本发明属于有机合成，具体涉及一种丙烯酰胺修饰半胱氨酸及其合成和应用。
背景技术：
1、通过合成特殊氨基酸在固相多肽合成过程中引入标签单元修饰(比如助溶标签)已成为多肽修饰的重要方法。2013年，刘课题组发明了在合成的邻硝基苄基修饰的特殊谷氨酰胺(gln)侧链引入(arg)n助溶标签单元，成功合成了lc3-ii(huang,y.-c.；li,y.-m.；chen,y.；pan,m.；li,y.-t.；yu,l.；guo,q.-x.；liu,l.synthesis of autophagosomalmarker protein lc3-ii under detergent-free conditions.angewandte chemieinternational edition 2013,52(18),4858-4862.)，该方法以fmoc-glu-ome为原料通过三步合成邻硝基苄基修饰的谷氨酰胺目标分子，硝基苄基和标签单元可以在光照条件下被一起脱除。2014年，刘课题组发明了一种通过合成特殊甘氨酸引入标签单元的方法，将商业化的2，4-二羟基苯甲醛经过七步反应合成了一个带有hmb基团的fmoc-glyrmb0-oh，hmb基团的n-甲基-n-[2-(甲基氨基)-乙基]-氨基甲酰基的存在使得特殊甘氨酸在多肽固相合成中稳定存在，hmb基团和标签单元可以被tfa一起脱除(zheng,j.-s.；yu,m.；qi,y.-k.；tang,s.；shen,f.；wang,z.-p.；xiao,l.；zhang,l.；tian,c.-l.；liu,l.expedient totalsynthesis of small to medium-sized membrane proteins via fmoc chemistry.j amchem soc 2014,136(9),3695-3704.)。2016年，brik课题组以4-氨基苯腈为原料通过四步合成fmoc-cys(phacmnhalloc)-oh将(arg)n标签单元引入到半胱氨酸(cys)的侧链，成功合成h4蛋白(maity,s.k.；mann,g.；jbara,m.；laps,s.；kamnesky,g.；brik,a.palladium-assisted removal of a solubilizing tag from a cys side chain to facilitatepeptide and protein synthesis.org lett 2016,18(12),3026-3029.)，合成策略包括用烯丙氧羰基保护4-氨基苯基乙腈的氨基，然后通过酸催化将丁腈官能团水解为酰胺，随后，将酰胺转化为氮羟甲基酰胺基团，然后在酸性条件下与fmoc-cys-oh反应得到苯基乙酰氨甲基修饰的半胱氨酸，苯基乙酰氨甲基和标签单元可以通过氯化钯一起被脱除。2018年，danishefsky课题组通过两步合成的特殊半胱氨酸(fmoc-cys(acmnhalloc)-oh)引入标签单元，乙酰胺甲基键和标签分子可以通过钯一起被脱除(brailsford,j.a.；stockdill,j.l.；axelrod,a.j.；peterson,m.t.；vadola,p.a.；johnston,e.v.；danishefsky,s.j.total chemical synthesis of human thyroid-stimulating hormone(htsh)β-subunit:application of arginine-tagged acetamidomethyl(acmr)protectinggroups.tetrahedron 2018,74(15),1951-1956)。
2、虽然上述发明的特殊氨基酸已经成功应用于困难蛋白的合成修饰，但是该领域的研究还存在一些限制，一方面用于引入标签单元的特殊氨基酸的合成步骤繁琐，合成成本较高，存在广泛应用的局限性。另一方面标签单元的引入在蛋白质合成的各种反应条件下要有很强的容忍性和稳定性，并且可以方便高效地脱除，不会产生副反应。这就要求我们在引入标签单元修饰的策略提出新的突破和创新，应用于更加广泛的困难蛋白的化学合成、修饰、表征及分析。
技术实现思路
1、本发明基于上述现有技术进行，目的在于提供一种丙烯酰胺修饰半胱氨酸及其合成和应用；本发明的修饰半胱氨酸可用于在固相多肽合成中引入所需标签单元。
2、本发明所采用的技术方案如下：
3、第一方面，本发明公开了一种丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸，其化学式：alloc-cys(ch2nhcoch＝ch2)-oh，其结构式如下：
4、
5、第二方面，本发明公开了一种丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸的合成方法，用氯甲酸烯丙酯和氮羟甲基丙烯酰胺通过两步反应分别对半胱氨酸的氨基和巯基进行修饰，得到丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸；主要选自如下(a1)或(a2)：
6、(a1)首先，在酸性条件下，半胱氨酸和氮羟甲基丙烯酰胺反应得到丙烯酰胺修饰的半胱氨酸，然后在碱性条件下和氯甲酸烯丙酯反应得到目标分子；
7、(a2)首先，在碱性条件下，胱氨酸和氯甲酸烯丙酯反应得到烯丙氧羰基胱氨酸，然后在还原剂和酸的作用下与氮羟甲基丙烯酰胺反应得到目标分子。
8、在具体的实施方案中，所述(a1)中，半胱氨酸和氮羟甲基丙烯酰胺的摩尔比为1:1～3，可以为1：1、1：2或1：3等，反应温度为室温。
9、在具体的实施方案中，所述(a1)中，半胱氨酸和氯甲酸烯丙酯以及碱的摩尔比为：1：1～3：1～3，可以为1：1：1、1：2：2、1：3：3等，反应条件为室温、氮气氛围。
10、在具体的实施方案中，所述(a2)中，胱氨酸和氯甲酸烯丙酯以及碱的摩尔比为1：2～6：2～6；可以为1：2：2、1：4：4、或1：6：6等，反应条件为室温、氮气氛围。
11、在具体的实施方案中，所述(a2)中，胱氨酸和还原剂以及氮羟甲基丙烯酰胺的摩尔比为1：1～3：2～6；可以为1：1：2、1：2：4、或1：3：6等，反应条件为室温。
12、在具体的实施方案中，所述反应溶剂选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、n-甲基吡咯烷酮、n，n-二甲基甲酰胺中的任意一种。
13、在具体的实施方案中，酸性条件的酸试剂选自三氟乙酸、二氟乙酸、乙酸、甲酸、盐酸、三氯乙酸中任意一种。
14、在具体的实施方案中，碱性条件的碱试剂选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、三乙胺、二异丙基乙胺中的任意一种。
15、第三方面，本发明还保护前文所述的丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸在多肽合成中的应用。
16、第四方面，本发明还保护一种多肽的合成方法，包括如下步骤：
17、(1)准备前文所述的丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸；
18、(2)将丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸通过固相多肽合成引入多肽片段；
19、(3)通过丙烯酰胺双键将哌嗪引入多肽片段；
20、(4)通过哌嗪将标签单元引入多肽片段；
21、(5)脱除半胱氨酸上氨基的烯丙氧羰基保护基；
22、(6)继续固相多肽合成获得线性肽树脂；
23、(7)将多肽树脂裂解、冻干得到粗肽；
24、(8)利用氯化钯脱除半胱氨酸侧链修饰单元得到天然多肽。
25、在具体的实施方案中，所述步骤(2)、步骤(4)和步骤(6)中，采用的缩合剂为下述缩合剂的一种或多种组合：dic、hatu、tbtu、hbtu、pybop、hobt、cl-hobt、dipea、nmm、diea、oxyma。
26、在具体的实施方案中，步骤(3)中引入哌嗪所用的溶剂选自二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、n-甲基吗啡啉,乙腈中的任意一种。
27、在具体的实施方案中，步骤(3)中哌嗪溶液浓度为0.5m～1m。
28、在具体的实施方案中，步骤(5)中脱除烯丙氧羰基的试剂及对应比例为：pd(pph3)4：苯硅烷＝0.2equiv.：20equiv.，溶剂为无水二氯甲烷。
29、在具体的实施方案中，步骤(7)中裂解液为tfa：tis：h2o＝95％：2.5％：2.5％(v：v：v)，在甲基叔丁基醚中低温离心后倒去上清，沉淀溶解冻干得到粗肽。
30、在具体的实施方案中，步骤(8)中脱除半胱氨酸侧链修饰单元的试剂与反应条件为：氯化钯(100mm)溶于6m gn·hcl/200mm pbs(ph＝7.0)，反应温度为37℃。
31、第五方面，本发明还保护前文所述的合成方法合成的多肽。
32、有益效果
33、本发明设计并合成了丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸，分子设计的结构新颖，可作为特殊氨基酸用于多肽固相合成。合成此分子所需原料为l-半胱氨酸/胱氨酸，氮羟甲基丙烯酰胺和氯甲酸烯丙酯，简单易得，成本低廉。合成过程为两步有机反应，经过一次硅胶柱分离可以得到纯度为98％以上的产物，产率为67.4％。此特殊氨基酸可用于在固相多肽合成中引入标签单元，实现疏水多肽的合成与多肽定点修饰。
1.一种丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸，其结构式如下：
2.权利要求1所述的丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸的合成方法，其特征在于：用氯甲酸烯丙酯和氮羟甲基丙烯酰胺通过两步反应分别对半胱氨酸的氨基和巯基进行修饰，得到丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸；主要选自如下(a1)或(a2)：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述(a1)中，半胱氨酸和氮羟甲基丙烯酰胺的摩尔比为1:1～3，优选为1：2，反应温度为室温；
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述(a2)中，胱氨酸和氯甲酸烯丙酯以及碱的摩尔比为1：2～6：2～6；优选为1：4：4，反应条件为室温、氮气氛围；
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，反应溶剂选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、n-甲基吡咯烷酮、n，n-二甲基甲酰胺中的任意一种；酸试剂选自三氟乙酸、二氟乙酸、乙酸、甲酸、盐酸、三氯乙酸中任意一种；碱试剂选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、三乙胺、二异丙基乙胺中的任意一种。
6.权利要求1所述的丙烯酰胺修饰的烯丙氧羰基半胱氨酸在多肽合成中的应用。
7.一种多肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
10.权利要求7-9任一所述的合成方法合成的多肽。
