一种用于污水处理的复合菌组合物、复合菌制剂及相关应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于污水处理的复合菌组合物、复合菌制剂及其相关应用。


背景技术：

2.随着经济的快速发展和城市规模的日益扩大，伴随着污染物排放量不断增大，污水管网和垃圾处理等环境基础设施日渐不足，致使大量污水和污染物直接排入河道，引起普遍的水体富营养化，导致水体中化学需氧量(cod)、氮(n)、磷(p)等污染物增加，污染严峻。生态系统结构的严重失衡，使水体出现季节性或常年性黑臭，成为目前较为突出的水环境问题，也严重影响着我国城市的良好发展。
3.目前，水污染的处理方法主要包括物理法、化学法和生物法。其中，物理法主要是利用物理作用处理、分离和回收废水中的污染物；化学法主要是利用化学反应或物理化学作用回收可溶性废物或胶体物质，例如，中和法用于中和酸性或碱性废水、萃取法利用可溶性废物在两相中溶解度不同的“分配”，回收酚类、重金属等；氧化还原法用来除去废水中的还原性或氧化性污染物，杀灭天然水体中的病原菌等；生物法主要是利用微生物的生化作用处理废水中的有机物。微生物处理法由于具有工序简易、作用显著、价格低廉、天然节能环保、二次污染少等优点，而受到了广泛的研究，其中，复合微生物菌剂通过几种不同类型的微生物共同作用降解污染物，在水产养殖业有众多研究和应用，主要用于改善养殖水质。例如，cn108862590a中公开了一种复合菌制剂，该复合菌制剂中包括赤红球菌，可以以腈类化合物作为唯一能源进行生长繁殖，可以降解丙烯腈废水中的腈类化合物等污染物，提高丙烯腈废水的可生化性。
4.虽然目前关于复合微生物菌剂的研究较多，但是复合微生物菌剂中由于微生物的生长能力不同，容易产生拮抗作用，优势菌种容易抑制弱势菌种的生长，从而影响整个制剂对于污水的净化效果。
5.因此，开发一种各微生物之间能够充分发挥协同作用，从而能够更加高效净化污水的复合微生物菌剂是目前需要解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供一种用于污水处理的复合菌组合物。本发明提供的复合菌组合物通过特定的菌种按照特定的比例进行配伍，能够最大程度上避免菌种之间的相互抑制作用；同时，通过将特定的菌种按照特定的比例配伍，能够最大程度上发挥菌种之间的协同作用，对污水的净化能力强、净化效果好。
7.本发明的另一个目的在于提供所述复合菌组合物的制备方法。
8.本发明的另一个目的在于提供一种用于污水处理的复合菌制剂，所述复合菌制剂包括本发明提供的复合菌组合物。
9.本发明还提供了一种污水处理的方法，所述方法包括利用本发明提供的复合菌组
合物或复合菌制剂对污水进行处理。
10.为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种用于污水处理的复合菌组合物，其包括：
11.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)10
‑
20重量份、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)10
‑
20重量份、亚硝化单胞菌(nitrosomonas)8
‑
15重量份、约翰氏不动杆菌(acinetobacter johnsonii)8
‑
15重量份和丁酸梭菌(clostridium butyricum)1
‑
5重量份。
12.根据本发明的具体实施方案，本发明所述复合菌组合物，其中的枯草芽孢杆菌的含量例如可以选自10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20重量份或它们之间任意范围内的任意值。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明所述复合菌组合物，其中的解淀粉芽孢杆菌的含量例如可以选自10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20重量份或它们之间任意范围内的任意值。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明所述复合菌组合物，其中的亚硝化单胞菌的含量例如可以选自8、9、10、11、12、13、14、15重量份或它们之间任意范围内的任意值。
15.根据本发明的具体实施方案，本发明所述复合菌组合物，其中的约翰氏不动杆菌的含量例如可以选自8、9、10、11、12、13、14、15重量份或它们之间任意范围内的任意值。
16.根据本发明的具体实施方案，本发明所述复合菌组合物，其中的丁酸梭菌的含量例如可以选自1、2、3、4、5份或它们之间任意范围内的任意值。
17.本发明中，优选地，所述复合菌组合物包括：
18.枯草芽孢杆菌15
‑
20重量份、解淀粉芽孢杆菌15
‑
20重量份、亚硝化单胞菌10
‑
15重量份、约翰氏不动杆菌10
‑
15重量份和丁酸梭菌2
‑
5重量份。
19.根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明所述复合菌组合物中，所述约翰氏不动杆菌的重量份数为亚硝化单胞菌的1
‑
1.5倍；
20.更优选地，所述约翰氏不动杆菌的重量份数为亚硝化单胞菌的1.2
‑
1.5倍；
21.进一步优选地，所述约翰氏不动杆菌的重量份数为亚硝化单胞菌的1.3倍。本发明中，当约翰氏不动杆菌的重量份数为亚硝化单胞菌的1
‑
1.5倍，优选为1.2
‑
1.5倍，更优选为1.3倍时，复合菌组合物对于污水中nh3‑
n的降解率最佳。
22.根据本发明的具体实施方案，优选地，所述复合菌组合物包括：
23.枯草芽孢杆菌15重量份、解淀粉芽孢杆菌15重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌13重量份和丁酸梭菌5重量份。本发明发现，当复合菌组合物中的各微生物配比满足上述条件时，所取得的净化污水的效果最好，猜测可能原因在于在上述比例下，各微生物之间的拮抗作用最小。
24.本发明中，各种菌之间相互协同，起到共同净化水质的作用。其中：
25.枯草芽孢杆菌适应性强且能够分泌多种消化酶，尤其是分泌淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等，因此能够分解多种有机物。在本发明中，枯草芽孢杆菌分泌的枯草菌素、多粘菌素、制酶菌素、淀粉酶、蛋白酶等活性物质能够抑制有害病原菌(如弧菌、大肠杆菌)等在水体中的生长繁殖，从而可以分解污水中存在的多种有机污染物，从而实现降低有机污染物的目的。
26.解淀粉芽孢杆菌是一种重要的溶磷菌，其能够分泌溶磷酶，让固态的磷变成离子态的磷。在本发明中，解淀粉芽孢杆菌可以通过分泌几丁质酶以及其他具有絮凝功能的多糖和蛋白，这些多糖或蛋白上的羟基和羧基等活性官能团通过化学反应、氢键和静电等作用使悬浮在污水中的颗粒物、重金属离子或者病毒颗粒连接成团，加速悬浮物的凝聚沉降，从而净化水质。
27.约翰氏不动杆菌是一株耐低温的反硝化细菌，对于脂肪酸，乙酰丙酮，三丁酸甘油酯，柴油等污染物有较好的降解效果。在本发明中，约翰氏不动杆菌净化污水的原因可能在于利用氧气(o2)、硝酸根(no3‑
)和亚硝酸根(no2‑
)为电子受体表现出显著的聚氮和释氮特性，从而在富氮磷污水的处理中发挥重要作用。
28.亚硝化单胞菌在本发明中净化污水的原因可能在于将氨氮氧化为硝酸盐至硝酸盐。
29.丁酸梭菌，又名宫入菌、酪酸梭菌，细菌学分类属于梭菌属(clostridium)，是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，培养后期细菌的革兰氏染色呈阴性。在本发明中，丁酸梭菌净化污水的原因可能在于其能分解胺类、吲哚类、硫化氢等有害物质，从而改善水质。
30.本发明还提供了一种用于污水处理的复合菌制剂，其包括本发明提供的复合菌组合物，该复合菌制剂为液体制剂或固体制剂。本发明中的复合菌制剂是将本发明中的复合菌组合物接种至相应的液体培养基或固体培养基中得到的。所述液体培养基或者固体培养基采用现有技术中的培养基即可，例如，液体培养基采用lb培养基，固体培养基可以在lb培养基的基础上添加琼脂制成。
31.本发明还提供了所述复合菌组合物的制备方法，其包括：
32.分别将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、约翰氏不动杆菌和丁酸梭菌的斜面菌种接入各自合适的液体培养基中，进行液体发酵培养，直至各个菌在液体发酵液中的活菌浓度不少于1
×
109cfu/ml，脱水干燥，得到休眠状态的微生物干粉；
33.按照配方比例将所制备的休眠状态的微生物干粉进行混合，得到本发明所述的复合菌组合物。
34.本发明中，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、约翰氏不动杆菌和丁酸梭菌均可利用本领域已知的技术进行液体发酵培养。本发明中，干燥技术采用现有技术中常用的干燥技术即可，例如可以采用冷冻干燥的技术对液体培养基进行干燥。
35.本发明还提供了所述复合菌组合物或所述复合菌制剂在污水处理中的应用。
36.根据本发明的具体实施方案，优选地，所述污水为富营养化污水，所述富营养化污水指的是水体中含氮量大于0.2
‑
0.3mg/l、含磷量大于0.01mg/l、生化需氧量大于10mg/l的污水。
37.此外，本发明还提供了一种污水处理的方法，所述方法包括：
38.将本发明所述的复合菌组合物或本发明提供的复合菌制剂接种至污水中，对污水进行处理。
39.根据本发明的具体实施方案，优选地，所述污水处理的方法包括：
40.将复合菌组合物中的各微生物进行活化，得到种子液；
41.按照体积比1％
‑
5％将所述种子液接种至污水中，或按照体积比1％
‑
5％的比例将本发明所述的复合微生物制剂接种至污水中，于30℃
‑
37℃下发酵2
‑
10天。
42.综上所述，本发明提供了一种用于污水处理的复合菌组合物、复合菌制剂及采用所述复合菌组合物或复合菌制剂净化污水的方法。本发明提供的复合菌组合物中，各菌种相互协同发挥作用。具体地，枯草芽孢杆菌分泌的枯草菌素、多粘菌素、制酶菌素、淀粉酶、蛋白酶等活性物质能够抑制有害病原菌(如弧菌、大肠杆菌)等在水体中的生长繁殖，从而可以分解污水中存在的多种有机污染物，从而实现降低有机污染物的目的；解淀粉芽孢杆菌可以通过分泌几丁质酶以及其他具有絮凝功能的多糖和蛋白，这些多糖或蛋白上的羟基和羧基等活性官能团通过化学反应、氢键和静电等作用使悬浮在污水中的颗粒物、重金属离子或者病毒颗粒连接成团，加速悬浮物的凝聚沉降，从而净化水质；约翰氏不动杆菌、亚硝化单胞菌对水体中的氮磷的去除共同发挥着重要的作用，其中，亚硝化单胞菌能够将水体中的氨氮氧化为硝酸盐至硝酸盐，而约翰氏不动杆菌则能够将硝酸盐还原为氮气。丁酸梭菌一方面可以分解水体中的胺类、吲哚类和硫化氢等有害物质；同时，其也能分泌淀粉酶、糖苷酶以及果胶酶、葡聚糖酶等，这些酶能利用水体中的有机物，产生有益于整个菌群的有益因子，从而能够有助于整个菌群的生长，更好地发挥净水效果。
43.此外，本发明中还提供了所述复合菌组合物的制备方法，该制备方法操作简单、易于实现产业化。本发明提供的复合菌组合物及污水处理方法，对于污水中tn的去除率达到70％以上、tp的去除率达到84％以上、nh3‑
n的去除率达到69％以上、cod的去除率达到79％以上；特别地，当复合微生物菌剂配比为：枯草芽孢杆菌15重量份、解淀粉芽孢杆菌15重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌13重量份和丁酸梭菌5重量份时，对污水中的tn的去除率达到90％以上、tp的去除率达到94％以上、nh3‑
n的去除率达到96％以上、cod的去除率达到93％以上，具有优异的污水净化效果，从而具备较大的实用价值。
具体实施方式
44.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
45.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。以下实施例中的各个菌种菌购自北京北纳创联生物。
46.1.复合菌组合物的制备
47.1.1配制培养基
48.1.1.1种子培养基：蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％、氯化钠1％、自然ph；
49.1.1.2基础发酵培养基：每1000ml液体培养基中含有0.5g nacl、1.5g nh4cl、1.5g k2hpo4、0.5g kh2po4、0.2g mgso4、1g蛋白胨、0.5g酵母膏，加入超纯水至1000ml；
50.1.2菌种活化
51.将购买来的菌种转接到斜面培养基培养，以备用。
52.1.3种子液的制备
53.取一环活化的菌种接入装量为50ml种子培养基的锥形瓶中，37℃180r/min培养18h；
54.1.4摇瓶培养
55.分别取1ml种子液，接入盛有100ml的基础发酵培养基的250ml锥形瓶中，35℃震荡
培养12h，转速为160r/min。
56.1.5复合菌剂组合物的制备
57.待摇瓶培养中的菌种生长到活菌浓度不少于1
×
109cfu/ml，冷冻干燥，得到休眠状态的菌干粉。
58.实施例1
59.按照上述复合菌组合物的制备方法，将各个菌进行发酵培养：将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、约翰氏不动杆菌和丁酸梭菌的斜面菌种接入各自合适的液体培养基中，进行液体发酵培养，直至各个菌在液体发酵液中的活菌浓度不少于1
×
109cfu/ml，脱水干燥，得到休眠状态的微生物干粉；
60.将得到的微生物干粉按照下列的比例混合，得到本发明的复合微生物菌剂：
61.枯草芽孢杆菌10重量份、解淀粉芽孢杆菌20重量份、亚硝化单胞菌8重量份、约翰氏不动杆菌8重量份和丁酸梭菌1重量份。
62.实施例2
63.按照实施例1相同的方式制备休眠状态的各个菌干粉，按照下列比例混合各个组分得到复合微生物菌剂。
64.枯草芽孢杆菌15重量份、解淀粉芽孢杆菌15重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌8重量份和丁酸梭菌5重量份。
65.实施例3
66.按照实施例1相同的方式制备休眠状态的各个菌干粉，按照下列比例混合各个组分得到复合微生物菌剂。
67.枯草芽孢杆菌20重量份、解淀粉芽孢杆菌20重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌8重量份和丁酸梭菌1重量份。
68.实施例4
69.按照实施例1相同的方式制备休眠状态的各个菌干粉，按照下列比例混合各个组分得到复合微生物菌剂。
70.枯草芽孢杆菌15重量份、解淀粉芽孢杆菌15重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌11重量份和丁酸梭菌5重量份。
71.实施例5
72.按照实施例1相同的方式制备休眠状态的各个菌干粉，按照下列比例混合各个组分得到复合微生物菌剂。
73.枯草芽孢杆菌18重量份、解淀粉芽孢杆菌15重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌12重量份和丁酸梭菌3重量份。
74.实施例6
75.按照实施例1相同的方式制备休眠状态的各个菌干粉，按照下列比例混合各个组分得到复合微生物菌剂。
76.枯草芽孢杆菌15重量份、解淀粉芽孢杆菌15重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌13重量份和丁酸梭菌5重量份。
77.对比例1
78.除了不含有丁酸梭菌外，其余的制备方式和组分配比与实施例1相同。
79.对比例2
80.除了不含有约翰氏不动杆菌外，其余的制备方式和组分配比与实施例1相同。
81.对比例3
82.除了不含有亚硝化单胞菌之外，其余的制备方式和组分配比与实施例1相同。
83.对比例4
84.制备方式与实施例1相同，本对比例中各组分的配比如下：
85.枯草芽孢杆菌25重量份、解淀粉芽孢杆菌25重量份、亚硝化单胞菌6重量份、约翰氏不动杆菌5重量份和丁酸梭菌1重量份。
86.测试例：污水的处理
87.1.将取自苏州科技大学校园内的排污管道的污水进行粗过滤处理，除去一些大体积污染物质和水中杂质，其中过滤用的滤纸采用快速滤纸即可，旨在除去水中明显不溶于水的杂质。接入微生物前污水中：cod＝170mg/l，tn＝52mg/l，tp＝5.2mg/l，nh3‑
n＝34mg/l。
88.2.将实施例1
‑
6、对比例1
‑
4中的制得的微生物菌剂进行活化，得到种子液，活化采用的培养基为lb液体培养基：蛋白胨10.0g/l，酵母膏5.0g/l，nacl溶液10.0g/l，ph值为7.0。
89.3.将活化后的种子液按照5％的菌液接入盛有200ml上述过滤后污水的锥形瓶中，用无菌透气封口膜封口后，置于32℃恒温震荡培养箱中，每组设置3个平行实验，计算平均值。5天后进行各项指标的检测，分别对处理后的污水的cod(化学需氧量)、tn、tp、nh3‑
n(氨氮)采用行业或国家标准进行了测量。其中，cod的测定采用重铬酸钾法(gbt 11914
‑
89)、总n的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(gb11894
‑
89)、总p的测定采用钼酸铵分光光度法(gb 11893
‑
89)、氨氮的测定采用气相分子吸收光谱法(hj/t 195
‑
2005)。
90.实验结果如下表1所示：
91.表1实验结果
[0092][0093][0094]
从上表中的实验结果可以看出，缺少亚硝化单胞菌、约翰氏不动杆菌和丁酸梭菌的菌剂在tn、tp、nh3‑
n和cod去除率都显著低于含有它们的复剂，这充分说明亚硝化单胞菌、约翰氏不动杆菌、丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌搭配产生了协同作用，有
利于污水中过量n、p成分以及其他污染物质的去除。其中，丁酸梭菌可能在复配菌剂中一方面能够分泌淀粉酶、糖苷酶以及果胶酶、葡聚糖酶等酶，这些酶一方面能够分解污水中的有机物质，产生有利于复合菌生产的物质；另一方面，分解将有机大分子分解被微生物利用也能够起到净化污水的效果。
[0095]
从表中也可以看出，约翰氏不动杆菌和亚硝化单胞菌的搭配在复合菌剂中起着至关重要的作用，其原因在于可能在于硝化单胞菌作为一种硝化细菌，能够将水体中的氨氮氧化为硝酸盐至硝酸盐，而约翰氏不动杆菌作为一种反硝化细菌，能够将亚硝酸亚、硝酸盐还原为氮气。可见二者分别作用于氨氮化合物降解的不同环节，将两者搭配使用，当亚硝化单胞菌和约翰氏不动杆菌的比例为1:1
‑
1.5时，特别是在两者的用量为1:3时(实施例4和实施例6相比较)，对于nh3‑
n去除率最高，这也从侧面佐证了上述两者可能的作用机理。
[0096]
此外，从上述表中的结果也可以看出，实施例6的效果最好，也就是当复合菌剂的比例为：枯草芽孢杆菌15重量份、解淀粉芽孢杆菌15重量份、亚硝化单胞菌10重量份、约翰氏不动杆菌13重量份和丁酸梭菌5重量份时对于污水的净化效果最好。发明人猜想可能是由于复合菌剂中的各微生物在这一比例之下相互之间不会产生抑制作用，从而各组分能够发挥各自最大的效果。
[0097]
通过对比例4可以看出，当枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌相对于亚硝化单胞菌、约翰氏不动杆菌和丁酸梭菌的添加量过大时，复合菌组合物对于污水的净化效果不好，猜测其中的可能原因在于当这两种菌的添加量过大时，其在接种于污水中后容易压制其他菌群的生长，产生较强的拮抗作用，压制其他菌种的生长。因此，反而导致对于污水的净化效果不是特别理想。
[0098]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在不偏离本发明要求保护的精神和实质的前提下，可以对本发明的各个技术特征进行替代、修改和组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。