至少1min后，于10000r/min的转速下离心至少5min，过0.22μm有机滤膜；
(3)检测
将步骤(2)得到的净化待测物经过uplc-msms法进行检测；
(4)定性测定
在相同检测条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间对比，判断样品中是否存在对应的待测物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测的uplc参数为：色谱柱：acquityhsst3(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温：35℃，流速：0.25ml/min，进样量：2μl，梯度洗脱条件如下表1所示：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测的msms条件为离子源：电喷雾离子源esi；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：1000l/h；锥孔气流量：150l/h；检测方式：多重反应监测(mrm)如下表2所示：
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的定性测定是在相同检测条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差在±2.5％之内，则判断样品中存在对应的待测物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，定性判断含有对应待测物的样品进一步定量测定，所述定量测定的步骤如下：
标准工作液与试样交替进样，采用单点或多点校准，外标法定量；当样品的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定；样品中呋喃磺草酮及其代谢物cmtba含量按公式(1)计算：
式中：
x为样品中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
c为从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml)；
v为试样溶液定容体积，单位为毫升(ml)；
m为试样的质量，单位为克(g)；
平行测定结果用算术平均值表示，计算结果保留小数点后两位有效数字。
技术总结本发明涉及化合物检测技术领域，特别是涉及一种基于UPLC‑MSMS检测糙米、稻壳和秸秆中呋喃磺草酮及其代谢物CMTBA的方法，采用甲酸乙腈对待测物样品进行萃取，萃取液经过净化后，通过UPLC‑MSMS检测出待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差数，定性分析是否含有目标物。对于含有目标物的样品溶液，进一步进行定量测定，通过UPLC‑MSMS检测出待测物监测离子峰面积，与标准曲线对比，计算出目标物在样品溶液中的浓度。该方法操作简便，快捷，准确，高效，不仅可以定性分析还可以定量分析测定。
技术研发人员：陈国峰;刘峰;张晓波;董见南;廖辉;张瑞英;程爱华;史冬梅;金海涛;潘博;任红波;马文琼;李宛;孙丽荣;滕瑶;孙悦萍
受保护的技术使用者：黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所
技术研发日：2021.05.13
技术公布日：2021.08.03
