本发明属于抗体领域，特别涉及一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体及在检测试纸条中的应用。
背景技术：
1、猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,sads-cov)是一种新发现的猪肠道冠状病毒，能够引起猪急性腹泻综合征(swine acutediarrhea syndrome,sads)。sads-cov主要感染新生仔猪，能够引起5日龄以下的新生仔猪呕吐、水样腹泻、脱水，死亡率高达90％。此外，sads-cov可以在体外感染多种人类的细胞，可能存在跨物种传播的风险，目前还没有针对该病毒有效的药物和疫苗可用。
2、sads-cov属于冠状病毒科，冠状病毒属，是有囊膜的单股正链rna病毒。sads-cov基因组全长约27kb，其基因组排列顺序为：5’-orf1a/1b-s-orf3-e-m-n-ns7a-ns7b-3’，总共编码4个结构蛋白(s、e、m、n)以及16个非结构蛋白和3个辅助蛋白。其中，核衣壳蛋白(n)在结构蛋白中表达量最高，定位在病毒粒子内部，由376个氨基酸组成，大小约为42kda，包括ntd、ctd和rna结合域，在病毒基因组的复制、翻译和组装中发挥着重要作用。由于n蛋白高度保守且具有较好的免疫原性，因此常被作为病毒早期检测和诊断的靶蛋白。
3、目前sads-cov的检测方法主要有病毒分离、免疫组化、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(elisa)、聚合酶链式反应(pcr)和逆转录实时荧光定量pcr(rt-qpcr)等。这些检测方法虽可以灵敏、准确、特异的检测sads-cov，但是仍存在检测时间较长，操作较复杂的问题，不适合现场快速检测。
技术实现思路
1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体。
2、本发明的另一目的在于提供上述抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体在制备检测试纸条中的应用。
3、本发明的再一目的在于提供一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试纸条。
4、本发明的目的通过下述技术方案实现：
5、一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，是单克隆抗体mcab-4或单克隆抗体mcab-5。
6、所述的单克隆抗体mcab-4的重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:1所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no:2所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no:3所示的cdr3。
7、所述的单克隆抗体mcab-4的重链可变区为igg2a型，氨基酸序列如下所示：
8、evklqesgaelvrpgafvklsckasefnikdfymdwvrqrpeqglewigridpendntiydpkfqgkatitadtssntaylqlssltsedtavyyctrfllwalmdywgqgtsvtvss；其中，cdr1为efnikdfy，cdr2为idpendnt，cdr3为trfllwalmdy。
9、所述的单克隆抗体mcab-4的轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no:4所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no:5所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no:6所示的cdr3。
10、所述的单克隆抗体mcab-4的轻链可变区为kappa型，氨基酸序列如下所示：
11、dilltqtplslsvslgdhasiscrssqsvvhsngntylewylqkpgqspellihkvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdfilkisrveaedlgvyycfqgshvpptfgggtkleik；其中，cdr1为qsvvhsngnty，cdr2为kvs，cdr3为fqgshvppt。
12、所述的单克隆抗体mcab-5的重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:7所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no:8所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no:9所示的cdr3。
13、所述的单克隆抗体mcab-5的重链可变区为igg1型，氨基酸序列如下所示：
14、evklqesgpevvrpgvsvkisckgsgytftdydmhwvkqshakslewigvirtyngntdynqnfkgkatmtvdkssstaymelarltsedsaiyycargasyygnyegamdywgqgtsvtvas；其中，cdr1为gytftdyd，cdr2为irtyngnt，cdr3为argasyygnyegamdy。
15、所述的单克隆抗体mcab-5的轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no:10所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no:11所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no:12所示的cdr3。
16、所述的单克隆抗体mcab-5的轻链可变区为kappa型，氨基酸序列如下所示：
17、divmtqdelsltvttgekvtmsckssqsllnsgsqknyliwyqqkpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtdftltissvqaedlavyycqndysspftfgggtkleikr；其中，cdr1为qsllnsgsqkny，cdr2为was，cdr3为qndysspft。
18、一种核酸分子，编码上述抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体。
19、所述的单克隆抗体mcab-4的重链可变区的编码核酸的序列如下所示：
20、gaggtgaaactgcaggagtctggggctgaacttgtgaggccaggggcctttgtcaagttgtcctgcaaagcttctgaattcaacatcaaagacttctatatggactgggtaagacagaggcctgaacagggcctggagtggattggacggattgatcctgaaaatgataatactatatatgacccgaagttccagggcaaggctactataacagcagacacatcctccaacaccgcctacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtactagattcctactctgggcacttatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。
21、所述的单克隆抗体mcab-4的轻链可变区的编码核酸的序列如下所示：
22、gatatcttgctgacccaaactccactctccctgtctgtcagtcttggagatcacgcctccatctcttgcagatctagtcagagcgttgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccagaactcctgatccacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacggatttcatactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttcctccgacgttcggtggaggcaccaaactggaaatcaaa。
23、所述的单克隆抗体mcab-5的重链可变区的编码核酸的序列如下所示：
24、gaggtgaaactgcaggagtctgggcctgaggtggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttccggctacacattcactgattatgatatgcactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattggagttatcagaacttacaatggtaatacagactacaaccagaactttaagggcaaggccacaatgactgtagacaaatcctccagcacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatatattactgtgcaagaggggcctcctactatggtaactacgagggggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtcgcctca。
25、所述的单克隆抗体mcab-5的轻链可变区的编码核酸的序列如下所示：
26、gatatcgtgatgacacaagatgaactctccctgactgtgacaacaggagagaaggtcactatgagctgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaagtcaaaagaactacttgatctggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattatagttctccgttcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacga。
27、上述抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体识别的抗原表位，其中，mcab-4识别的抗原表位为280aa-311aa，mcab-5识别的抗原表位为263aa-279aa，因此可联合应用建立双抗夹心法。
28、上述抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体在制备sads-cov检测试纸条中的应用。该检测试纸条可用单克隆抗体mcab-4和单克隆抗体mcab-5中的至少一种制备得到。
29、一种sads-cov检测试纸条，含有上述单克隆抗体mcab-4和单克隆抗体mcab-5中的至少一种；优选为含有上述单克隆抗体mcab-4和单克隆抗体mcab-5。
30、所述的sads-cov检测试纸条，包括在底板上依次连接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其中，在硝酸纤维素膜上设置有质控线(c)和检测线(t)，样品垫、结合垫、检测线、质控线和吸水垫依次排布；结合垫中含有标记的单克隆抗体a，检测线上设置有单克隆抗体b，质控线上设置有抗鼠抗体；单克隆抗体a和单克隆抗体b不同，分别选自单克隆抗体mcab-4或单克隆抗体mcab-5。
31、上述sads-cov检测试纸条，还包括外壳，外壳上设置有加样孔和观察窗口；加样孔开口于样品垫的位置，从而可用于加入检测样品；观察窗口能观察到检测线和质控线。
32、所述的标记为胶体金标记或荧光素标记。
33、所述的抗鼠抗体优选为羊抗鼠多克隆抗体。
34、所述的样品垫的材质优选为玻璃纤维。
35、所述的结合垫的材质优选为玻璃纤维。
36、所述的吸水垫的材质优选为吸水纸。
37、所述的底板的材质优选为pvc。
38、所述的含有标记的单克隆抗体a在所述的结合垫中的量优选为0.3～0.5μg/cm。
39、所述的单克隆抗体b在所述的检测线上的量优选为0.8～1.3μg/cm；更优选为1μg/cm。
40、所述的抗鼠抗体在所述的质控线上的量优选为0.8～1.3μg/cm；更优选为1μg/cm。
41、上述sads-cov检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
42、(1)制备标记的单克隆抗体a；
43、(2)用结合垫处理液浸泡玻璃纤维，干燥，再将标记的单克隆抗体a用稀释液稀释后，喷洒于处理后的玻璃纤维上，得到结合垫；
44、(3)用样品垫溶液浸泡玻璃纤维，干燥后，得到样品垫；
45、(4)在硝酸纤维膜上的质控线上吸附抗鼠抗体，检测线上吸附单克隆抗体b；
46、(5)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次连接，设置于底板上；其中，样品垫、结合垫、检测线、质控线和吸水垫依次排布，得到试纸条。
47、上述sads-cov检测试纸条的制备方法，还包括如下步骤：
48、(6)将外壳设置于试纸条的外部，其中，加样孔位于样品垫处；观察窗口位于检测线和质控线区域。
49、所述的结合垫处理液的组成如下：牛血清白蛋白1.0g、pvp-40 0.5g、蔗糖1.5g，溶于100ml磷酸盐缓冲液中，搅拌至完全溶解，加入500μl的tritonx-100和100μl的proclin-300，搅拌均匀。
50、所述的稀释液的组成如下：牛血清白蛋白1.0g、蔗糖5.0g、海藻糖2.0g，溶于100ml磷酸盐缓冲液中，搅拌至完全溶解，加入150μl的tritonx-100，搅拌均匀。
51、所述的样品垫溶液的组成如下：牛血清白蛋白1.0g、酪蛋白0.36g、pvp-40 0.9g，溶于100ml磷酸盐缓冲液中，搅拌至完全溶解，加入500μl的tween-20和100μl的proclin-300，搅拌均匀。
52、所述的磷酸盐缓冲液为20mmol/l、ph值7.4的磷酸盐缓冲液。
53、上述sads-cov检测试纸条的使用方法，包括如下步骤：
54、a、待检样品上样到样品垫中；
55、b、结果判定：质控c线不显色，判为无效；c线显色，检测t线不显色，判为阴性；c线、t线均显色，判为阳性。
56、步骤a中所述的待检样品为处于15～40℃的样品；优选为处于15～30℃的样品；更优选处于15～25℃的样品。
57、步骤b中所述的结果为上样后5～10分钟呈现的结果，超过15分钟结果无效。
58、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
59、(1)本发明提供的单克隆抗体，能够特异性识别sads-cov，可通过常规的基因工程方法大量获得，具有良好的特异性和亲和力，两个抗体能够识别不同的抗原表位，为该病毒致病机理的研究、n蛋白的功能探究、检测试剂盒的开发提供了新的原材料。
60、(2)本发明提供的猪急性腹泻综合征抗原检测试纸条，采用能够识别不同表位的两株sads-cov单克隆抗体建立双抗夹心法，可用于sads-cov病原的快速检测，能够检测的最低限度为22.1pfu，与rt-qpcr方法的检测符合率达到100％，并且与6种猪源病毒pedv、prrsv、tgev、pdcov、porv和asfv不发生反应，具有快速、灵敏、特异性高等特点。
1.一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，是单克隆抗体mcab-4或单克隆抗体mcab-5；
2.根据权利要求1所述的抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体，其特征在于：
3.一种核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子编码权利要求1或2所述的抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：
5.权利要求1或2所述的抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体在制备sads-cov检测试纸条中的应用，其特征在于：所述的检测试纸条使用单克隆抗体mcab-4和单克隆抗体mcab-5中的至少一种制备得到。
6.一种sads-cov检测试纸条，其特征在于：含有权利要求1或2所述的单克隆抗体mcab-4和单克隆抗体mcab-5中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的sads-cov检测试纸条，包括在底板上依次连接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：在硝酸纤维素膜上设置有质控线和检测线，样品垫、结合垫、检测线、质控线和吸水垫依次排布；结合垫中含有标记的单克隆抗体a，检测线上设置有单克隆抗体b，质控线上设置有抗鼠抗体；单克隆抗体a和单克隆抗体b不同，分别选自单克隆抗体mcab-4或单克隆抗体mcab-5。
8.根据权利要求7所述的sads-cov检测试纸条，其特征在于：还包括外壳，外壳上设置有加样孔和观察窗口；加样孔开口于样品垫的位置，从而可用于加入检测样品；观察窗口能观察到检测线和质控线。
9.根据权利要求7或8所述的sads-cov检测试纸条，其特征在于：
10.权利要求6～9任一项所述的sads-cov检测试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
