一种登革病毒血清3型流行株GZ14D3复制子及其应用的制作方法

一种登革病毒血清3型流行株gz14d3复制子及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种登革病毒血清3型流行株gz14d3 复制子及其应用。


背景技术：

2.登革病毒(denv)感染引起的一系列疾病是目前热带地区重要的蚊传播病 毒性疾病，传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊。1970年以前，9个国家有过严重 的登革热流行，而目前登革已经影响到热带和亚热带地区的100多个国家，每 年约有3.9亿登革热感染病例发生，约70％的病例出现在亚洲。世界卫生组织估 计，在过去50年中观察到的全球发病率增加了30倍。如今，登革病毒对全球 公众健康构成重大威胁，全球约有五分之二的人口处于受登革感染的风险之中。
3.在全球范围内，登革病毒有四种血清型(denv
‑
1，denv
‑
2，denv
‑
3和 denv
‑
4)，可引起登革热(df)、登革出血热(dhf)以及登革休克综合征(dss)。 登革热是一种急性发热性疾病，伴有头痛，眶后疼痛，肌痛，关节痛，皮疹， 出血症状和/或白细胞减少症。dhf的标志性特征包括血小板减少症，出血和血 浆渗漏征象，这可能导致低血压性休克(dss)。尽管感染后机体可保持数十年 的针对该血清型的保护性免疫，但继发感染不同的血清型则会增加患重症的风 险，重症登革热如果不加以治疗，死亡率可达20％。目前尚无特异性抗病毒治 疗药物，有几种在局部国家或地区使用或处于临床试验的疫苗，但是由于登革 的抗体依赖性增强(antibody
‑
dependent enhancement，ade)的现象给疫苗的 研发与推广带来了巨大的挑战。
4.登革病毒是单股正链rna包膜黄病毒，其10.7kb基因组含有5'、3'utr和 一个开放阅读框，其编码一条多聚蛋白，该多聚蛋白被宿主和病毒蛋白酶翻译 后切割成三种结构蛋白(c，capsid；pr/m，膜蛋白；e，包膜蛋白)和七种非结 构蛋白(ns1，ns2a，ns2b，ns3，ns4a，ns4b和ns5)。
5.反向遗传系统是从病毒基因组的分子水平研究病毒生活史，以及发病机制、 研发疫苗和开发抗病毒药物的重要方式。对于rna病毒，我们常通过建立其全 长感染性克隆和复制子来对其进行体外研究。hcv daa药物的研发和上市是 hcv复制子系统应用于抗病毒药物筛选的一个典型案例。
6.在病毒的反向遗传系统中，复制子系统包含了能在细胞中自主复制的基因 组。复制子系统已经在许多正链rna病毒中构建出来，如sindbis病毒、脊髓 灰质炎病毒、semliki森林病毒、人类鼻病毒，冠状病毒和丙型肝炎病毒，以及 各种黄病毒，包括昆金病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒，yfv和tbev。亚 基因组复制子是能够实现自我复制的病毒亚基因组结构，包括5’utr、3’utr 及其附近的顺式作用元件和rna复制和转译所必需的非结构病毒蛋白。全长复 制子可产生传染性病毒颗粒。近年来denv复制子技术有了多种构建途径，可 用于抗病毒化合物的筛选和病毒分析复制机制。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种登革病毒血清3型流行 株gz14d3复制子及其应用。本发明构建了一个带有荧光素酶报告基因和潮霉 素抗性基因筛选标记的稳定高效的denv
‑
3复制子，并用于高通量筛药。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种登革病毒血清3型 流行株gz14d3复制子，所述复制子的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.作为本发明所述复制子的优选实施方式，所述复制子的构建方法如下：
10.(1)使用的载体是ptight载体，载体上包含了pbr322来源的高拷贝复制 原点、七次四环素应答元件、巨细胞病毒真核启动子、3’utr、衣壳蛋白前402 个碱基的序列、海肾荧光素酶报告基因、fmdv2a蛋白切割序列、新霉素抗性 基因、emcv ires元件、e蛋白前24个氨基酸的碱基序列、整个非结构蛋白序 列、denv
‑
2 16681的3’utr、丁型肝炎病毒核酶的反基因组序列和猴病毒40 聚腺苷酸化信号序列；
11.在构建复制子时，采用同源重组的方法，由于本毒株3’utr克隆至载体 上有缺失的现象，于是用denv
‑2‑
16681毒株的3’utr替代，最终构建了嵌 合的denv
‑
3复制子。
12.本发明还提供含有所述复制子的细胞。
13.作为本发明所述细胞的优选实施方式，所述细胞是将所述复制子转染至宿 主细胞中得到。
14.作为本发明所述细胞的优选实施方式，所述宿主细胞是bhk
‑
21。
15.本发明还提供所述的复制子或所述的细胞在研究登革病毒的复制机理中的 应用。
16.本发明还提供所述的复制子或所述的细胞在抗病毒药物筛选中的应用。
17.本发明还提供甲氯环素磺基水杨酸盐在制备抑制登革病毒复制的药物中的 应用。
18.本发明的有益效果：
19.(1)本发明利用可在真核细胞中转录的巨细胞病毒(cmv)的直接
‑
早期 启动子，构建了一个带荧光素酶报告基因的denv
‑
3临床分离株的亚基因组复 制子，它包含了病毒的5’utr、部分衣壳蛋白序列和ns1
‑
ns5序列。流行株 zg14d3属于登革病毒血清型iii型，基因型根据rico
‑
hesse登革病毒基因型命 名法属于印度次大陆型。将复制子质粒转染至bhk
‑
21细胞并用新霉素进行筛 选，筛选出了含有稳定表达高荧光素酶报告基因信号的denv
‑
3单克隆复制子 细胞。提取连续传代120天的复制子细胞的rna，测序分析denv
‑
3rna序列 发现，ns2b、ns3和ns5中分别存在3个同义突变，在这段过程中复制子的荧 光素酶的活性一直保持较高且稳定的水平。
20.(2)本发明用已知的denv抑制剂霉酚酸证实该药物在复制子细胞上体现 出了良好的抑制复制效果(ic50＝1.7μm)。接下来，我们筛选了近1000种经 fda批准的临床药物，发现了对denv
‑
3复制子有抑制作用的药物甲氯环素磺 基水杨酸盐。总的来说，我们构建denv
‑
3复制子系统的方法是一种可行的分 子操作方法，该复制子是研究denv和药物研发的可靠工具。
附图说明
21.图1：denv
‑
3流行株gz14d3的系统发育树。根据rico
‑
hesse登革病毒 基因型命名法，我们在genbank上下载了denv
‑
3各基因型及denv1
‑
4的代 表毒株的e蛋白基因序列，用mega7软件比对，neighbor
‑
joining(nj)法构建 系统发育树。根据进化树可以看出，流行株zg14d3属于登革病毒血清型iii 型，基因型属于印度次大陆型。
22.图2：构建denv
‑
3复制子pcmv
‑
dv3rep的图示。denv
‑
3病毒株 zg14d3复制子pcmv
‑
dv3rep的图示。复制子的元件包括了七次四环素应答 元件、巨细胞病毒(cmvmin)真核启动子、3’utr、衣壳蛋白前402个碱基的 序列、海肾荧光素酶报告基因(gluc)、fmdv2a蛋白切割序列、新霉素抗性 基因(neo)、emcv ires元件、e蛋白前24个氨基酸的碱基序列、整个非结 构蛋白序列、dv2
‑
16681的3’utr、丁型肝炎病毒核酶(hdvr)的反基因组序 列和猴病毒40(sv40)聚腺苷酸化信号序列。
23.图3：denv
‑
3复制子在细胞内有效复制。(a)复制子质粒转染到bhk
‑
21 细胞中，经g418筛选3周后，pcmv
‑
dv3rep(dv3r)和ns5突变的复制缺陷 复制子(dv3r
‑
mut)在细胞中的相对荧光素酶活性。(b)实时荧光定量pcr 检测bhk21细胞中复制子的相对rna水平，转染pcmv
‑
dv3rep并用g418 筛选3周(dv3r
‑
g418)，质粒瞬时表达72h(dv3r
‑
72h)和质粒瞬时表达54h (dv3r
‑
54h)。进行三次独立重复实验，数据以mean
±
sd显示。数据统计使 用单因素方差分析和tukey’s多重比较检验，*表示显著(p<0.05)，**表示非 常显著((p<0.01)。
24.图4：利用denv
‑
3复制子筛选抗病毒药物。(a)已知抗病毒化合物霉酚 酸在denv
‑
3复制子细胞中的剂量效应曲线。(b)甲氯环素磺基水杨酸盐在 denv
‑
3复制子细胞中的剂量效应曲线。(c)甲氯环素磺基水杨酸盐对denv
‑ꢀ
2的抑制曲线。(d)cck
‑
8法测定梯度浓度的甲氯环素磺基水杨酸盐药物浓度 处理huh7.5细胞48小时对细胞的毒性。进行三次独立重复实验，数据以 mean
±
sd显示。
具体实施方式
25.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但 不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
26.本发明采用的材料与方法如下：
27.一、材料
28.实验细胞系：本发明中用到细胞系huh7.5由洛克菲勒大学的charlierice教 授提供、293t由中山大学张辉教授提供、vero由中山大学崔隽教授提供、 bhk
‑
21、a549中山大学张萍教授提供。
29.质粒：克隆载体ptight由yueh教授提供。
30.二、方法
31.(1)病毒体外扩增(denv)
32.denv广州流行株均来自于中山大学中山医学院黄曦教授课题组。先将vero 细胞按照每孔5
×
105个细胞铺至6孔板，于37℃培养箱中培养16h左右，待其 贴壁。感染时，用无血清培养基dmem稀释病毒液，使感染时每个孔的病毒 moi＝0.01，且液体体积达到800μl，正好覆盖细胞表面。37℃、5％co2条件下 孵育2小时，病毒吸附后，吸掉上清病毒液，pbs洗1
‑
2次，加入2.5ml含有 2％fbs的dmem，37℃、5％co2条件下培养72h后收细胞上清(即扩增
的病 毒液)，用0.45μm滤器过滤，于
‑
80℃冰箱保存。
33.(2)rna提取
34.1)将样品(适量的细胞或者250μl病毒)，加入1ml或750μl trizol(trizol 加量不足可能导致提取的rna有dna污染)，反复吸打或盖盖子后剧烈混匀(充 分破碎细胞)，室温裂解5min(静置于核酸蛋白复合体的分离)；
35.(此步骤后可放入
‑
80℃暂停)
36.2)加200μl氯仿，剧烈混匀使颜色均匀粉红，室温放置2min(可见分层)。 trizol：氯仿比例一般为5:1；
37.3)4℃12000rpm离心15min(确定ep管盖子盖好，冷冻离心机要提前 打开预冷)。此时ep管内有三层：上层水相为rna，中间层为dna沉淀，下 层有机相是蛋白质；
38.4)取上清到另一新ep管(擦干净管壁的水汽，分层不稳定，不可晃动， 选用小量程移液器慢慢吸取，枪头对着自己，看得清楚)；如对rna纯度要求 高，可再12000rpm离心15min，重取上清(选作)；
39.5)加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后
‑
20℃放20min以上；[每使用1ml trizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8m柠檬酸钠和1.2m nacl)混合离心，可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯rna]
[0040]
6)4℃12000rpm离心15min；
[0041]
7)弃上清(可直接倒，然后倒置吸干)，加1ml 75％乙醇(depc处理的rnase free水：无水乙醇＝1：3v/v)，泛起沉淀，轻轻颠倒洗涤，4℃7500rpm离心5min。 重复一次；
[0042]
8)倒掉大部分乙醇后，稍微离心后再用移液器吸干，rna沉淀室温干燥3
‑ꢀ
5min(过于干燥会导致rna的溶解性大大降低)，加入适量(20
‑
50μl)depc 水溶解，测rna质量和浓度，2μl琼脂糖凝胶电泳。
[0043]
(3)病毒片段rna的反转录
[0044]
按下列组分配置rt(配置时在冰上进行)，为了保证反应液配置的准确性， 减少分装时造成的误差，应按照实际用量的稍大体积配置反应液。
[0045]
成分体积gene specific primer(10μm)2.5μlrna9μldntp(10mm)1μl
[0046]
65℃热激2min，后放置于冰上5min，继续加入以下成分：
[0047]
成分体积5
×
first
‑
strandbuffer4μldtt(0.1m)1μlrnasin(20
‑
40u/μl)0.5μlsuperscriptⅲ(200u/μl)2μl
[0048]
在pcr仪器上60℃处理50min(反转录过程)，70℃处理15min(反转录 酶失活过程)，pcr仪4℃保存。
[0049]
之后再加入1μl rnase h(1
‑
4u/μl)和1μl rnaset(1000u/μl)37℃处理 20min，目的是除去多余的rna。
[0050]
实施例1 denv
‑
3流行株gz14d3的系统发育树
[0051]
首先，将临床登革病毒样本接种至vero细胞上进行培养扩增，得到较高滴 度的病毒，提取病毒rna，反转得到cdna，通过分三段pcr扩增到覆盖绝大 部分基因组的序列，测序鉴定毒株。根据rico
‑
hesse登革病毒基因型命名法， 我们在genbank上下载了denv
‑
3各基因型及denv1
‑
4的代表毒株的e蛋白 基因序列，用mega7软件比对，neighbor
‑
joining(nj)法构建系统发育树。根据 进化树可以看出，流行株zg14d3属于登革病毒血清型iii型，基因型属于印度 次大陆型(图1)。
[0052]
实施例2 denv
‑
3复制子的构建步骤
[0053]
我们使用的载体是ptight载体，载体上包含了pbr322来源的高拷贝复制 原点、七次四环素应答元件(7xtre)、巨细胞病毒(cmvmin)真核启动子、3
’ꢀ
utr、衣壳蛋白前402个碱基的序列、海肾荧光素酶报告基因(gluc)、fmdv2a 蛋白切割序列、新霉素抗性基因(neo)、emcv ires元件、e蛋白前24个氨 基酸的碱基序列、整个非结构蛋白序列、denv
‑
2 16681的3’utr、丁型肝炎 病毒核酶(hdvr)的反基因组序列和猴病毒40(sv40)聚腺苷酸化信号序列。 在构建复制子时，采用同源重组的方法，由于本毒株3’utr克隆至载体上有 缺失的现象，于是用denv
‑2‑
16681毒株的3’utr替代，最终构建了嵌合的 denv
‑
3复制子pcmv
‑
dv3rep(图2)和ns5突变(gdd
‑
gaa)的复制缺陷 复制子(dv3r
‑
mut)。
[0054]
实施例3 denv
‑
3复制子在细胞内有效复制
[0055]
将复制子质粒转染至bhk
‑
21细胞并用新霉素进行筛选，经过3周筛选出 了含有稳定表达高荧光素酶报告基因信号的denv
‑
3单克隆复制子细胞(图3)。
[0056]
提取连续传代120天的复制子细胞的rna，测序分析denv
‑
3rna序列发 现，ns2b、ns3和ns5中分别存在3个同义突变(表1)，在传代过程中复制 子的荧光素酶的活性一直保持较高且稳定的水平。
[0057]
表1连续传代120天的bhk
‑
21复制子细胞中提取rna反转测序分析复制子的 序列
[0058][0059][0060]
实施例4利用denv
‑
3复制子筛选抗病毒药物
[0061]
我们用已知的denv抑制剂霉酚酸(mycophenolicacid)证实该药物在复制 子细胞上体现出了良好的抗病毒活性(ic
50
＝1.7μm)(图4a)。接下来，我们正 在筛选近1000种经fda批准的临床药物，用于发现对denv
‑
3复制子有抑制 作用的药物。我们已筛选出甲氯环素磺基水杨酸盐 (meclocyclinesulfosalicylatesalt)，它有广谱抗菌和抗原生动物活性，对denv
‑
3 复制子细胞有较好的剂量效应曲线(ic
50
＝3.232*10
‑5μm)(图4b)，对denv
‑
2 有一定抑制作用(ic
50
＝8.723*10
‑6μm)(图4c)，且该药物在10
‑7‑
10
‑5μm浓度范 围内对huh7.5细胞几乎没有毒性。
[0062]
总之，我们构建denv
‑
3复制子系统的方法是一种可行的分子操作方法， 并且该复
制子是研究denv和药物研发的可靠工具。
[0063]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。