本发明属于电化学传感领域，特别涉及一种检测琥珀酸的磁性分子印迹聚合物及其制备方法和电化学表征。
背景技术：
琥珀酸是三羧酸循环中的重要中间产物，如果在糖酵解过程中能够实时检测发酵液中琥珀酸浓度的变化，则有望达到控制发酵进度的目的。目前，常用的琥珀酸检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法以及气相色谱法等，然而上述方法都难以达到对发酵过程中的琥珀酸浓度进行实时检测的目的，因此探索一种能够实时监测琥珀酸浓度的新方法具有十分重要的现实意义。
传统分子印迹技术虽然具有很强的特异性，操作简单，但是后期从分散介质中分离时，繁琐的离心分离步骤消耗了太多的时间。这一缺点一定程度上限制了其在固相萃取、快速检测等领域的应用。针对这一缺点，应运而生了磁性分子印迹技术(magneticmolecularimprintingtechnique，mmit)。mmit是将磁性纳米材料与分子印迹技术相结合的一种技术。通过mmit制备的磁性分子印迹聚合物(magneticmolecularlyimprintedpolymers，mmips)既能够特异性识别模板分子，又能利用外加磁场从复杂基质中快速分离出来，省去了传统mips利用离心过滤进行分离的繁琐步骤，大大节省了后期处理的时间。
电化学传感器不仅具有高的灵敏度和稳定性，而且高度集成易于小型化、操作简单，受到了广大科研工作者的青睐。将磁性分子印迹技术与电化学传感技术相结合，制备分子印迹电化学传感器可以有效提高电化学传感器的选择性，实现对模板分子快速、准确的微量检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能够有效识别琥珀酸分子的磁性分子印迹聚合物和其分子印迹电化学传感器。
本发明的目的主要通过以下技术方案实现：
1、磁性分子印迹聚合物膜修饰工作电极
1)采用三电极体系，玻碳电极(gce)为工作电极，铂丝(pt)为对电极，饱和甘汞电极(sce)为参比电极。彻底清洗电极，并检测其性能合格后，在其表面分别滴加适量的洗脱后磁性分子印迹聚合物分散液和洗脱前磁性分子印迹聚合物分散液，随后置于室温环境中自然干燥，记为after-mip/gce和before-mip/gce。
2)将after-mip/gce和before-mip/gce分别置于琥珀酸标准溶液中，吸附一段时间后迅速取出，用超纯水冲洗电极表面，之后置于室温环境中自然干燥，记为a/after-mip/gce和a/before-mip/gce。
2、电化学特异性识别及检测琥珀酸分子
将吸附后的电极浸入检测液中，采用差分脉冲伏安法(dpv)检测，记录dpv峰电流值。本发明中采用表面印迹法合成琥珀酸磁性分子印迹聚合物的具体步骤如下：
1)取一定量琥珀酸、n’-异丙基丙烯酰胺(nipam)、丙烯酰胺(aam)以及一定量甲基丙烯酸(maa)溶于一定量柠檬酸缓冲液中，然后再加入一定量n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，充分溶解后得到溶液a。将溶液a在室温下预聚合一定时间。
2)取一定量fe3o4@cooh磁性纳米粒子溶于一定量柠檬酸缓冲液中，超声分散一定时间，得到溶液b。
3)随后将溶液a和溶液b混合均匀，依次加入一定量的过硫酸铵溶液(aps)和四甲基乙二胺(temed)，在室温下机械搅拌反应一定时间。
4)通过外加磁场从溶液中收集聚合产物，并用一定比例的甲醇和乙酸混合溶液对聚合物进行洗脱，从而除去聚合物中的模板分子，制得琥珀酸磁性分子印迹聚合物(mmip)。非印迹聚合物(nip)的合成过程中除不加琥珀酸外，其他均相同。
本发明中采用溶剂热法合成fe3o4@cooh磁性纳米粒子的具体步骤如下：
1)称取一定量fecl3·6h2o，柠檬酸三钠溶于一定量乙二醇中，超声一段时间后，使二者完全溶解。
2)在机械搅拌下缓慢加入一定量无水乙酸钠，完全溶解后得到橙红色溶液。
3)将上述溶液转移到反应釜中，在高温下反应一定时间。反应完成后，在室温下冷却，利用磁分离收集合成的反应产物fe3o4@cooh磁性纳米粒子，使用去离子水和乙醇反复清洗。
本发明有益效果：
1、本发明提供的磁性分子印迹电化学传感器，可用于特异性识别琥珀酸分子，拓展了电化学传感器的构建方法。
2、本发明提供的磁性分子印迹电化学传感器可用于定量检测琥珀酸分子，具有广泛的实际应用价值。
3、本发明提供的磁性分子印迹电化学传感器，构建方法简捷，成本低，易于工业化生产；检测步骤单一，对操作人员专业性要求低，易于推广普及，应用前景广阔。
附图说明
图1为磁性分子印迹聚合物的透射电镜图(tem)
图2为不同修饰电极在检测溶液中的循环伏安(cv)图
图3为不同修饰电极在检测溶液中的交流阻抗(eis)图
图4为磁性分子印迹电化学传感器dpv响应值与琥珀酸浓度的线性关系图
具体实施方式
下面具体实施方式，是对本发明技术方案作进一步具体的说明，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。
实施例1：琥珀酸磁性分子印迹聚合物的合成
1)取一定量的琥珀酸、n’-异丙基丙烯酰胺(nipam)和丙烯酰胺(aam)，以及一定量的甲基丙烯酸(maa)溶于一定量的柠檬酸缓冲液(ph＝6.4)中，然后再加入一定量n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，充分溶解后得到溶液a。其中n’-异丙基丙烯酰胺(nipam)：丙烯酰胺(aam)：甲基丙烯酸(maa)：n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)的摩尔比范围为:5:1:1.5:1～8:5:3:1。将溶液a在室温下预聚合1h。
2)取一定量的fe3o4@cooh磁性纳米粒子溶于一定量柠檬酸缓冲液(ph＝6.4)中，其中fe3o4@cooh磁性纳米粒子：n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)的质量比范围为2:1～5:1。超声分散10min，得到溶液b。
3)随后将溶液a和溶液b混合均匀，依次加入一定量的质量分数为10％的过硫酸铵(aps)溶液和四甲基乙二胺(temed)，其中n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)：过硫酸铵：四甲基乙二胺的摩尔比范围为3:2:1～5:4:1。在室温下机械搅拌反应24h。
4)通过外加磁场从溶液中收集聚合产物，并用甲醇和乙酸(9:1，v:v)混合溶液对聚合物进行洗脱，从而除去聚合物中的模板分子，制得琥珀酸磁性分子印迹聚合物(mip)。非印迹聚合物(nip)的合成过程中除不加琥珀酸外，其他均相同。
本发明中fe3o4@cooh磁性纳米粒子的具体步骤如下：
1)称取一定质量的fecl3·6h2o、柠檬酸三钠以及无水乙酸钠，其质量比范围为2:1:2～6:1:7。
2)将fecl3·6h2o和柠檬酸三钠溶于一定量的乙二醇中，超声溶解。
3)在机械搅拌下缓慢加入无水乙酸钠，完全溶解后得到橙红色溶液。
4)将上述溶液转移到反应釜中，在200℃下反应12h。反应完成后，在室温下冷却，利用磁分离收集合成的反应产物fe3o4@cooh磁性纳米粒子，使用去离子水和乙醇反复清洗，最后真空冷冻干燥后置于4℃冰箱中保存。
实施例2：琥珀酸磁性分子印迹传感器的制备
1)取73ml0.1mol/l的柠檬酸溶液和127ml0.1mol/l的柠檬酸钠溶液混合，配制成ph＝5.2的柠檬酸缓冲液。
2)取一定量的磁性分子印迹聚合物分散到一定体积的柠檬酸缓冲液(ph＝5.2)中，得到浓度为2～5mg/ml的磁性分子印迹聚合物分散液。
3)采用滴涂法在玻碳电极表面滴涂3～8μl磁性分子印迹聚合物分散液，得到修饰后的工作电极。将制备出的电极命名为mip/gce。
实施例3：基于实例2制备出的分子印迹电化学传感器进行检测
1)将修饰电极浸入到5.0mmol/l[fe(cn)6]3-/4-和0.5mol/lkcl的混合溶液溶液中，随后对各个修饰电极进行电化学伏安法扫描和交流阻抗法测量，扫描后便可得到相应的循环伏安(cv)图和交流阻抗(eis)图。
2)将制备的电化学传感器浸入含有不同浓度的琥珀酸标准溶液，利用差分脉冲伏安法(dpv)进行测量，以溶度与dpv响应值作图。
3)选用α-酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸和葡萄糖作为琥珀酸的干扰物来测定磁性分子印迹传感器的选择性。
如附图4所示，峰电流值与琥珀酸浓度在0.1-10mmol/l范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为i＝14.502logc(mmol/l) 36.243(r2＝0.993)。
以上所述的实施例为本发明的目的、技术方案和有益效果的说明，本发明的实施方式不受上述实施例的限制，任何在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换、改进等，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种检测琥珀酸的磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取一定量的琥珀酸、n’-异丙基丙烯酰胺(nipam)和丙烯酰胺(aam)，以及一定量的甲基丙烯酸(maa)溶于一定量的柠檬酸缓冲液(ph＝6.4)中，然后再加入一定量n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，充分溶解后得到溶液a。将溶液a在室温下预聚合1h。
2)取一定量的fe3o4@cooh磁性纳米粒子溶于一定量柠檬酸缓冲液(ph＝6.4)中，超声分散10min，得到溶液b。
3)随后将溶液a和溶液b混合均匀，依次加入一定量的质量分数为10％的过硫酸铵(aps)溶液和四甲基乙二胺(temed)，在室温下机械搅拌反应24h。
4)通过外加磁场从溶液中收集聚合产物，并用甲醇和乙酸(9:1，v:v)混合溶液对聚合物进行洗脱，从而除去聚合物中的模板分子，制得琥珀酸磁性分子印迹聚合物(mip)。非印迹聚合物(nip)的合成过程中除不加琥珀酸外，其他均相同。
2.根据权利要求1所述的fe3o4@cooh磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)称取一定质量的fecl3·6h2o、柠檬酸三钠以及无水乙酸钠，其质量比范围为2:1:2～6:1:7。
2)将fecl3·6h2o和柠檬酸三钠溶于一定量的乙二醇中，超声溶解。
3)在机械搅拌下缓慢加入无水乙酸钠，完全溶解后得到橙红色溶液。
4)将上述溶液转移到反应釜中，在200℃下反应12h。反应完成后，在室温下冷却，利用磁分离收集合成的反应产物fe3o4@cooh磁性纳米粒子，使用去离子水和乙醇反复清洗，最后真空冷冻干燥后置于4℃冰箱中保存。
3.根据权利要求1所述的一种检测琥珀酸的磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中n’-异丙基丙烯酰胺(nipam)：丙烯酰胺(aam)：甲基丙烯酸(maa)：n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)的摩尔比范围为:5:1:1.5:1～8:5:3:1。
4.根据权利要求1所述的一种检测琥珀酸的磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中fe3o4@cooh磁性纳米粒子：n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)的质量比范围为2:1～5:1。
5.根据权利要求1所述的一种检测琥珀酸的磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mba)：过硫酸铵：四甲基乙二胺的摩尔比范围为3:2:1～5:4:1。
6.根据权利要求1所述的一种检测琥珀酸的磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中洗脱时保证mip/nip的洗脱浓度范围为0.5～1mg/ml，每5～8h更换一次洗脱液，洗脱2～3次；将洗脱后的mip/nip置于冰箱冷冻20分钟后，转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥5～7小时，随后保存在4摄氏度的冰箱中备用。
7.根据权利要求1所述的磁性分子印迹聚合物所制备的分子印迹电化学传感器，其特征在于，通过在电极表面修饰磁性分子印迹聚合物膜，能够特异性检测琥珀酸分子。
8.根据权利要求7所述的分子印迹电化学传感器，其特征在于，在工作电极表面滴加磁性分子印迹聚合物分散液后，置于室温环境中使其自然干燥，记为mip/gce。其中磁性分子印迹聚合物分散液通过将一定量的磁性分子印迹聚合物分散到一定体积的柠檬酸缓冲液中得到，分散液浓度为2～5mg/l。
9.根据权利要求7所述的分子印迹电化学传感器，其特征在于，检测缓冲液为5.0mmol/l[fe(cn)6]3-/4-和0.5mol/lkcl的混合溶液，检测方法为差分脉冲伏安法(dpv)，该传感器可定量检测溶液中琥珀酸分子的浓度，其检测范围为0.1-10mmol/l，检测限为5.4x10-3mmol/l。
10.根据权利要求7所述的分子印迹电化学传感器，其特征在于，磁性分子印迹聚合物分散液浓度为4mg/l，滴加量为8μl时，吸附时间为10min时，吸附前后的电化学信号差异值最大。
技术总结