本发明涉及药品检测技术领域，尤其涉及一种快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法。
背景技术：
目前市场上出现减肥、瘦身类中成药和减肥类保健食品及瘦身产品中非法添加比沙可啶化学品，主要用于治疗便秘，手术前后肠道清洁等，因而具有减肥功效，但不规范使用可能造成腹部绞痛、过度腹泻、直肠炎等，对人民的身体健康造成损害。目前该物质缺乏快速准确的检测方法，主要检测手段仍然停留在非水滴定法、液相色谱法等，检测速度慢、准确度较低，且易出现“假阳性”、“假阴性”的情况。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，可快速、灵敏且最终能确证产品中的比沙可啶，解决出现“假阳性”、“假阴性”情况。本发明采用的技术方案是：
一种快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，包括如下步骤：
(1)将比沙可啶对照品溶于丙酮中，得到第一对照品溶液，并将供试品和阴性样品溶于丙酮并稀释分别得到第一供试品溶液和第一阴性样品溶液，取第一供试品溶液和第一对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板，以二甲苯-丁酮为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯下检视，第一供试品溶液薄层色谱应不得检出与第一对照品溶液薄层色谱所显主斑点位置和颜色一致的主斑点，若检出相应主斑点，则进一步通过液相色谱仪进行筛查；
(2)将比沙可啶对照品、供试品和阴性样品分别溶于甲醇中溶解并稀释，得到第二对照品溶液、第二供试品溶液和第二阴性样品溶液，将第二供试品溶液和第二对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图及dad光谱图，若检出与对照品色谱保留时间及dad光谱一致的色谱峰，则第二供试品溶液呈阳性，之后采用液相色谱-质谱联用仪确证；
(3)取步骤(2)中检出阳性的第二供试品溶液，并取第二对照品溶液和第二阴性样品溶液依次注入液相色谱-质谱联用仪，记录液相色谱图及一级质谱图和二级质谱图，第二供试品溶液的色谱图中，应不得检出与第二对照品溶液色谱保留时间、一级质谱图一致的色谱峰，若检出相应的色谱峰，且一级质谱、二级质谱图一致则确定非法添加比沙可啶。
优选的是，所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，所述液相色谱仪的检测条件如下：
液相色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测器：二极管阵列检测器；
检测波长：265nm；
扫描波长：210-400nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml·min-1；
流动相：乙腈-水，乙腈和水的体积比为45:55。
优选的是，所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱检测条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测波长：265nm；
流动相：乙腈-0.01mol·l-1醋酸铵溶液(0.1％甲酸)，乙腈和醋酸铵溶液的体积比为40：60；
流速：0.3ml·min-1。
优选的是，所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，所述液相色谱-质谱联用仪的质谱检测条件如下：
配有电喷雾离子化源，esi 扫描；
干燥气温度：350℃；
毛细管电压：3.5kv；
锥孔电压：120v；
干燥气温度：350℃；
干燥气流量：10l·min-1；
扫描方式：一级质谱全扫描、二级质谱扫描；
扫描范围：100-1000。
优选的是，所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，所述第一对照品溶液的制备方法具体为：取比沙可啶对照品，用丙酮溶解并稀释，制成每1ml含1mg的第一对照品溶液。
优选的是，所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，所述第二对照品溶液的制备方法具体为：取比沙可啶对照品，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含1mg的第二对照品溶液。
优选的是，所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，所述第一供试品溶液的制备方法具体为：取第一若供试品为固体制剂，研细，精密称取一次取用量，用丙酮溶解并稀释；若供试品为液体制剂，摇匀，精密量取一次取用量用丙酮溶解并稀释；滤过，取滤液作为供试品溶液。
优选的是，所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其中，所述第二供试品溶液的制备方法具体为：
若供试品为固体制剂，研细，精密称取一次取用量，置量瓶中，加甲醇，超声处理后，放至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过；若供试品为液体制剂，摇匀，精密量取一次取用量，置量瓶中，加甲醇，振摇，加甲醇稀释至刻度，摇匀，摇匀后用微孔滤膜滤过；滤液作为第二供试品溶液。
本发明的优点在于：本发明的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，建立了一种减肥、瘦身类中成药和减肥类保健食品及瘦身产品中非法添加比沙可啶化学物质补充检验方法，使用薄层色谱法、高效液相色谱法定性筛查和定量，液质联用法准确确证，既能适用于基层大批量筛选，又能避免假阳性结果，经验证，本方法灵敏度高、选择性好、确证性强、操作简便快捷，可用于减肥、瘦身类中成药和减肥类保健食品及瘦身产品中非法添加比沙可啶的定性筛查和准确确认，为药品监督管理部门、公安系统对减肥类中成药及保健品的打假工作提供可靠的技术支持，保证人民饮食用药安全。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例薄层色谱图。
图2为本发明实施例第二对照品溶液的色谱图。
图3为本发明实施例第二对照品溶液色谱峰的光谱扫描图。
图4为本发明实施例第二供试品溶液的色谱图。
图5为本发明实施例第二供试品溶液的光谱扫描图。
图6为本发明实施例第二阴性供试品溶液的色谱图。
图7为本发明实施例第二阴性供试品的光谱扫描图。
图8为本发明实施例第二阴性样品溶液的色谱图。
图9为本发明实施例第二阴性样品溶液的质谱图。
图10为本发明实施例第二对照品溶液的色谱图。
图11为本发明实施例第二对照品溶液的质谱图。
图12为本发明实施例第二对照品溶液的一级质谱图。
图13为本发明实施例第二对照品溶液的二级质谱图。
图14为本发明实施例第二供试品溶液色谱图。
图15为本发明实施例第二供试品溶液质谱图。
图16为本发明实施例第二供试品溶液的一级质谱图。
图17为本发明实施例第二供试品溶液的二级质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明
一种快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，主要方法是高效液相色谱法，方法验证内容：专属性、检出限；液质联用法采用uhplc-qtofms仪，高分辨一级质谱图、二级质谱图确认。
具体方法包括如下步骤：
(一)试验材料
1、供试品：阳性样品：百草公主魔纤压片糖果(升级版)赠品圆形粉色片剂；阴性样品：果蔬纤维营养片赠品，均为无锡市市场监督管理局供样。
2、对照品：比沙可啶，批号：100181-201403，规格100mg/支，购自中国食品药品检定研究院。
3、试剂：见下表1
4、仪器：见下表2
(二)试验方法
(ⅰ)筛查系统
(1)薄层色谱法
1、展开系统
硅胶gf254薄层板，以二甲苯-丁酮(1:1)为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯(366nm)下检视。
2、样品制备方法
2.1第一对照品溶液的制备
取比沙可啶对照品，用丙酮溶解并稀释，制成每1ml含1mg的第一对照品溶液。
2.2第一供试品溶液的制备
取样品2粒，研细，加丙酮5-10ml，溶解并滤过，取续滤液作为第一供试品溶液。第一阴性样品同法制备。
3、专属性
分别取第一供试品溶液和第一对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板，以二甲苯-丁酮(1:1)为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯(366nm)下检视。薄层色谱图如图1所示，图1中，第一供试品溶液中检出与第一对照品薄层色谱所显主斑点位置(和颜色)一致的主斑点，阴性样品溶液则未检出，检测出主斑点的第一供试品溶液作为阳性样品溶液。
(2)高效液相色谱法
1、色谱条件及样品制备方法：
1.1色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶xbridgec18(4.6×250mm，内径5μm，批号01313725014030)；流动相：乙腈-水(45:55)，二极管阵列检测器，检测波长为265nm，扫描波长：210-400nm；柱温：35℃；流速：1.0ml·min-1；进样体积：10μl；理论塔板数以比沙可啶计算，应不低于2000。
1.2样品制备方法
1.2.1第二对照品溶液的制备
取比沙可啶对照品，加甲醇溶解并制成每1ml含0.1mg的溶液作为第二对照品溶液。
1.2.2第二供试品溶液的制备
取阳性样品2粒，研细，加甲醇15ml，超声10分钟并时时振摇，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为第二供试品溶液，第二阴性样品同法制备。
2、专属性
分别精密吸取第二供试品溶液和第二对照品溶液各10μl,注入色谱仪，记录图谱。将浓度为0.1mg·ml-1的第二对照品溶液进样10μl，色谱图及光谱图如图2、3所示：图2中4.5min色谱峰为第二对照品的色谱峰，图3为第二对照品色谱峰的光谱扫描图。
将按上述制备方法制备的第二供试品溶液进样10μl，色谱图如图4、5所示：图4中4.5min色谱峰为第二供试品中比沙可啶的色谱峰，图5为第二供试品中比沙可啶的光谱扫描图。
将按上述制备方法制备的第二阴性供试品溶液进样10μl，色谱图和光谱扫描图如图6和图7所示：图6中4.5min色谱峰为无比沙可啶的色谱峰。
结果第二供试品溶液中出现与比沙可啶对照品保留时间一致的色谱峰，且其dad光谱一致，阴性供试品溶液中未出现与对照品保留时间一致的色谱峰，出现比沙可啶对照品保留时间一致的色谱峰的第二供试品溶液作为阳性样品。
(ii)、确证系统--液相色谱-质谱联用法
1、色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱规格为100mm*2.1mm,1.8μm),以乙腈-0.01mol·l-1醋酸铵溶液(0.1％甲酸)(40:60)为流动相；流速：0.3ml·ml-1；检测波长为265nm。
2、质谱条件
配有电喷雾离子化源，esi 扫描，干燥气温度：350℃，毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：120v，干燥气流量：10l·min-1，扫描方式：一级质谱全扫描、二级质谱扫描，扫描范围：100-1000
3、第二对照品溶液的制备
取比沙可啶对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇适量,超声处理10分钟使溶解，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
4、第二供试品溶液的制备
取高效液相色谱法检查呈阳性的第二供试品溶液作为本项目检查用的供试品溶液，用甲醇稀释为与对照品浓度相近的溶液。
5、测定法
取第二供试品溶液和第二对照品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱、质谱图。
6、结果：第二供试品色谱图中，出现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰，且其一级质谱及二级质谱均与第二对照品一致，如图8、9、10、11、12、13、14、15、16、17所示。图8和图9为第二阴性样品溶液的色谱图和质谱图，未出现8.75min的色谱峰；图10和图11为第二对照品溶液色谱图和质谱图，出现8.75min色谱峰为比沙可啶；图12为第二对照品的一级质谱，准分子离子峰为362.1415(比沙可啶的准分子离子比沙可啶分子离子为准)；图13为第二对照品的二级质谱图，主要离子碎片为m/z154.0647,167.0724,184.0753；图14和图15为第二供试品色谱图和质谱图，出现保留时间8.77min色谱峰为比沙可啶；图16为第二供试品的一级质谱图，准分子离子峰为362.1409；图17为第二供试品的二级质谱图，主要离子碎片m/z154.0646,167.0724,184.0751。
表3比沙可啶hplc/ms/ms
样品中未知物与对照品一级、二级质谱均一致，阳性样品[m h] 362.1409比沙可啶(c22h19no4)理论[m h] m/z362.1415，误差为-0.17ppm，误差小于5ppm,可以认为阳性样品中未知物为比沙可啶c22h19no4。
结论如下：
1.薄层色谱法：专属性试验表明：阳性样品中出现与对照品主斑点位置和颜色一致的主斑点。
2.液相色谱法：专属性试验表明：阳性样品中出现与对照品保留时间相同的色谱峰，dad光谱图均与对照品一致。
3.液相色谱-质谱联用法：供试品色谱图中，出现与对照品色谱保留时间的色谱峰，且其一级质谱及二级质谱均与对照品一致，一级[m h] 362.1415，二级154.0647,167.0724,184.0753阳性样品[m h] m/z362.1409,比沙可啶(c22h19no4)理论[m h] m/z362.1415，误差为-0.17ppm，误差小于5ppm，可以认为阳性样品中未知物为比沙可啶c22h19no4综上，实验结果均满足要求，表明本法可专属、灵敏、快速、准确地初筛和确证瘦身减肥类中成药和保健食品中非法添加比沙可啶。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
1.一种快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将比沙可啶对照品溶于丙酮中，得到第一对照品溶液，并将供试品和阴性样品溶于丙酮并稀释分别得到第一供试品溶液和第一阴性样品溶液，取第一供试品溶液和第一对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板，以二甲苯-丁酮为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯下检视，第一供试品溶液薄层色谱应不得检出与第一对照品溶液薄层色谱所显主斑点位置和颜色一致的主斑点，若检出相应主斑点，则进一步通过液相色谱仪进行筛查；
（2）将步骤（1）的比沙可啶对照品、供试品和阴性样品分别溶于甲醇中溶解并稀释，得到第二对照品溶液、第二供试品溶液和第二阴性样品溶液，将第二供试品溶液和第二对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图及dad光谱图，若检出与对照品色谱保留时间及dad光谱一致的色谱峰，则第二供试品溶液呈阳性，之后采用液相色谱-质谱联用仪确证；
（3）取步骤（2）中检出阳性的第二供试品溶液，并取第二对照品溶液和第二阴性样品溶液依次注入液相色谱-质谱联用仪，记录液相色谱图及一级质谱图和二级质谱图，第二供试品溶液的色谱图中，应不得检出与第二对照品溶液色谱保留时间、一级质谱图一致的色谱峰，若检出相应的色谱峰，则确定非法添加比沙可啶。
2.如权利要求1所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，所述液相色谱仪的检测条件如下：
液相色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测器：二极管阵列检测器；
检测波长：265nm；
扫描波长：210-400nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml•min-1；
流动相：乙腈-水，乙腈和水的体积比为45:55。
3.如权利要求1所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱检测条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测波长：265nm；
流动相：乙腈-0.01mol•l-1醋酸铵溶液（0.1%甲酸），乙腈和醋酸铵溶液的体积比为40：60；
流速：0.3ml•min-1。
4.如权利要求3所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪的质谱检测条件如下：
配有电喷雾离子化源，esi 扫描；
干燥气温度：350℃；
毛细管电压：3.5kv；
锥孔电压：120v；
干燥气温度：350℃；
干燥气流量：10l·min-1；
扫描方式：一级质谱全扫描、二级质谱扫描；
扫描范围：100-1000。
5.如权利要求1所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，所述第一对照品溶液的制备方法具体为：取比沙可啶对照品，用丙酮溶解并稀释，制成每1ml含1mg的第一对照品溶液。
6.如权利要求1所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，所述第二对照品溶液的制备方法具体为：取比沙可啶对照品，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含1mg的第二对照品溶液。
7.如权利要求1所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，所述第一供试品溶液的制备方法具体为：取第一若供试品为固体制剂，研细，精密称取一次取用量，用丙酮溶解并稀释；若供试品为液体制剂，摇匀，精密量取一次取用量用丙酮溶解并稀释；滤过，取滤液作为供试品溶液。
8.如权利要求1所述的快速筛查中成药及保健食品中非法添加比沙可啶的方法，其特征在于，所述第二供试品溶液的制备方法具体为：
若供试品为固体制剂，研细，精密称取一次取用量，置量瓶中，加甲醇，超声处理后，放至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过；若供试品为液体制剂，摇匀，精密量取一次取用量，置量瓶中，加甲醇，振摇，加甲醇稀释至刻度，摇匀，摇匀后用微孔滤膜滤过；滤液作为第二供试品溶液。
技术总结