本发明涉及重组腺相关病毒，包含具有增强的肝靶向性的腺相关病毒衣壳蛋白和包含编码治疗剂的核酸序列的表达盒，所述治疗剂可用于肝病的基因治疗。在一些实施例中，核酸序列编码的治疗剂包含α-半乳糖苷酶a(gla/gla)或靶向乙肝病毒基因组的短发夹rna(shorthairpin rna)。本发明还涉及包含这种重组腺相关病毒的组合物，以及这些重组腺相关病毒用于对肝病(例如法布里病或乙型肝炎)患者进行治疗的用途。
背景技术：
1、腺相关病毒(aav)是复制缺陷型的且无包膜的细小病毒，包含线状单链dna基因组。aav的基因组包含dna序列两端的反向末端重复序列(itrs)，以及编码复制蛋白(rep)和衣壳蛋白(cap)的开放阅读框(orf)。aav已被证明在通常情况下是安全的，尚无研究表明其与肿瘤或其他疾病的发病机制有显著关联(guylene(2005)arch ophthalmal123:500-506)。除安全性之外，aav的其他特性，如感染效率高，感染范围广，长期表达等特点(david(2007)bmc bio 7:75)，使得aav更适合用作基因治疗载体。因此，aav被广泛用于治疗多种不同的疾病，例如癌症、视网膜疾病、关节炎、获得性免疫缺陷综合征(aids)、肝脏疾病和神经系统疾病等。
2、法布里病(fabry disease)是一种罕见的遗传病，属于溶酶体贮积症，由α-半乳糖苷酶a(gla)基因突变引起的。gla的缺乏能够导致糖脂在血管、其他组织和器官中堆积，造成其功能损伤。症状包括疼痛、肾脏疾病、皮肤损伤、疲劳、恶心和神经病变。治疗手段包括使用重组的gla进行的酶替代疗法。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hbv)引起的肝脏疾病。经由感染者的血液和精液等体液传播给健康人群。发病症状包括疲劳、食欲不振、胃痛、恶心和黄疸。大约25％的慢性乙型肝炎患者会发生肝硬化和肝癌。世界卫生组织(who)估计，2015年全世界约有2.57亿人患有慢性乙型肝炎，其中887,000人因该疾病死亡。因此，对于这种传播如此广泛的肝脏疾病，开发出安全有效的治疗方法非常重要。aav可作为基因治疗的载体用于递送治疗肝脏疾病，如法布里病或乙型肝炎的治疗剂。乙型肝炎的治疗手段包括基因治疗，可能涉及使用靶向乙型肝炎病毒基因组的短发夹rna(shrna)。当使用aav递送用于治疗肝病的治疗剂时，理想情况是aav具有增强的肝靶向性。
3、aav可分为许多变体，称为血清型，参见文献aav1-aav12(gao et al.(2004)jvirol78:6381-6388；mori et al.(2004)virology 330:375-383；schmidt et al.(2008)jvirol 82:1399-1406)。aav的宿主通常是人类和灵长类动物，其中aav1-6是从人类中分离出来的。因此，aav1-6在人类中会引起明显的免疫反应。aav7和aav8是从恒河猴的心脏组织中分离出来的(gao et al.(2002)pnas 99:11854-11859)，而aav9-12是从人和食蟹猴中分离出来的。虽然所有血清型的aav都具有典型的二十面体结构，但其衣壳蛋白序列和表面拓扑结构的不同，导致不同血清型aav对不同类型的细胞表面受体结合能力和靶向性(timpe(2005)curr gene ther 5:273-284)不同。例如，aav2对多种类型的细胞都具有靶向性，尤其是对神经元具有明显的靶向性；aav1和aav7对骨骼肌具有增强的靶向性；aav3对巨核细胞具有增强的靶向性；aav5和aav6对呼吸道上皮细胞具有增强的靶向性；而aav8对肝细胞具有增强的靶向性广为人知。
4、天然aav所具有的靶向性有限，并且，包含不同aav衣壳蛋白的治疗剂对其各自靶细胞的效力差异很大。此外，人类和其他灵长类动物体内通常含有针对天然aav变体的中和抗体，导致aav的半衰期缩短，在给药后失去功效。因此，出现了大量针对aav衣壳蛋白进行基因改造的研究，以增强其靶向性并降低其免疫原性。经过改造的aav已经在临床中得到应用。例如，aav2.5含有一个嵌合的衣壳蛋白，其通过将aav1衣壳蛋白中的5个决定骨骼肌靶向性的氨基酸，添加到aav2的衣壳蛋白中而得到。携带微小抗肌萎缩蛋白基因(minidystrophin)的aav2.5已被用于治疗杜氏肌营养不良症，i期临床试验已经完成。这些经过改造的aav的安全性也得到了评估。结果表明，与天然aav2相比，aav2.5不仅具有增强的骨骼肌靶向性，而且具有更低的免疫原性。
5、目前对于在人体中有更强肝脏靶向性和更低免疫原性的基因改造的aav仍存在需求。这类aav将成为有价值的改良载体，用于递送治疗肝病(例如法布里病或乙型肝炎)的治疗剂。
6、申请概述
7、本文的一些方面涉及重组aav(raav)。在一些实施例中，raav具有改良的特性，例如更高的包装产量、增强的基因表达水平、较低的免疫原性和/或增强的肝细胞靶向性。在这些实施例中，raav包含基因表达盒，其包含编码用于治疗肝脏疾病治疗剂的多核苷酸序列。在一些实施例中，治疗剂是shrna或gla。在某些实施例中，肝脏疾病是乙型肝炎或法布里病。一方面，本文涉及包含shrna或gla表达盒的载体，例如包含表达盒的质粒。在另一方面，本文进一步涉及生产本发明raav的包装系统。在另一方面，本文进一步涉及用于包装本发明的raav的质粒系统。在另一方面，本文还涉及一种细胞，其包含用于包装本发明的raav的质粒系统，包括含有已包装的raav的分离的工程化细胞。在另一方面，本文还涉及包装本发明的raav的方法。在另一方面，本文进一步涉及包含raav的组合物。在另一方面，本文还涉及包含本发明的raav的组合物在制备预防和治疗肝病的药物中的用途，及其在治疗肝病的方法中的用途，如乙型肝炎和法布里病。
8、所公开的实施例的其他特征和优点，一部分将在随后的描述中阐述，一部分可从描述中明显得出，或者可从所公开实施例中通过实际操作获得。所公开的实施例的特征和优点，将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
9、以上的一般性描述和以下的详细描述均仅是示例和说明性的，并不限制所要求保护的公开实施例。
10、附图构成本说明书的一部分。附图展示了本发明的若干实施例，并且与描述共同用于解释所附权利要求中阐述的所公开实施例的原理。
技术实现思路
1.一种重组腺相关病毒(raav)，其包含：
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒，其中所述表达盒还包含启动子和/或人的非编码填充序列，其中启动子位于所述多核苷酸序列的上游，人的非编码填充序列位于所述多核苷酸序列的下游。
3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒，其中所述启动子是rna聚合酶ii启动子或rna聚合酶iii启动子。
4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒，其中所述启动子是lp1启动子、apoe/haat启动子、dc172启动子、dc190启动子、apoa-i启动子、tbg启动子、lsp1启动子、7sk启动子、h1启动子、u6启动子或hd-ifn启动子；优选为h1启动子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组腺相关病毒，其中所述表达盒两侧还具有aav反向末端重复序列(itrs)。
6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒，其中aav反向末端重复序列(itrs)源自
7.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒，所述aav反向末端重复序列源自血清型
8.根据权利要求7所述的重组腺相关病毒，其中反向末端重复序列itrs源自aav2血清型。
9.根据权利要求1中所述的重组腺相关病毒，其中：所述shrna的序列如seq id no：3所示。
10.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒，其中所述人的非编码填充序列是人的凝血因子ix的内含子序列、人的粘粒c346的序列、hprt-内含子序列或其组合。
11.根据权利要求10所述的重组腺相关病毒，其中所述人的非编码填充序列是如seqid no：4所示的hprt-内含子序列。
12.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒，其中所述表达盒包含seq id no：5所示序列。
13.根据权利要求12所述的重组腺相关病毒，其中所述表达盒还包含seq id no：8所示的序列。
14.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-13中任一项所述的重组腺相关病毒，以及药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述组合物适用于静脉注射给药。
16.根据权利要求14或15中所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含第二治疗剂。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的药物组合物，其中施用所述组合物导致：与携带相同表达盒的重组aav2/8相比，对乙型肝炎表面抗原(hbsag)，乙型肝炎e抗原(hbeag)或hbv dna的抑制作用增强。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的药物组合物，其中所述raav的治疗有效量为1×106vg至1×1018vg。
