本发明属于生物，具体涉及一种新型羰基还原酶突变体及其在酶法合成唯贝隆中间体中的应用。
背景技术：
1、立体选择性羰基还原酶(carbonyl reductase,e.c.1.1.1.148)是一类能够催化醇与醛/酮之间双向可逆氧化还原反应的酶类，需要辅酶nad(h)或nadp(h)作为氢传递体。目前羰基还原酶主要分布于三个超家族：短链脱氢酶、中链脱氢酶和醛酮还原酶。虽然三者的催化功能相似，但在结构上差异较大。羰基还原酶催化的不对称还原反应遵循顺序bi-bi动力学催化机制，辅酶nad(p)h首先与酶结合组成全酶，底物进入酶的底物结合口袋，获得nad(p)h传递的一个[h]被还原，同时nad(p)h失去[h]被氧化，随后氧化型nad(p)与酶分离，产物从活性中心释放，最后利用手性物质或酶将氧化型nad(p)还原成nad(p)h重新循环利用。立体性羰基还原酶具有广泛的应用价值，能够催化含多种醛基或者羰基的物质转化为手性醇，但是不同的手性异构体通常具有不同的，甚至相反的药理活性，因此，研究开发一种产物专一高活性立体性羰基还原酶具有很高的研究与应用价值。
2、维贝隆(vibegron，(6s)-n-[4-({(2s,5r)-5-[(r)-hydroxy(phenyl)methyl]pyrrolidin-2-yl}methyl)phenyl]-4-oxo-4,6,7,8-tetrahydropyrrolo[1,2-a]pyrimidine-6-carboxamide)是首个用于治疗膀胱过度活动症(overactivebladder，oab)的β3-肾上腺素能受体激动剂(β3-adrenergic receptor agonist，β3-ar激动剂)类药物。2020年被美国食品和药物管理局(fda)批准用于治疗伴有急迫性尿失禁、尿急、尿频的oab患者的治疗，临床疗效显著，使用安全，无明显副作用，被认为是抗毒蕈碱药物的一种有效替代品。维贝隆作为近十年来第一种治疗oab的新药，为患有oab的患者提供了除抗精神病药、米拉贝隆和去氨加压素之外的另一种安全有效的治疗方法，应用价值巨大，市场前景广阔。
3、顺式双手性中心的构建是维贝隆合成过程中的难点，(2s,3r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基-3-苯基丙酸甲酯(methyl(2s,3r)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-hydroxy-3-phenylpropanoate，(2s,3r)-氨基羟酯)作为维贝隆合成的关键手性中间体，目前主要通过化学法和生物酶法进行制备。然而化学法合成存在诸多缺点，如光学纯度低、反应条件苛刻、“废气、废水、废固”处理困难、成本高等。与化学法相比，生物催化过程通常能够缩短反应时间，减少反应步骤和废物的排放，更重要的是，生物催化剂具有优越的化学、区域和立体选择性，这些突出的优势使得生物催化法更为高效、环保。采用羰基还原酶催化合成维贝隆手性中间体已成为一种新的趋势，具有产物光学纯度高、反应条件温和、绿色环保、成本低等诸多优点。xu等人首次使用以(s)-氨基酮酯为底物，采用羰基还原酶kred制备(2s,3r)-氨基羟酯，虽然实验室规模上产率达到90％，e.e.值大于99％，但在工业化生产中碱性条件下辅酶的利用率、酶的活性和稳定性均不理想，48h内转化率只有98％并且辅酶消耗较大。针对以上问题，xu等人基于结构计算和模拟，对羰基还原酶kred进行分子改造，最终筛选到了活性至少提高了50倍的突变体kred-p301，在45℃、0.1g/l nadp+条件下，(2s,3r)-氨基羟酯产率达到95％，d.r.＞100:1，e.e.＞99％。默沙东公司首次用生物酶法进行维贝隆手性中间体的工业合成，构建了nadph依赖型羰基还原酶kred不对称还原-“葡萄糖脱氢酶-葡萄糖”辅酶再生偶联系统，以葡萄糖为辅底物，将底物(s)-氨基酮酯不对称还原得到产物(2s,3r)-氨基羟酯。在30℃、ph＝7.3～7.7，85g/l底物，70g/l辅底物葡萄糖的条件下，经4h反应后，产物得率约为95.0％，e.e.＞99.9％。因此，获得一种具有高活性、高立体选择性的羰基还原酶对工业合成唯贝隆中间体具有重要意义。
技术实现思路
1、为了进一步提高维贝隆中间体的生产效率以及产物纯度，本发明对exiguobacterium sp.s126来源的立体专一性羰基还原酶(easdr6)进行了深入研究，获得了一种具有高活性、高立体选择性的新型羰基还原酶突变体，及其编码基因，以及含有该突变体编码基因的重组载体、基因工程菌。将所述的新型羰基还原酶突变体应用于酶法合成维贝隆中间体，在具有不对称催化-“葡萄糖脱氢酶-葡萄糖”辅酶再生系统的乙酸正丁酯-磷酸钠盐缓冲液双相反应体系中，维贝隆中间体(2s,3r)-氨基羟酯的产率达到99.9％，e.e.＞99％。
2、本发明提供了一种新型羰基还原酶突变体，是由羰基还原酶或羰基还原酶突变体第190位、第201位、第204位进行单点突变或多点联合突变获得；其中，所述羰基还原酶突变体是由羰基还原酶经下列之一的突变而得：
3、(1)第193位丝氨酸突变为丙氨酸；
4、(2)第138位丙氨酸突变为亮氨酸且第193位丝氨酸突变为丙氨酸。
5、为进一步提高生物酶法合成维贝隆中间体的生产效率，发明人团队对羰基还原酶进行了深入研究，在专利cn 117089533 a中公开了一种exiguobacterium sp.s126来源的羰基还原酶(氨基酸序列如seq id no.1所示)及其突变体，在该专利中，所述的羰基还原酶突变体是对羰基还原酶第138位、第193位进行了单突变或多点联合突变，获得了羰基还原酶突变体mut-a138l、mut-s193a、mut-a138l s193a，其相对酶活相较于野生型羰基还原酶提高了2～4倍。在此基础上，本发明对上述的羰基还原酶突变体进行了进一步的改造，经定点突变技术对其第190位、第201位、第204位进行单点突变或多点联合突变，获得了一系列的具有高活性、高稳定性的新型羰基还原酶突变体，进一步提高了该酶对底物的催化活力和对底物的耐受性。其中，相较于野生型羰基还原酶，新型羰基还原酶突变体mut-a138la190v s193a y201f n204a不仅具有更好的热稳定性，且相对酶活达到了4724.66％，将其应用于500ml催化反应体系中，维贝隆中间体(2s,3r)-氨基羟酯的产率达到99.9％以上，e.e.>99.9％，这一生产效率显著优于现有技术中的羰基还原酶kred。
6、作为优选，所述羰基还原酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7、作为优选，所述突变为下列之一或多种的组合：
8、(1)第190位丙氨酸突变为缬氨酸、丝氨酸、组氨酸中的任意一种；
9、(2)第201位酪氨酸突变为苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、组氨酸中的任意一种；
10、(3)第204位天冬酰胺突变为丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、组氨酸中的任意一种。
11、作为优选，所述的新型羰基还原酶突变体是由氨基酸序列如seq id no.1所示的羰基还原酶第190位丙氨酸突变为缬氨酸，且第193位丝氨酸突变为丙氨酸获得的具有叠加效应的组合突变体mut-a190v s193a。
12、作为优选，所述的新型羰基还原酶突变体是由氨基酸序列如seq id no.1所示的羰基还原酶第190位丙氨酸突变为缬氨酸，且第193位丝氨酸突变为丙氨酸，且第201位酪氨酸突变为苯丙氨酸获得的具有叠加效应的组合突变体mut-a190v s193a y201f。
13、作为优选，所述的新型羰基还原酶突变体是由氨基酸序列如seq id no.1所示的羰基还原酶第190位丙氨酸突变为缬氨酸，且第193位丝氨酸突变为丙氨酸，且第201位酪氨酸突变为苯丙氨酸，且第204位天冬酰胺突变为丙氨酸获得的具有叠加效应的组合突变体mut-a190v s193a y201f n204a。
14、作为优选，所述的新型羰基还原酶突变体是由氨基酸序列如seq id no.1所示的羰基还原酶第138位丙氨酸突变为亮氨酸，且第190位丙氨酸突变为缬氨酸，且第193位丝氨酸突变为丙氨酸，且第201位酪氨酸突变为苯丙氨酸，且第204位天冬酰胺突变为丙氨酸获得的具有叠加效应的组合突变体mut-a138l a190v s193a y201f n204a。
15、本发明还提供了编码上述新型羰基还原酶突变体的基因。由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
16、本发明还提供了含有上述新型羰基还原酶突变体编码基因的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，连接本发明的新型羰基还原酶突变体核苷酸序列，均应属于本发明的保护范围。所述重组载体优选以质粒pet-28a(+)为表达载体，并将所述的新型羰基还原酶突变体的编码基因连接至所述的质粒pet-28a(+)。
17、本发明还提供了含有上述新型羰基还原酶突变体编码基因的基因工程菌。将外源新型羰基还原酶突变体编码基因通过基因工程技术导入到宿主细胞构建得到基因工程菌并进行表达，以获得本发明所述的新型羰基还原酶突变体；其中，所述的宿主细胞可以是细菌、真菌、植物细胞或动物细胞，优选大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)作为表达宿主。
18、本发明还提供了上述新型羰基还原酶突变体在酶法合成手性醇中的应用。作为优选，所述应用包括：以含新型羰基还原酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎后的粗酶液或湿菌体破碎后提取的纯酶为催化剂，优选以有机溶剂为助溶剂，以(s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代-3-苯基丙酸甲酯((s)-氨基酮酯)为底物，于ph 6～8的缓冲溶液中构成反应体系，在25～40℃、200～800rpm条件下反应，将反应液分离纯化获得手性醇(2s,3r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基-3-苯基丙酸甲酯。在这里，所述助溶剂为二甲基亚砜或乙酸正丁酯，更优选地，二甲基亚砜所占反应体系体积分数为10％-20％。
19、进一步地，所述的应用还包括：添加葡萄糖脱氢酶、辅酶nadph构成酶-酶偶联辅酶再生系统，并添加葡萄糖作为辅底物。新型羰基还原酶突变体与辅酶nadph首先结合组成全酶，底物进入酶的底物结合口袋，获得nadph传递的一个[h]被还原，同时nadph失去[h]被氧化，随后氧化型nadp与酶分离，产物从活性中心释放，最后利用手性物质或酶将氧化型nadp还原成nadph重新循环利用。
20、本发明还提供了一种唯贝隆中间体的制备方法，所述方法包括：以权利要求7所述的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎后的粗酶液或湿菌体破碎后提取的纯酶为催化剂，以(s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代-3-苯基丙酸甲酯((s)-氨基酮酯)为底物，反应获得唯贝隆中间体(2s,3r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基-3-苯基丙酸甲酯。
21、本发明的有益效果：本发明提供了一系列具有高活性的新型羰基还原酶突变体，进一步提高了羰基还原酶对底物的催化活力和对底物的耐受性。相较于野生型羰基还原酶，本发明提供的新型羰基还原酶突变体mut-a138l a190v s193a y201f n204a不仅具有更好的热稳定性，且相对酶活达到了4724.66％，将其对应的基因工程菌应用于500ml催化反应体系中，不仅具有催化活性高、酶的表达量高、易于发酵等优点，还具有选择性高，反应条件温和，环境友好等优势，在催化制备维贝隆中间体(2s,3r)-氨基羟酯的过程中，产率达到99.9％以上，e.e.>99.9％，这一生产效率显著优于现有技术中的羰基还原酶kred，具有良好的开发与应用价值。
1.一种新型羰基还原酶突变体，其特征在于，是由羰基还原酶或羰基还原酶突变体第190位、第201位、第204位进行单点突变或多点联合突变获得；其中，所述羰基还原酶突变体是由羰基还原酶经下列之一的突变而得：
2.如权利要求1所述的新型羰基还原酶突变体，其特征在于，所述突变为下列之一或多种的组合：
3.如权利要求1所述的新型羰基还原酶突变体，其特征在于，是由羰基还原酶第138位丙氨酸突变为亮氨酸、且第190位丙氨酸突变为缬氨酸、且第193位丝氨酸突变为丙氨酸、且第201位酪氨酸突变为苯丙氨酸、且第204位天冬酰胺突变为丙氨酸获得的。
4.如权利要求1所述的新型羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
5.编码权利要求1～4任一所述的新型羰基还原酶突变体的基因。
6.含有权利要求5所述的编码基因的重组载体。
7.含有权利要求5所述的编码基因的基因工程菌。
8.如权利要求1～4任一所述的新型羰基还原酶突变体在酶法合成手性醇中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以含新型羰基还原酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎后的粗酶液或湿菌体破碎后提取的纯酶为催化剂，以(s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代-3-苯基丙酸甲酯((s)-氨基酮酯)为底物，反应获得手性醇(2s,3r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基-3-苯基丙酸甲酯。
10.一种唯贝隆中间体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求7所述的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎后的粗酶液或湿菌体破碎后提取的纯酶为催化剂，以(s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代-3-苯基丙酸甲酯((s)-氨基酮酯)为底物，反应获得唯贝隆中间体(2s,3r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基-3-苯基丙酸甲酯。
