本发明属于生物工程领域，涉及一种降低胞苷酰转移酶基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法；具体是研究得到可降低阿卡波糖合成的胞苷酰转移酶基因acpl_8037；利用crispr/dcas9抑制基因acpl_8037的表达，可提高游动放线菌se50/110δtrey的阿卡波糖产量。
背景技术：
1、糖尿病是一种代谢性疾病，其突出特点就是高血糖。目前，2型糖尿病是最常见的糖尿病，约占糖尿病患者总数的90％以上。许多的临床研究证明，餐后血糖的合理控制能够有效减缓或减少部分心脑血管慢性并发症的发生，口服降糖药物并结合饮食结构控制与适量运动是行之有效的干预方法。
2、阿卡波糖被列为治疗2型糖尿病的一线用药，其主要是通过竞争性抑制，降低小肠内的葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶等的活性，减缓多糖类物质分解形成葡萄糖的过程，从而有效降低餐后血糖。单独服用本类药物通常不会发生低血糖等副作用，同时由于阿卡波糖不仅可以降低血糖水平，还具有减小血糖波动、调节体脂代谢和预防心血管疾病等功效，因此，自上市以来便成为治疗2型糖尿病的理想药物。
3、阿卡波糖主要由放线菌产生，游动放线菌se50及其基因工程改造后的高产菌株se50/110都是非常重要的阿卡波糖产生菌。尽管如此，随着2型糖尿病患者的日益剧增，菌株的阿卡波糖产量无法满足其巨大的市场需求，提高菌株的阿卡波糖产量至关重要。目前阿卡波糖产量的优化改造大部分集中于菌株发酵过程的优化、发酵菌株的诱变育种及阿卡波糖次级代谢途径改造。而不同于其他次级代谢产物的合成，阿卡波糖的生物合成与细胞生长紧密偶联，指向阿卡波糖生物合成“源头”的初级代谢无疑是下一步高产改造的重要聚焦点。在本研究中，围绕着细胞生长、细胞初级代谢网络与阿卡波糖的紧密联系，搭建了游动放线菌se50/110的全基因组代谢网络模型，并基于代谢模型借助计算机辅助优化算法，挖掘到了游动放线菌se50/110初级代谢相关的胞苷酰转移酶基因acpl_8037，抑制该基因的表达，有利于阿卡波糖的产量提升。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种降低胞苷酰转移酶基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过游动放线菌全基因组尺度代谢模型结合计算机辅助菌株优化算法，预测得到了可降低阿卡波糖合成的胞苷酰转移酶基因acpl_8037。利用crispr/dcas9抑制基因acpl_8037的表达，从而提高游动放线菌se50/110δtrey的阿卡波糖产量。
2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、本发明涉及一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，在游动放线菌中抑制序列如seqid no.1所示的胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达，获得阿卡波糖高产菌株。该菌株发酵得阿卡波糖。
4、作为本发明的一个实施方案，在所述游动放线菌中基于crispr/dcas9抑制所述胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达。
5、作为本发明的一个实施方案，所述游动放线菌包括游动放线菌se50，游动放线菌se50/110，或游动放线菌se50/110中trey基因失活形成的突变株，记为游动放线菌se50/110δtrey。trey基因的敲除是为了减少阿卡波糖副产物c组分的积累。
6、作为本发明的一个实施方案，在游动放线菌中抑制表达胞苷酰转移酶基因acpl_8037，包括如下步骤：
7、s1，设计并构建用于抑制胞苷酰转移酶基因acpl_8037表达的整合型质粒i；
8、s2，通过接合转移将整合型质粒i导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并提取基因组dna通过pcr扩增产物片段大小的差异，筛选得到基因抑制表达突变株。
9、作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒i的具体构建方法是，选取基因acpl_8037反义链的20核苷酸为sgrna的特异性靶向序列，以包含该sgrna序列的上游引物通过pcr扩增得到靶向该基因的sgrna盒，随后通过吉布森的方式组装入经spei/ecori双酶切的质粒pset-dcas9-actii4-nt-s1中。
10、作为本发明的一个实施方案，基因acpl_8037反义链的20核苷酸为acpl_8037反义链上游第49～68核苷酸。
11、作为本发明的一个实施方案，使用引物dcas9grna-8037-r/f，通过pcr扩增得到靶向acpl_8037反义链上游第49～68核苷酸的sgrna盒。
12、作为本发明的一个实施方案，受体菌株为游动放线菌se50/110δtrey，所述基因抑制表达突变株记为se50/110δtrey::pset-dcas9-8037。
13、作为本发明的一个实施方案，所述阿卡波糖高产菌株的发酵包含下列步骤：基因抑制表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养30～36小时；按照10％～15％的接种量转接至二级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养24～28小时；按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养70～76小时后收取发酵液。作为具体示例，将不包含sgrna盒的敲低载体整合菌株与基因抑制表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养32小时；按照10％的接种量转接至二级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养24小时；按照15％的接种量转接至发酵培养基中于30℃、220rpm的转速下培养72小时后收取发酵液。
14、作为本发明的一个实施方案，所述固体培养基含有质量体积比为3％～5％的蔗糖、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.5％～1％的酪蛋白水解物、0.1％～0.5％的磷酸氢二钾、0.05％～0.1％的氯化钾和0.005％～0.01％的硫酸亚铁。作为具体示例，所述固体培养基含有质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁。
15、作为本发明的一个实施方案，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％～2％的葡萄糖、1％～2％的麦芽糖、1％～2％的麦芽提取物、1％～2％的甘油、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.1％～0.2％的磷酸氢二钾和0.1％～0.2％的酪蛋白水解物。作为具体示例，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％的葡萄糖、1％的麦芽糖、1％的麦芽提取物、1％的甘油、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的磷酸氢二钾和0.1％的酪蛋白水解物。
16、作为本发明的一个实施方案，所述二级种子培养基含有质量体积比为4％～5％的黄豆饼粉、1％～2％的麦芽糖、1％～2％的葡萄糖、1％～2％的甘油、1％～2％的可溶性淀粉和0.25％～0.5％的碳酸钙。作为具体示例，所述二级种子培养基含有质量体积比为4％的黄豆饼粉、1.5％的麦芽糖、1％的葡萄糖、1％的甘油、1％的可溶性淀粉和0.25％的碳酸钙。
17、作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基含有质量体积比为5％～10％的麦芽糖、1％～5％的葡萄糖、0.1％～0.5％的谷氨酸、0.1％～0.5％的磷酸氢二钾、0.05％～0.1％的氯化铁、1％～5％的黄豆饼粉、0.1～0.3％的安琪牌酵母粉和0.1％～0.5％的碳酸钙。作为具体示例，所述发酵培养基含有质量体积比为5％的麦芽糖、3％的葡萄糖、0.3％的谷氨酸、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化铁、1％的黄豆饼粉、0.3％的安琪牌酵母粉和0.25％的碳酸钙。
18、本发明还涉及一株阿卡波糖高产菌株，是在游动放线菌中抑制序列如seq idno.1所示的胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达，获得所述阿卡波糖高产菌株。
19、作为本发明的一个实施方案，所述游动放线菌包括游动放线菌se50，游动放线菌se50/110，或游动放线菌se50/110中trey基因失活形成的突变株，记为游动放线菌se50/110δtrey。
20、本发明具有如下有益效果：
21、1)通过在游动放线菌中基于crispr/dcas9抑制胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达，提高游动放线菌的阿卡波糖产量；
22、2)本发明中通过在游动放线菌se50/110δtrey中抑制胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达，得到阿卡波糖高产菌株；与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株(se50/110δtrey::pset-dcas9-8037)，发酵产量提高了29.0％，实验室摇瓶三天发酵水平达到2.05g/l。
1.一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中抑制序列如seqid no.1所示的胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达，获得阿卡波糖高产菌株。
2.根据权利要求1所述提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在所述游动放线菌中基于crispr/dcas9抑制所述胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达。
3.根据权利要求1所述提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述游动放线菌包括游动放线菌se50，游动放线菌se50/110，或游动放线菌se50/110中trey基因失活形成的突变株，记为游动放线菌se50/110δtrey。
4.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中抑制表达胞苷酰转移酶基因acpl_8037，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒i的具体构建方法是，选取基因acpl_8037反义链的20核苷酸为sgrna的特异性靶向序列；以包含该sgrna序列的上游引物通过pcr扩增得到靶向该基因的sgrna盒，随后通过吉布森的方式组装入经spei/ecori双酶切的质粒pset-dcas9-actii4-nt-s1中。
6.根据权利要求5所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，基因acpl_8037反义链的20核苷酸为acpl_8037反义链上游第49～68核苷酸。
7.根据权利要求5所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，pcr扩增用上游引物dcas9grna-8037-r，其序列为：cagctagctcagtcctaggtataatactagtcggagacccgcc cccgccgcgttttagagctagaaatagcaagtt；下游引物dcas9grna-8037-f，其序列为caggaaacagctatgacatgattac。
8.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述阿卡波糖高产菌株的发酵，包含下列步骤：将基因抑制表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养30～36小时；按照10％～15％的接种量转接至二级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养24～28小时；按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养70～76小时后收取发酵液。
9.一株阿卡波糖高产菌株，其特征在于，在游动放线菌中抑制序列如seq id no.1所示的胞苷酰转移酶基因acpl_8037的表达，获得所述阿卡波糖高产菌株。
10.根据权利要求9所述的阿卡波糖高产菌株，其特征在于，所述游动放线菌包括游动放线菌se50，游动放线菌se50/110，或游动放线菌se50/110中trey基因失活形成的突变株，记为游动放线菌se50/110δtrey。
