一种microRNA检测用质控品的制备方法与流程

一种microrna检测用质控品的制备方法
技术领域
1.本发明涉及核酸检测技术领域，特别涉及一种microrna检测用质控品的制备方法。


背景技术：

2.microrna是一类长约19
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25个核苷酸的单链非编码rna分子，这些microrna通常靶向一个或多个mrna，通过抑制靶基因的翻译过程对基因表达进行调节。现有研究表明，常见的癌症存在相关的microrna表达改变，而且microrna通常定位于与癌症相关的基因组区域，因此可推测microrna可能发挥着抑癌基因和癌基因的双重作用（esquela
‑
kerscher, a. and slack, f. j(2006) nat rev cancer 6, 259
‑
269; calin, g. a. and croce, c. m.(2007) j clin invest 117, 2059
‑
2066; blenkiron, c. and miska, e. a. (2007) hum mol genet 16, r106
‑
r113）。成熟的microrna会与其他蛋白质一起组成mirna
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蛋白质复合体，因此它们在体外非常稳定（lu, j. et al. , (2005) nature 435, 834
‑
838; lim, l. p. et al. , (2005) nature 433, 769
‑
773），在作为肿瘤生物标志物方面比mrna具有更大的优势，已证实的microrna在癌症中的异常表达更突出了它们作为诊断和预后生物标志物的潜在应用价值。因此，对microrna准确、高效、精准的检测是当前研究以及后续产品开发的重要举措。
3.实时荧光定量rt
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pcr凭借其高灵敏度、高特异性、重复性好等优势，已成为检测microrna的一种重要方法。然而，rt
‑
pcr整体检测流程较为复杂，分为核酸提取与纯化、逆转录、逆转录产物扩增等步骤，所以容易受到样本提取、检测人为因素在内的多种因素的影响。因此，极有必要在其检测过程中构建严格的质量控制体系，建立质控体系的条件是引入符合条件的质控品对整体检测流程进行评估，这对microrna检测结果的准确性具有重要的意义。
4.目前，用于检测microrna使用的质控品普遍使用人工合成基因，将人工合成基因稀释配制成质控品后，直接用于后续的逆转录以及扩增实验。
5.使用人工合成基因存在以下问题：一、因为microrna序列较短，通常由19
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25个核苷酸组成，而且合成的基因不是mirna
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蛋白质复合体，没有蛋白质的保护，容易降解，没有良好的稳定性。
6.二、不参与提取的过程，不能保证提取环节的质量控制。即使使用人工合成基因参与到提取环节，也会因为样本基质和microrna存在结构的不同，而不能准确模拟样本检测流程。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种microrna检测用质控品的制备方法，质控品可对microrna检测进行全方位质控，而且整体制备流程简单，成本较低，易于储存和转运，具有良好的应用前景。
8.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种microrna检测用质控品的制备方法，包括以下步骤：（1）细胞富集：将完成计数的细胞进行离心，弃掉上清，得到沉淀的细胞；（2）样本模拟基质稀释：使用样本模拟基质稀释步骤（1）所得沉淀的细胞；（3）microrna释放：通过物理手段处理步骤（2）稀释后的细胞使细胞破碎，释放细胞内的microrna；（4）杂质去除：对步骤（3）破碎后的细胞进行冻融或者室温存放将不稳定的microrna降解，离心去除杂质，取上清，即为质控品。
9.步骤（1）中，所述细胞为含检测靶标microrna的细胞。作为优选，含检测靶标microrna的细胞选自人肾上皮细胞系（293t细胞）、cho
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k1细胞、nih
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3t3细胞中的一种或几种。
10.步骤（2）中，所述样本模拟基质为不含检测靶标microrna的人工合成或天然基质。作为优选，所述样本模拟基质选自人工血清、人工尿液、人工唾液、胎牛血清中的一种或几种。
11.作为优选，步骤（3）中，所述物理手段选自冻融、机械破碎、超声破碎中的一种或几种。
12.作为优选，步骤（3）中，物理手段为冻融时，冻融次数为1
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3次，冻融温度为
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10℃至
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85℃。
13.作为优选，步骤（4）中，冻融次数为1
‑
5次，冻融温度为
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10℃至
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85℃。
14.作为优选，步骤（4）中，室温存放时间为12h
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72h。
15.一种microrna检测用质控品，采用上述制备方法制备而成。
16.本发明的有益效果是：本发明的质控品可参与microrna检测的所有环节，能对检测全程进行严格的质量控制。质控品的基质为模拟样本基质，可以避免可能的“基质效应”存在，其中的microrna同为mirna
‑
蛋白质复合体结构，可以稳定保存，并且跟样本中microrna存在结构一致，可以准确的模拟样本提取—检测流程。
附图说明
17.图1是本发明制备的质控品与人工合成基因配制的质控品的稳定性研究对比。
18.图2是质控品靶标基因浓度（ct值表示）跟细胞数量的线性关系。
19.图3是使用本发明制备的质控品与人工合成基因配制的质控品检测实际样品的质控结果。
具体实施方式
20.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
21.本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
22.实施例1：一种microrna检测用质控品的制备方法，包括如下步骤：步骤1细胞富集：取一管293t细胞（1*106个），1500g离心15min，弃掉上清，取沉淀
的细胞；步骤2样本模拟基质稀释：使用人工血清（sigma）重新悬浮细胞，稀释细胞浓度至3*102个/ul；步骤3microrna释放：将稀释后的细胞置于
‑
80℃中冷冻10min，取出后常温融化，融化后放置5min，为1次冻融；通过2次冻融使细胞破裂，释放microrna；步骤4杂质去除：将步骤3中的半成品放置室温过夜（12h），使不稳定的microrna完成降解，后按4000g离心5min，取上清，得到质控品。
23.实施例2：一种microrna检测用质控品的制备方法，包括如下步骤：步骤1细胞富集：取一管cho
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k1细胞（5*105个），1500g离心15min，弃掉上清，取沉淀的细胞；步骤2样本模拟基质稀释：使用人工唾液（sigma）重新悬浮细胞，稀释细胞浓度至1.5*102个/ul；步骤3microrna释放：将稀释后的细胞置于
‑
80℃中冷冻10min，取出后常温融化，融化后放置5min，为1次冻融；通过3次冻融使细胞破裂，释放microrna；步骤4杂质去除：将步骤3中的半成品放置室温放置24h，使不稳定的microrna完成降解，后按4000g离心5min，取上清，得到质控品。
24.实施例3：一种microrna检测用质控品的制备方法，包括如下步骤：步骤1细胞富集：取一管nih
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3t3细胞（1*104个），1200g离心20min，弃掉上清，取沉淀的细胞；步骤2样本模拟基质稀释：使用胎牛血清重新悬浮细胞，稀释细胞浓度至50个/ul；步骤3microrna释放：将稀释后的细胞置于超声波细胞粉碎机内，参数按设备使用说明书进行设置，使细胞破碎，释放microrna；步骤4杂质去除：将破碎后的细胞置于
‑
80℃中冷冻10min，取出后常温融化，融化后放置5min，为1次冻融；通过2次冻融使不稳定的microrna完成降解，后按3000g离心10min，取上清，得到质控品。
25.一、质控品保存稳定性评估将实施例1制备的质控品置于室温（20℃
‑
25℃）中保存，分别于第0天、第3天、第7天通过rt
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pcr法检测质控品中的hsa
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mir
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29c
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3p（g1）、hsa
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mir
‑
103a
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3p（g2）、hsa
‑
mir
‑
181a
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5p（g3）、hsa
‑
mir
‑
21
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5p（g4）、hsa
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mir
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30e
‑
5p（g5）和hsa
‑
mir
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126
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3p（g6）这六个microrna的ct值，评估其加速稳定性能，其中核酸提取或纯化试剂（市售）为：杭州觅因生物科技有限公司，浙杭械备20180690号，型号my
‑
02，货号st1002。
26.将实施例1制备好的质控品设置为实验组，使用人工合成基因配制的质控品设置为对照组，配制的基质均为人工血清（sigma），实验组和对照组中的靶标基因浓度水平一致，检测结果见图1。
27.由图1可知，实验组经过7天常温保存后，靶标基因没有明显降解，ct值无明显改变；对照组经过7天常温保存后，靶标基因降解严重，ct值明显变大。结果表明实验组保存稳定性良好。
28.二、质控品定量的线性评估按照实施例1的方法使用不同浓度的细胞制备质控品，通过rt
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pcr法检测质控品中的hsa
‑
mir
‑
29c
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3p（g1）的ct值，经过线性拟合，通过细胞数量和ct值的线性关系评估质控品定量的线性情况。
29.使用293t细胞制备质控品，细胞浓度分别为5*101、5*102、5*103个/ul，使用核酸提取或纯化试剂为：杭州觅因生物科技有限公司，浙杭械备20180690号，型号my
‑
02，货号st1002。提取试剂盒提取样本使用量为200ul，合计每个提取使用细胞104、105、106个。分别通过rt
‑
pcr法检测质控品中的hsa
‑
mir
‑
29c
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3p（g1）的ct值，检测结果见图2。
30.由图2可知，ct值跟细胞数量成线性关系。结果表明质控品中靶标的含量可以在配制质控品时通过细胞浓度进行控制，可以将靶标浓度控制至和待检样本中靶标浓度相近，做到更准确监控检测流程。
31.三、质控品跟人工合成基因质控效果比较将实施例1制备的质控品设置为实验组，使用人工合成基因配制的质控品设置为对照组，将实验组和对照组与真实血清样本同时进行检测，通过rt
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pcr法检测其中的hsa
‑
mir
‑
29c
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3p（g1）、hsa
‑
mir
‑
103a
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3p（g2）、hsa
‑
mir
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181a
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5p（g3）、hsa
‑
mir
‑
21
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5p（g4）、hsa
‑
mir
‑
30e
‑
5p（g5）和hsa
‑
mir
‑
126
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3p（g6）这六个microrna的ct值，评估其质控效果，其中核酸提取或纯化试剂（市售）为：杭州觅因生物科技有限公司，浙杭械备20180690号，型号my
‑
02，货号st1002。
32.在rt
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pcr检测过程中，分别采用不同批次的检测试剂以及人员进行检测，以此制造样本检测偏差，将样本的检测偏差跟实验组、对照组的检测偏差进行比较，检测结果见图3。由图3可知，实验组跟真实样本的偏差基本一致。结果表明本发明的质控品可以很好的监控样本检测流程。
33.本发明具有如下优点：本发明质控品的制备方式整体流程简单，成本较低，易于储存和转运。
34.本发明制备的质控品内的靶标来源于细胞，有mirna
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蛋白质复合体结构，保存稳定，而且结构与待检样本是一致的，能更好监控待检样本的检测流程。
35.使用样本模拟基质，与待检样本的基质基本一致，能避免可能的“基质效应”存在。
36.质控品中靶标浓度可以控制，可以控制至待检样本浓度相近，做到更好模拟样本的效果。
37.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。