本发明涉及植物分子生物学领域，具体地说，涉及利用绿色荧光蛋白标记植物愈伤组织及种子的方法。
背景技术：
1、利用转基因技术能够将具有优良性状的目的基因导入植物基因组中，从而使植物的遗传性状得到改良，打开了改造植物以具有改善的特征或性状的新大门，所述改善的特征或性状例如植物疾病抗性、昆虫抗性、除草剂抗性、产量品质改亮、植物可食用部分的营养质量的改善等。然而转化过程中只有少数植物细胞能够吸收外源dna并整合进植物基因组中，大多数细胞是未转化的。因此，目的基因的引入常常需要借助于筛选标记基因，赋予转化细胞以特定的选择性标记，以便识别和鉴定转基因植物。
2、荧光蛋白作为标记分子本身来源于海洋动物，自身可以发荧光进行光学检测，通用性分子量小对细胞无毒害,不需要外源化学物质处理，具有更高的生物安全性。1962年，在维多利亚多管水母体内发现了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)，并纯化gfp。1992年开始，已经开发大量的荧光蛋白基因突变体，它们的荧光颜色几乎涵盖覆盖了深蓝，蓝色，青色，绿色，黄色，橙色，红色，深红和近红外的波段。livet等用多种不同颜色的荧光蛋白对神经系统进行了基因标记，使得能够观察到大脑的集成线路图，可以直观地看到神经细胞以及细胞间的相互作用。zhao等发现用gfp标记细菌，可以对细菌的入侵进行时空检测，以确定细菌特异性的感染部位以及传染源的空间位移。taniguchi等构建了一种黄色荧光蛋白融合库(yfp fusion library)作为单分子感受器，可以有效用于分析大肠杆菌单细胞中蛋白质和mrna表达水平的关系。荧光蛋白在植物中应用的研究很少，仅有几种如mgfp、sgfp、egfp等，在组织水平存在亮度不够，表达不够均一，可选择性少等问题。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种利用绿色荧光蛋白标记植物愈伤组织及种子的方法。
2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种绿色荧光蛋白mgl，所述蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
3、i)如seq id no:2所示的氨基酸序列；或
4、ii)在i)的n端和/或c端连接标签得到的氨基酸序列；或
5、iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
6、第二方面，本发明提供编码所述蛋白mgl的核酸分子，全序列优化后的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7、第三方面，本发明提供一种生物材料，所述生物材料包含编码所述蛋白mgl的核酸分子或表达所述蛋白mgl。
8、所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞。
9、第四方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒包含启动子-编码所述蛋白mgl的核酸分子-终止子。
10、进一步地，所述启动子为组成型启动子、植物种子特异性启动子、水稻或玉米的ubi启动子、actin启动子、rubisco小亚基启动子或cab启动子等中的至少一种；其中，所述组成型启动子优选花椰菜花叶病毒的35s启动子，所述植物种子特异性启动子优选水稻谷蛋白glub-4基因启动子。
11、所述终止子为athsp ter终止子或ubi终止子。
12、优选地，所述启动子为花椰菜花叶病毒的35s启动子和水稻谷蛋白glub-4基因启动子，所述终止子为athsp ter终止子。
13、在本发明的一个具体实施方式中，所述表达盒包含如seq id no:3所示的核苷酸序列。
14、第五方面，本发明提供所述蛋白mgl、编码所述蛋白mgl的核酸分子、包含编码所述蛋白mgl的核酸分子或表达所述蛋白mgl的生物材料，或者所述表达盒的以下任一应用：
15、1)用于植物愈伤组织中通过绿色荧光筛选阳性愈伤组织；
16、2)用于转基因植物种子标记；
17、3)用于制备转基因植物。
18、第六方面，本发明提供一种利用绿色荧光蛋白标记植物愈伤组织及种子的方法，所述方法包括：使植物含有编码所述蛋白mgl的核酸分子或表达所述蛋白mgl。
19、所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米。
20、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
21、(一)本发明提供一种利用绿色荧光蛋白标记植物种子的方法，通过合成绿色荧光蛋白mgl基因，将其构建于植物种子特异性启动子下游，遗传转化载体通过农杆菌介导转入水稻胚性愈伤，挑选阳性愈伤组织，分化成苗，其阳性愈伤组织和结实种子在荧光显微镜下观察，转基因种子具有明显绿色荧光。该方法可以区分转基因种子和非转基因种子，作物筛选标记，也可以用来标记愈伤组织，作为转化筛选方法。
22、(二)荧光蛋白激发波长488nm发射波长515nm，为绿色，具有更强的组织穿透能力，并且更容易与植物自身荧光区分开。
23、(三)该绿色荧光蛋白在阳性愈伤组织中表达，通过荧光检测很容易区分转基因种子和非转基因愈伤组织。
24、(四)该绿色荧光蛋白在阳性愈伤组织、植物种子中表达，通过荧光检测很容易区分转基因种子和非转基因种子，在转基因标记和生产中有很好的应用前景。
1.绿色荧光蛋白mgl，其特征在于，所述蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如seq id no:1所示。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求2所述核酸分子或表达权利要求1所述蛋白；
4.表达盒，其特征在于，所述表达盒包含启动子-权利要求2所述核酸分子-终止子。
5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为组成型启动子、植物种子特异性启动子、水稻或玉米的ubi启动子、actin启动子、rubisco小亚基启动子或cab启动子中的至少一种；其中，所述组成型启动子优选花椰菜花叶病毒的35s启动子，所述植物种子特异性启动子优选水稻谷蛋白glub-4基因启动子；
6.根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为花椰菜花叶病毒的35s启动子和水稻谷蛋白glub-4基因启动子，所述终止子为athsp ter终止子。
7.根据权利要求6所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒包含如seq id no:3所示的核苷酸序列。
8.权利要求1所述蛋白、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述生物材料或权利要求4-7任一项所述表达盒的以下任一应用：
9.利用绿色荧光蛋白标记植物愈伤组织及种子的方法，其特征在于，所述方法包括：使植物含有权利要求2所述核酸分子或表达权利要求1所述蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米。
