lncRNABCYRN1在膀胱癌预后、治疗中的应用的制作方法

lncrna bcyrn1在膀胱癌预后、治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种lncrna bcyrn1在膀胱癌预后、治疗中的应用。


背景技术：

2.膀胱癌是目前世界上最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第9位， 2018年全球膀胱癌的新发病例和死亡病例分别约为55万和20万，且其发病率有逐年上升的趋势，给国民带来巨大的经济负担。膀胱癌根据肌层浸润与否可分为肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌，其中肌层浸润性膀胱癌更易发生转移，患者的预后更差。研究表明，淋巴转移是膀胱癌转移的最主要和首发的转移方式，膀胱癌患者一旦发生淋巴转移，现有的治疗方式，包括手术切除、放化疗和免疫治疗等在改善患者的预后中效果有限，患者的五年生存率由77.6%下降至18.6%。近年来，随着基础研究的深入，对膀胱癌淋巴转移的分子机制有了一定的了解，但是在膀胱癌淋巴转移患者的预后改善上却效果不明显，其中最主要的原因就是缺乏有效的药物治疗靶点和预测生物标志物。因此，探寻膀胱癌淋巴转移有效的生物标志物和药物治疗新靶点是目前膀胱癌临床和基础研究中亟待解决的难题。
3.外泌体是由各类细胞分泌的广泛存在于人体体液中的直径为30
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150nm的细胞外囊泡，其可通过充当dna、rna、蛋白质和脂质体等生物活性分子的载体，而起到介导细胞间信息交流的重要作用。因具有良好的稳定性和靶向性，外泌体在肿瘤转移中所扮演的角色受到了许多学者的关注。研究发现，一方面肿瘤细胞可分泌高丰度的外泌体至肿瘤微环境中，诱导利于肿瘤细胞转移的微环境形成；另一方面肿瘤微环境中的间质细胞也能通过外泌体递送生物信号调控肿瘤细胞的生物学特性，最终促进肿瘤转移的发生。然而在目前研究中，关于肿瘤细胞源性外泌体在膀胱癌淋巴转移中的生物学作用及分子机理尚不清楚。
4.长链非编码rna（long non
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coding rna，lncrna）是一类转录长度超过200个核苷酸的不具有蛋白质编码能力的rna。研究发现，肿瘤细胞中有大量异常表达的lncrna，其可通过介导表观遗传调控，在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。近年来研究表明，lncrna还可通过外泌体的运输，靶向调控肿瘤微环境中的间质细胞表型，进而在肿瘤转移中发挥重要的调控作用。并且获益于外泌体的稳定性和靶向性的生物学特性，外泌体携带的lncrna能在体液中稳定存在并被广泛检测到。因此，基于外泌体lncrna的肿瘤转移靶向治疗新靶点和预测新指标具有广阔的临床应用前景。筛选膀胱癌淋巴转移相关的外泌体lncrna，对于临床上寻求膀胱癌淋巴转移的早期诊断新靶标和治疗新靶点具有重要的意义，能够为改善患者预后提供新思路。


技术实现要素：

5.本发明提供一种lncrna bcyrn1在膀胱癌预后、治疗中的应用，lncrna bcyrn1对膀胱癌淋巴管新生和淋巴转移的促进作用，，可作为预测膀胱癌患者预后效果、膀胱癌淋巴转移早期诊断标记物和治疗新靶点。
6.本发明解决其技术问题采用以下技术方案：lncrna bcyrn1作为分子标志物在制备用于预测膀胱癌预后产品中应用。
7.作为一种优选方案，所述产品包括芯片、试剂盒或试剂。
8.作为一种优选方案，所述产品通过lncrna bcyrn1表达量进行判断。
9.本发明还提供了一种检测lncrna bcyrn1表达量的试剂，其特征在于，用于预测膀胱癌预后。
10.作为一种优选方案，所述试剂包括用于qrt
‑
pcr的引物对，所述引物对包括：前引物：acgcctgtaatcccagctc；后引物：tgctttgagggaagttacgc。
11.作为一种优选方案，所述lncrna bcyrn1高表达的受试者预后效果相对较差，所述lncrna bcyrn1低表达的受试者预后效果相对较好。
12.作为一种优选方案，所述lncrna bcyrn1高表达的受试者比lncrna bcyrn1低表达的受试者具有更短的总生存期。
13.作为一种优选方案，所述lncrna bcyrn1高表达的受试者比lncrna bcyrn1低表达的受试者具有更短的无病生存率。
14.本发明还提供了一种lncrna bcyrn1作为靶点在制备用于治疗膀胱癌药物中的用途。
15.本发明还提供了一种lncrna bcyrn1表达的抑制剂在制备治疗膀胱癌药物中的用途。
16.本发明的有益效果：本发明以外泌体lncrna为切入点，通过高通量测序筛选出在膀胱癌患者尿液外泌体中高表达的lncrna bcyrn1，并证实外泌体lncrna bcyrn1与膀胱癌的淋巴转移和患者的不良预后呈正相关，进一步的体内外实验证实外泌体lncrna bcyrn1对膀胱癌淋巴管新生和淋巴转移的促进作用，从而揭示了外泌体lncrna bcyrn1在膀胱癌淋巴转移中的生物学作用，为将外泌体lncrna bcyrn1作为膀胱癌淋巴转移早期诊断标志物、患者预后预测和治疗新靶点提供理论基础和科学依据。
附图说明
17.图1为外泌体扫描电镜图；图2为外泌体lncrna bcyrn1表达量与患者总生存期的关系图；图3为原位杂交实验检测lncrna bcyrn1在不同膀胱癌组织中的表达情况图；图4为原位杂交实验检测lncrna bcyrn1在不同膀胱癌组织的表达情况的柱状统计分析图；图5为显微镜下拍摄的淋巴管内皮细胞成管和transwell的代表图；图6为统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞成管宽度的差异图；图7为统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞transwell穿透细胞数的差异图；图8为活体成像检测不同组别间裸鼠腘窝淋巴结转移的情况；图9为gfp抗体检测裸鼠腘窝淋巴结中肿瘤的转移情况；图10为不同组别间发生腘窝淋巴结转移的裸鼠的数量统计表；图11为共聚焦显微镜观察荧光标记的外泌体被淋巴管内皮细胞的摄取情况图；图12为qrt
‑
pcr检测lncrna bcyrn1的表达情况图；
图13为蛋白质电泳检测证实膀胱癌细胞来源的外泌体lncrnabcyrn1促进淋巴管内皮细胞中vegfr3的表达图；图14为放线菌素d实验证实膀胱癌细胞来源的外泌体lncrna bcyrn1对淋巴管内皮细胞中vegfr3 mrna稳定性的调控图。
具体实施方式
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1lncrna bcyrn1在膀胱癌患者的尿液外泌体中高表达通过收集5例膀胱癌患者和5例正常健康志愿者的尿液标本，通过超速离心法（2000g x 20 min离心后将上清转移到新的离心管，然后10000g x 40 min离心后将上清转移到新的离心管，然后120000g x 70 min离心，最后弃去上清，并用pbs重悬管底的外泌体）提取并纯化尿液中的外泌体，通过扫描电镜、粒径分析和蛋白质电泳分析鉴定所提取的囊泡是外泌体（图1：扫描电镜）；通过高通量测序鉴定出其中差异表达的lncrna bcyrn1。其后我们扩大临床样本，收集210例膀胱癌患者和112例健康志愿者的尿液标本，通过上述超速离心法提取并纯化尿液中外泌体，然后采用trizol法提取外泌体中的总rna，并通过逆转录为cdna后，采用qrt
‑
pcr检测lncrna bcyrn1的表达，发现膀胱癌患者尿液外泌体中lncrna bcyrn1的表达量显著高于正常志愿者尿液外泌体中lncrna bcyrn1的表达量。
20.实施例2外泌体lncrna bcyrn1表达量与患者无病生存期和总生存期的关系：收集所有患者的临床信息，并结合上述qrt
‑
pcr的检测结果进行统计学分析，发现淋巴结转移的膀胱癌患者的尿液外泌体lncrna bcyrn1的表达显著高于未发生淋巴转移的患者（统计方法：the nonparametric mann
‑
whitney u test），且外泌体lncrna bcyrn1高表达的患者无病生存期和总生存期更短（图2，分析方法：kaplan
–
meier生存曲线分析，外泌体lncrna bcyrn1表达的中位数以上定义为外泌体lncrna bcyrn1高表达，以下定义为外泌体lncrna bcyrn1低表达）。
21.通过原位杂交实验验证显示外泌体lncrna bcyrn1的表达在淋巴转移阳性的膀胱癌组织中明显上升，在淋巴转移阴性的膀胱癌组织中轻微上升，在正常的膀胱组织中显著低表达，图3是显微镜下拍摄的代表图，图4是对应的柱状统计分析图，所采用的统计学方法是卡方检验，评分方法是h
‑
score=∑ (p
ꢀ×ꢀ
i)， 其中p是染色阳性的细胞数；i：是染色深度，其中 0分是无染色，1分是弱染色，2分是中等染色，3分是强染色。
22.进一步的原位杂交和免疫组化提示外泌体lncrna bcyrn1高表达的膀胱癌组织中淋巴管密度显著增高，其中淋巴管是使用lyve
‑
1抗体标记的免疫组化实验进行检测的；具体的分析方法和上述的原位杂交一致。
23.进一步通过结合生存随访数据进行统计学分析，我们发现患者尿液外泌体中lncrna bcyrn1高表达的患者其总生存期（os）和无病生存期（dfs）显著短于尿液外泌体中
lncrna bcyrn1低表达的患者。
24.实施例3外泌体lncrna bcyrn1能显著促进膀胱癌的淋巴管新生及淋巴转移：通过si
‑
rna敲低膀胱癌细胞系中外泌体lncrna bcyrn1的表达，并收集其细胞培养的上清；通过超速离心法提取其上清中的外泌体，并通过bca法对提取的外泌体浓度进行测定。将淋巴管内皮细胞种到六孔板种，每孔1
×
105个细胞；随后将提取的外泌体按每孔20ug的量加入提取的外泌体进行诱导，同时设置等量膀胱癌细胞培养上清进行诱导，具体分组为pbs、um
‑
uc
‑3si
‑
nc
、um
‑
uc
‑3si
‑
bcyrn1#1、 um
‑
uc
‑3‑
exo
si
‑
nc
、um
‑
uc
‑3‑
exo
si
‑
bcyrn1#1
五组。将细胞放置于培养箱中培养48h后，将六孔板取出，用胰酶将细胞消化后离心，弃去培养基。
25.对于成管实验，用正常的含5%血清的完全培养基重悬细胞，并计数，取2
×
105个细胞/孔，轻柔加入到提前铺好基质胶的24孔板中，轻柔晃匀，铺平细胞。放置于细胞培养箱中培养，每隔2h观察细胞的成管情况，待细胞成管后在倒置显微镜下拍照，并用image j软件测量成管长度，通过统计学分析，对比不同处理组别之间淋巴管细胞成管情况的差异，发现与对照组相比，敲低外泌体lncrna bcyrn1后，膀胱癌细胞外泌体诱导淋巴管细胞成管能力显著下降。其中24孔板铺胶的实验流程如下：提前预冷24孔板和离心管等，按基质胶：无血清培养基=1：2的比例配制并混匀，按每孔700ul加入稀释混匀好的基质胶至24孔板中，晃动并铺平，然后将24孔板放置于培养箱中，待基质胶凝固即可使用。
26.对于transwell实验，将诱导后消化离心好的细胞用新鲜的无血清的培养基重悬细胞并计数，取5
×
104个细胞并用无血清的培养基稀释至总体积300ul，然后将细胞悬液加入到transwell小室的上室中，下室则加入700ul含5%血清的培养基，将整个体系放置于培养箱中培养8h后，将小室取出，用4%的多聚甲醛固定细胞15min，然后用pbs轻柔洗三遍，然后再用结晶紫染液染细胞15min，用pbs洗去多余的结晶紫染液。用棉签轻柔拭去小室内面的细胞，然后在显微镜下观察拍照，取随机的视野用image j进行计数，统计学分析不同处理组别间细胞迁移能力的差异。结果发现与对照组相比，敲除外泌体lncrna bcyrn1后，膀胱癌细胞外泌体诱导淋巴管细胞的迁移能力明显减弱。
27.成管实验和transwell实验显示外泌体lncrna bcyrn1能促进淋巴管内皮细胞的成管和迁移能力，其中图5是显微镜下拍摄的淋巴管内皮细胞成管和transwell的代表图，图6是统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞成管宽度的差异，三个点代表实验重复三次，统计学方法是one
‑
way anova followed by dunnett’s tests；图7是统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞transwell穿过去细胞数的差异，三个点代表实验重复三次，统计学方法是one
‑
way anova followed by dunnett’s tests；其中两个**代表组别间比较统计学分析p值小于0.01。
28.体内实验证实外泌体lncrna bcyrn1能显著促进膀胱癌的淋巴转移构建带有gfp荧光标记的um
‑
uc
‑
3膀胱癌细胞系；构建lncrna bcyrn1稳定过表达的um
‑
uc
‑
3膀胱癌细胞系，收集其培养上清，超速离心法提取上清中的外泌体，并用bca法检测外泌体的浓度，将外泌体保存于
‑
80度冰箱中备用；购买4
‑
5周龄的健康雌性裸鼠24只，在其右足垫处注射gfp标记的um
‑
uc
‑
3细胞5
×
105个/只，以构建足垫肿瘤模型。然后将裸鼠随机分成两组，每组12只，在足垫肿瘤处进行瘤内注射提取的外泌体，一组注射um
‑
uc
‑3‑
exo
vector
、一组注射um
‑
uc
‑3‑
exo
bcyrn1
，每次注射20ug，每3天一次；然后每周行一次活体成像
观察裸鼠足垫腘窝淋巴结的转移情况，直至裸鼠足垫肿瘤体积大于200mm3或裸鼠死亡。分离裸鼠腘窝淋巴结，测量其体积，并用免疫组化分析其肿瘤的转移情况，记录并分析不同外泌体诱导组别间裸鼠腘窝淋巴结转移率的差异。结果发现膀胱癌细胞um
‑
uc
‑
3源性外泌体lncrna bcyrn1能显著促进膀胱癌的淋巴转移。其中图8：通过裸鼠活体成像检测不同组别间裸鼠腘窝淋巴结转移的情况，图9：通过免疫组化检测裸鼠腘窝淋巴结中肿瘤的转移情况，免疫组化使用的抗体是抗gfp。图10：统计学表格分析不同组别间发生腘窝淋巴结转移的裸鼠的数量，并用卡方检验进行差异显著性分析，其中一个*代表统计学p值小于0.05。
29.机制部分：外泌体lncrna bcyrn1能被淋巴管内皮细胞hlecs所摄取并上调vegfr3的表达：将膀胱癌细胞um
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uc
‑
3和5637细胞培养上清的外泌体提取后用pkh67荧光染料标记后与hlecs共培养后，通过共聚焦显微镜观察荧光标记的外泌体被hlecs的摄取情况（图11），进一步提取共培养的hlecs细胞的总rna，并通过qrt
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pcr检测lncrna bcyrn1的表达情况以证实外泌体lncrna bcyrn1被hlecs所摄取（图12）；通过敲除膀胱癌细胞um
‑
uc
‑
3中的lncrna bcyrn1的表达并提取其细胞上清中的外泌体后，与hlecs共培养2天后，通过提取hlecs中的总rna和总蛋白，并分别通过qrt
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pcr和蛋白质电泳检测发现，敲除lncrna bcyrn1的um
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uc
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3细胞外泌体对hlecs中vegfr3表达的促进能力显著减弱（图13）。进一步通过放线菌素d实验证实敲除lncrna bcyrn1后的um
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uc
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3细胞外泌体对hlecsvegfr3 mrna的稳定性的促进能力显著减弱（图14）。
30.以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。