本发明属于生物，具体涉及一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因型的方法及检测试剂盒。
背景技术：
1、耐药结核病是指患者感染的结核分枝杆菌(m.tuberculosis,mtb)对任一种或以上的抗结核药物耐药。耐药结核病联合用药多，疗程长，不良反应多，诊疗费用高，耐药结核菌传播对家庭和社会的危害大。
2、链霉素(streptomycin，sm)是1945年发明的一种从灰链霉菌的培养液中提取的氨基环醇糖苷类抗生素，临床上主要用于结核病的治疗，它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。随着sm的广泛应用，mtb对sm耐药率逐渐上升，此外，sm的副作用较大，长期或大量服用容易造成听神经损害以及肾毒性，其耐药性及副作用日益受到重视。
3、耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，mdr-tb)是指mtb同时对利福平和异烟肼耐药。而准广泛耐药结核病(pre-extensive drug-resistanttuberculosis，pre-xdr-tb)和广泛耐药结核病(extensive drug-resistanttuberculosis，xdr-tb)的定义随着不同时期化疗方案的变化而有不同，2021年who正式将pre-xdr-tb定义为mtb不仅对利福平和异烟肼同时耐药，也对氟喹诺酮类药物中任何一种药物耐药；将xdr-tb定义为mtb不仅对利福平和异烟肼同时耐药，也对氟喹诺酮类药物中任何一种药物以及至少一种其他的a组药物如贝达喹啉、利奈唑胺具有耐药性。虽然目前对二线注射类药物耐药的重视减少了，全程口服的耐药短程治疗方案中以前推荐的基于注射类药品的短程治疗方案被代替，在耐药的长疗程化疗方案中卡那霉素(km)不再推荐应用，但阿米卡星(am)和卷曲霉素(cm)仍作为c组药物供选择，因此，对于mdr-tb尤其是pre-xdr-tb和xdr-tb患者在考虑应用二线注射类药物组成化疗方案时，仍需快速检测其耐药性。
4、由此可见，在结核病仍然是当前严重的公共卫生问题的情况下，结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物(am和cm)耐药基因的快速检测对于耐药结核病尤其是mdr-tb、pre-xdr-tb和xdr-tb有效化疗方案的制定仍具有临床意义。
5、目前，临床上开展的传统的链霉素和二线注射类药物表型药敏试验方法是建立在细菌培养基础上的，一般先在固体或液体培养基上培养细菌，细菌生长后菌种鉴定为mtb后再进一步进行药敏实验，大约需要1-2个月时间，繁琐费时，严重延误结核病的早期诊断和有效化疗，导致耐药结核病的传播。
6、随着分子生物学技术的发展，以及mtb对部分一线和二线抗结核药物耐药分子机制的部分阐明，如目前研究已经证实sm主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，诱导遗传密码的错读，抑制mrna转译的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质合成。目前研究发现，链霉素耐药与rpsl和rrs基因突变有关，rpsl和rrs基因分别编码结核分枝杆菌s12核糖体蛋白质和16s rrna，链霉素首先要与核糖体蛋白s12结合，在其介导下，增强与16s rrna特定位点的亲和力，当rpsl和rrs基因发生突变时，核糖体蛋白s12和16s rrna异常，链霉素与之结合的亲和力下降，表现为对链霉素耐药。结核分枝杆菌耐sm 60％～80％由rpsl和(或)rrs基因突变所致，其中52％～59％链霉素耐药株由rpsl基因突变所致，8％～21％由rrs基因突变引起。rpsl突变主要位于43位和88位密码子，其中43位密码子突变的发生率显著高于88位密码子。rrs突变常发生于513位核苷酸，还可见于491、512、516、904和1401位核苷酸等。少数菌株存在rpsl和rrs双位点突变。
7、常用的二线注射类药物有km、am和cm。研究报道mtb二线注射类药物的作用机制有以下两个观点：(1)氨基糖苷类药物km、am是通过修饰16s rrna的核糖体小体结构抑制蛋白质合成，其耐药的产生与16s rrna编码基因rrs突变相关。eis基因启动子区突变提高了eis蛋白表达水平，使氨基糖苷类药物乙酰化显著上升，加剧了耐药性的产生；eis启动子区g(-10)a突变及c(-14)t突变株均为km低水平耐药，由于eis基因启动子区其较低的突变率，可与rrs基因联合对km耐药性进行检测；(2)cm属于多肽类药物，但其作用机制与氨基糖苷类药物相似。除与编码16srrna的rrs基因发生突变有关外，编码2'-0-甲基转移酶的t1ya基因突变是cm耐药性产生的重要原因，其突变导致rrna无法被甲基化，核糖体功能受到影响而引起cm耐药。cm耐药株发生t1ya基因137位核苷酸插入改变，但由于其较低的突变频率及突变类型的多样性，t1ya基因并不是一个合适的靶标用于分子快速检测。rrs基因编码16srrna，导致km、am和cm耐药的最常见的突变位点为a1401g，且a1401g位点突变可导致卷曲霉素与阿米卡星和/或卡那霉素交叉耐药，c1402t和g1484t也是目前报道较多的导致卷曲霉素耐药的突变位点，但c1402t和g1484t位点突变率比较低，均不到1％。三种二线注射类药物耐药株中，50％-90％发生rrs基因a1401g突变，突变频率最高。rrs基因a1401g突变与km、am高水平耐药相关。rrs基因a1401g突变是sm、km、am和cm发生交叉耐药的分子基础。所以rrs基因作为诊断标记物，用于sm和二线注射类药物的耐药性检测是可行的。rrs a1401g突变对于sm和二线注射药物耐药表型的快速分子诊断具有一定的参考价值。
8、通过检测耐药相关位点的基因突变部位和突变性质，可了解患者的耐药情况，目前已建立了一系列快速检测mtb耐药基因型的方法，这些分子药敏试验方法是建立在基因扩增基础上的，可快速(2～48h)、灵敏地从mtb分离株或预处理的临床标本中检出mtb耐药基因突变，但目前临床应用的分子药敏试验方法各有优缺点，如线性探针试验(line probeassay，lpa)可了解耐药基因常见的突变位点和性质，但杂交、检测过程较繁琐费时，通常需1－2天时间，而且开放性检测，可能会污染扩增产物而导致假耐药的报告；10色实时荧光定量pcr采用闭管检测，不会交叉污染或造成实验室污染，检测过程简便、快速，只需2～3h，但它们只能了解耐药基因是否存在突变，不报告具体的突变位点和突变类型，鉴于有些基因位点突变可能与耐药无关，而导致假阳性；耐药基因测序方法是分子药敏试验的金标准，但目前尚未在临床实验室开展。
9、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，简称maldi-tof ms)技术，是20世纪80年代末建立并迅速发展起来的一种质谱分析技术，是一种新型的软电离生物质谱。其基本原理是样品与芯片基质结合形成结晶后，样品以单分子状态分散在基质中。干燥后在质谱仪中经高能激光激发，样品解吸附；基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(m/z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量，进而得到分析物的基因型信息。根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比大小进行分离，准确检测多肽、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分子质量和纯度，具有准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高的优点。
10、应用质谱方法检测mtb耐药基因型的方法满足临床简单、快速、灵敏、特异的要求，为临床医生合理制定治疗方案提供实验依据。
技术实现思路
1、本发明所要解决的主要技术问题是如何快速、高效、灵敏、简单、特异地检测结核分枝杆菌对mtb链霉素和二线注射类药物的耐药性。
2、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点的试剂。
3、本发明提供的一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点的试剂，包括引物组合物，所述引物组合物为引物组1、引物组2或/和引物组3。
4、所述引物组1由4条引物组成，分别为序列表的序列1的第11-29位核苷酸所示引物(seq id no:1第11-29位为pcr引物核心序列)、序列表的序列2第11-30位核苷酸所示引物(seq id no:1第11-30位为pcr引物核心序列)、序列表的序列7所示引物和序列表的序列8所示引物；
5、所述引物组2由6条引物组成，分别为序列表的序列3第11-29位核苷酸所示引物(seq id no:1第11-29位为pcr引物核心序列)、序列表的序列4第11-29位核苷酸所示引物(seq id no:1第11-29位为pcr引物核心序列)、序列表的序列9所示引物、序列表的序列10所示引物、序列表的序列11所示引物和序列表的序列12所示引物；
6、所述引物组3由3条引物组成，分别为序列表的序列5第11-29位核苷酸所示引物(seq id no:1第11-29位为pcr引物核心序列)、序列表的序列6第11-30位核苷酸所示引物(seq id no:1第11-30位为pcr引物核心序列)、序列表的序列13所示引物；
7、所述引物组中序列1-序列6各引物末端添加保护碱基；具体为在5’端添加包括5-15个碱基的保护碱基序列，优选为加入10bp的tag:acgttggatg。
8、所述耐药基因位点为rpsl 43、rpsl 88、rrs 491、rrs 512、rrs 513、rrs 516和/或rrs 1401，所述rpsl 43是序列14的第67-69位核苷酸，其为aag或agg；所述rpsl 88是序列14的第202-204位核苷酸，其为aag或agg或atg；所述rrs 491是序列15的第93位核苷酸，其为c或t，y表示c或t；所述rrs 512是序列15的第114位核苷酸，其为c或t，y表示c或t；所述rrs 513是序列15的第115位核苷酸，其为a或t或c，h表示a或t或c；所述rrs 516是序列15的第118位核苷酸，其为c或t，y表示c或t；所述rrs 1401是序列16的第160位核苷酸，其为a或g，r表示a或g。
9、上文中，所述引物组1中的所述序列1所示引物与所述序列2所示引物的摩尔比为等摩尔比.
10、所述引物组2中的所述序列3所示引物与所述序列4所示引物的摩尔比为等摩尔比。
11、所述引物组3中的所述序列5所示引物与所述序列6所示引物的摩尔比为等摩尔比。
12、本文中，所述试剂还包括进行pcr反应、虾碱性磷酸酶(sap)的消化反应和单碱基延伸反应所需的试剂。
13、所述pcr反应试剂包括反应液ⅰ(dntps、tris-hcl、mgcl2)、酶ⅰ(扩增酶、ung酶)和特异性的pcr扩增引物。
14、所述sap酶的消化反应试剂包括反应液ⅱ(tris-hcl、mgcl2)和酶ⅱ(sap酶)。
15、所述单碱基延伸反应试剂包括反应液ⅲ(ddntps、tris-hcl、mgcl2)、酶ⅲ(延伸酶)和延伸引物。
16、在一个实施方案中，上述所述pcr引物组1中含有seq id no.1第11-29位核苷酸所示引物和seq id no.2第11-30位核苷酸所示引物；pcr引物组2中含有seq id no.3第11-29位核苷酸所示引物和seq id no.4第11-29位核苷酸所示引物；pcr引物组3中含有seq idno.5第11-29位核苷酸所示引物和seq id no.6第11-30位核苷酸所示引物。上述3对pcr引物组序列为核心序列，其在5’端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5’段加入10bp的tag(acgttggatg)，例如，pcr引物seq id no.1为5’-acgttggatggtgtatgcacccgcgtgta-3’。
17、本发明还提供了前文所述的检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点的引物组合物。
18、本发明还提供了一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点的试剂盒，所述试剂盒含有前文所述的试剂或所述的引物组合物。
19、在一个具体实施方案中，所述试剂盒还可包括pcr产物纯化的试剂：即sap(虾碱性磷酸酶)酶的消化，包括：反应液ⅱ(tris-hcl、mgcl2)和酶ⅱ(sap酶)。
20、在一个具体实施方案中，所述试剂盒还可包括：纯化用树脂，点样及质谱检测用微阵列芯片等试剂。
21、在另一个具体实施方案中，用于pcr产物纯化的试剂为：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶exoi，或电泳凝胶回收试剂，或pcr产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶exoi的纯化试剂时，所使用的pcr引物无需包括保护碱基。
22、本发明还提供了前文所述的试剂在检测或辅助检测链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌，或制备检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点产品中的应用。
23、本发明还提供了前文所述的试剂在制备对待测样本进行结核病指导用药产品中的应用。
24、本发明还提供了前文所述的引物组合物在检测或辅助检测链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌，或制备检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点基因型产品中的应用。
25、本发明还提供了前文所述的引物组合物在制备对待测样本进行结核病指导用药产品中的应用。
26、本发明还提供了前文所述的试剂盒在检测或辅助检测链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌，或制备检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点基因型产品或制备对待测样本进行结核病指导用药产品中的应用。
27、本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌的方法，包括以待测样本的dna为模板，用前文所述的试剂或所述的试剂盒进行pcr扩增，获得pcr产物，随后对所述pcr产物进行虾碱性磷酸酶消化，将消化后的产物进行单碱基延伸获得延伸产物，质谱检测所述延伸引物和延伸产物组成的混合物的分子量，进行结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药性判定。
28、所述结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药性判定标准如下：
29、针对rpsl(43)基因型
30、(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
31、(2)若对应的质谱峰出现在4408.90处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rpsl(43)野生型aag；
32、(3)若对应的质谱峰出现在4424.90处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rpsl(43)突变型agg；
33、(4)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为混合型，表示异质性耐药。
34、针对rpsl(88)基因型
35、(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
36、(2)若对应的质谱峰出现在6424.10处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rpsl(88)野生型aag；
37、(3)若对应的质谱峰出现在6344.20处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rpsl(88)突变型agg；
38、(4)若对应的质谱峰出现在6368.20处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rpsl(88)突变型atg；
39、(5)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为混合型，表示异质性耐药。
40、针对rrs(491)基因型
41、(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
42、(2)若对应的质谱峰出现在5200.40处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(491)野生型c；
43、(3)若对应的质谱峰出现在5184.40处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(491)突变型t；
44、(4)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为混合型，表示异质性耐药。
45、针对rrs(512)基因型
46、(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
47、(2)若对应的质谱峰出现在5427.60处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(512)野生型c；
48、(3)若对应的质谱峰出现在5507.50处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(512)突变型t；
49、(4)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为混合型，表示异质性耐药。
50、针对rrs(513)基因型
51、(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
52、(2)若对应的质谱峰出现在7272.60处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(513)野生型a；
53、(3)若对应的质谱峰出现在7232.70处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(513)突变型c；
54、(4)若对应的质谱峰出现在7216.70处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(513)突变型t；
55、(5)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为混合型，表示异质性耐药。
56、针对rrs(516)基因型
57、(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
58、(2)若对应的质谱峰出现在5064.30处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(516)野生型c；
59、(3)若对应的质谱峰出现在5048.30处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(516)突变型t；
60、(4)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为混合型，表示异质性耐药。
61、针对rrs(1401)基因型
62、(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
63、(2)若对应的质谱峰出现在6410.10处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(1401)野生型a；
64、(3)若对应的质谱峰出现在6330.20处，则判断为所出现质谱峰对应的基因型是rrs(1401)突变型g；
65、(4)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为混合型，表示异质性耐药。
66、上述方法中，还包括使用树脂对所述延伸产物进行纯化，以避免盐离子等对后续检测的影响。
67、上述方法中，所述质谱检测可为将树脂纯化后的产物点在微阵列芯片的基质上，放入质谱仪进行检测。
68、本发明联合了pcr扩增、单碱基延伸反应和质谱检测等技术为一体，既可通过pcr技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用pcr检测耐药基因型的方法，因此它的检测灵敏度很高。使用单碱基延伸引物对dna分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；尤其是不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低，具有广泛的应用前景。
1.一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点的试剂，包括引物组合物，所述引物组合物为引物组1、引物组2或/和引物组3；
2.权利要求1所述的检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点的引物组合物。
3.一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述的试剂或2所述的引物组合物。
4.权利要求1所述的试剂在检测或辅助检测链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌，或制备检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点产品中的应用。
5.权利要求1所述的试剂在制备对待测样本进行结核病指导用药产品中的应用。
6.权利要求2所述的引物组合物在检测或辅助检测链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌，或制备检测检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点基因型产品中的应用。
7.权利要求2所述的引物组合物在制备对待测样本进行结核病指导用药产品中的应用。
8.权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌，或制备检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因位点基因型产品或制备对待测样本进行结核病指导用药产品中的应用。
9.鉴定或辅助鉴定链霉素和二线注射类药物耐药性结核分枝杆菌的方法，其特征在于：包括以待测样本的dna为模板，用权利要求1所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒进行pcr扩增、sap消化和单碱基延伸引物延伸，获得延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，质谱检测所述待检混合物的分子量，进行结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药性的判定。
