本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一株高产玉米黄质的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
1、玉米黄质是一种橙黄色含氧烯萜类化合物，属于类胡萝卜素，属于四萜的含氧衍生物。玉米黄质具有较强的抗氧化性，对一些如老年黄斑变性、白内障以及肿瘤之类的疾病有预防作用，广泛应用于医药、化妆品、动物饲料和食品染色剂等领域。玉米黄质的主要合成方法包括植物提取法、化学合成法以及生物合成法3种，植物提取法和化学合成法存在成本较高，环境污染等问题。近几年，随着合成生物学技术的不断成熟，以微生物发酵合成玉米黄质成为营养化学品的热点研究领域。
2、鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)种质资源丰富，在地球上分布广泛，并且该菌属某些菌种可以降解具有毒性的芳香化合物，或合成具有重要工业应用价值的胞外多糖。鞘氨醇单胞菌生长迅速，培养条件易于控制，能够利用生物反应器实现大规模的培养，是工业发酵的优良宿主。通过对sphingomonas sp.的全基因组测序结果分析，发现了合成萜烯化合物前体的mep途径基因和下游合成类胡萝卜素的基因，具有萜烯化合物的合成途径。因此，以鞘氨醇单胞菌作为宿主合成萜烯化合物具有潜在的应用价值，有研究报道在鞘氨醇单胞菌中实现玉米黄质和胞外多糖的联产，但是发酵液粘稠，下游分离困难。目前未见鞘氨醇单胞菌单独生产玉米黄质的研究报道。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株产玉米黄质的基因工程菌。
2、本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的制备方法。
3、本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的应用。
4、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
5、一株产玉米黄质的基因工程菌，是以鞘氨醇单胞菌sphingomonas sp.ht-1为出发菌株，通过敲除葡萄糖磷酸异戊二烯转移酶welb基因和β-胡萝卜素2’羟化酶crtg基因，异源表达含有启动子pwelk的1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶dxs基因、ipp异构酶idi基因和β-胡萝卜素3’羟化酶crtz基因得到的。
6、其中，所述的1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶dxs基因和ipp异构酶idi基因为mep途径关键基因，来源包括但不限于大肠杆菌e.coli，在本发明实施例中，具体来源于大肠杆菌e.coli mg1655。
7、其中，所述的β-胡萝卜素3’羟化酶crtz基因为玉米黄质合成限速基因，来源包括但不限于噬夏孢欧文氏菌erwinia uredovora。
8、其中，所述的鞘氨醇单胞菌sphingomonas sp.ht-1，已于2021年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2012062，该菌株的详细信息已公开在专利cn102618468a中。(注：根据刘辉，韦璐璐，朱龙发等人2023年发表于《微生物学通报》的《鞘氨醇单胞菌的研究进展》，现将产碱杆菌alcaligenes sp.ht-1归类到了鞘氨醇单胞菌中，所以拉丁学名由alcaligenes sp.修改为sphingomonas sp.。)
9、其中，所述的welb基因，其核苷酸序列通过ncbi查询得到，具体序列号为genebank：wp_050990222.1；所述的crtg基因，其核苷酸序列通过ncbi查询得到，具体序列号为genebank：wp_019370940.1。
10、其中，所述的welb基因，其上下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.1～2所示；所述的crtg基因，其上下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.3～4所示。
11、其中，所述的启动子pwelk，其核苷酸序列如seq id no.5所示；所述的dxs基因、idi基因和crtz基因，其对应的核苷酸序列如seq id no.6～8所示。
12、本发明还提供了所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
13、(1)分别扩增welb基因和crtg基因片段的上下游同源臂，并将各自的上下游同源臂连接起来，得到welb基因上下游同源臂连接片段和crtg基因上下游同源臂连接片段；将得到的连接片段再分别克隆至自杀质粒中，得到重组自杀质粒-△welb，重组自杀质粒-△crtg；
14、(2)将步骤(1)的重组自杀质粒-△welb转化至鞘氨醇单胞菌sphingomonassp.ht-1感受态细胞中，构建得到基因工程菌△welb；
15、(3)将步骤(1)的重组自杀质粒-△crtg转化至步骤(2)的基因工程菌△welb中，构建得到基因工程菌△welb-△crtg；
16、(4)分别扩增含有启动子pwelk的dxs基因、idi基因和crtz基因片段得到三种基因的扩增产物，将三种扩增产物连接得到片段pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz；再将得到的片段pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz克隆至穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒-pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz；
17、(5)将步骤(4)的重组穿梭质粒-pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz转化至步骤(3)的基因工程菌△welb-△crtg中，最终得到产玉米黄质的基因工程菌△welb-△crtg/-pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz。
18、其中，步骤(1)中所述的自杀质粒包括pjq200sk、p0j260、pdm4、pre112中的任意一种，或其他具有相同功能的质粒。在本发明实施例中，所述的自杀质粒为pjq200sk。
19、其中，步骤(4)中，所述的穿梭质粒pbbr1mcs2、pbbr1mcs-5中的任意一种，或其他具有相同功能的质粒。在本发明实施例中，所述的穿梭质粒为pbbr1mcs2。
20、上述基因工程菌在发酵生产玉米黄质中的应用也在本发明所保护的范围之内。
21、具体的，将基因工程菌△welb-△crtg/-pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz活化后的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养产玉米黄质，当碳源浓度低于5g/l时，流加补料，控制果糖浓度在5～15g/l。
22、其中，所述的种子液，具体制备过程如下：挑取基因工程菌△welb-△crtg/-pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz的单克隆到lb培养基中，加入终浓度为50mg/l的卡那霉素，26～32℃培养14～18h，获得种子液。
23、其中，所述的接种，其接种量为5～10％v/v。
24、其中，所述的发酵培养，其培养条件为：转速200～800rpm，溶氧10～30％，温度26～30℃，通气量0.8～1.5vvm，ph 6.0～8.0。
25、其中，所述的补料为300～500g/l碳源和30～50g/l氮源，其流加速率为5～15ml/h。
26、其中，所述的发酵，其总的发酵时间72～120h。
27、其中，所述的发酵培养基，其组成成分包括20～60g/l碳源、2～15g/l氮源、0.01～15g/l无机盐、以体积比计0.1％～1％的表面活性剂。
28、其中，所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、甘油、菊糖、乳糖中的任意一种或几种的组合；所述的氮源包括胰蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、尿素、鱼粉蛋白胨、豆粕粉、牛肉浸膏、磷酸氢二铵、氯化铵、硫酸铵、柠檬氢二铵中的任意一种或几种的组合；所述的无机盐包括kh2po4、k2hpo4、mgso4、feso4、柠檬酸、醋酸钠中的任意一种或几种的组合；所述的表面活性剂包括吐温-20、吐温-80、司班-20、司班-80、曲拉通-100、二甲基亚砜、大豆油、橄榄油、花生油中的任意一种或几种的组合。
29、在本发明实施例中，所述的发酵培养基为：果糖30g/l，硫酸铵4g/l，硫酸镁0.585g/l，磷酸二氢钾13.3g/l，柠檬酸1.7g/l，七水和硫酸亚铁0.03g/l，吐温-80 0.2％，1000*trace(微量元素溶液)1ml/l。
30、其中，1000*trace：cocl2·6h2o 250mg/l、cucl2·2h2o 150mg/l、h3bo3 300mg/l、namoo4·2h2o 250mg/l、zn(ch3coo)2·2h2o 800mg/l、edta840mg/l、fe(iii)citrate6000mg/l、mncl2·2h2o 1230mg/l。
31、有益效果：
32、本发明通过自杀质粒pjq200sk介导的同源重组策略敲除鞘氨醇单胞基因组中的welb和crtg，首先得到了一株工程菌株△welb-△crtg，使得该工程菌株不产胞外多糖，且阻断了玉米黄质的下游氧化途径，利于产物积累。并在此工程菌株的基础上，本发明又通过穿梭质粒pbbr1mcs2外源表达不同来源的mep途径关键基因idi，dxs和玉米黄质合成限速酶基因crtz。筛选出了来自的大肠杆菌mg1655的idi和dxs基因以及来自噬夏孢欧文氏菌erwinia uredovora的crtz基因，构建了高产玉米黄质的鞘氨醇单胞菌，该工程菌株在发酵培养基优化后的玉米黄质产量可以达到71.4mg/l，该工程菌株5l发酵罐中玉米黄质产量可以达到215.4mg/l。本发明所构建的鞘氨醇单胞菌，合成的玉米黄质较为单一且易于提取，具有较好的应用前景。
1.一株产玉米黄质的基因工程菌，其特征在于，是以鞘氨醇单胞菌sphingomonassp.ht-1为出发菌株，通过敲除葡萄糖磷酸异戊二烯转移酶welb基因和β-胡萝卜素2’羟化酶crtg基因，异源表达含有启动子pwelk的1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶dxs基因、ipp异构酶idi基因和β-胡萝卜素3’羟化酶crtz基因得到的。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的鞘氨醇单胞菌sphingomonassp.ht-1，已于2021年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m 2012062。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的welb基因，其上下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.1～2所示；所述的crtg基因，其上下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.3～4所示。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的启动子pwelk，其核苷酸序列如seq id no.5所示；所述的dxs基因、idi基因和crtz基因，其对应的核苷酸序列如seq idno.6～8所示。
5.权利要求1～4任意一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.权利要求1～4任意一项所述的基因工程菌在发酵生产玉米黄质中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将基因工程菌△welb-△crtg/-pwelk-dxs-pwelk-idi-pwelk-crtz活化后的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养产玉米黄质，当残糖浓度低于5g/l时，流加补料，控制残糖浓度在5～15g/l。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养，其培养条件为：转速200～800rpm，溶氧10～30％，温度26～30℃，通气量0.8～1.5vvm，ph 6.0～8.0；所述的补料为300～500g/l碳源和30～50g/l氮源，其流加速率为5～15ml/h；所述的发酵，其总的发酵时间72～120h。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基，其组成成分包括20～60g/l碳源、2～15g/l氮源、0.01～15g/l无机盐、以体积比计0.1％～1％的表面活性剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、甘油、菊糖、乳糖中的任意一种或几种的组合；所述的氮源包括胰蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、尿素、鱼粉蛋白胨、豆粕粉、牛肉浸膏、磷酸氢二铵、氯化铵、硫酸铵、柠檬氢二铵中的任意一种或几种的组合；所述的无机盐包括kh2po4、k2hpo4、mgso4、feso4、柠檬酸、醋酸钠中的任意一种或几种的组合；所述的表面活性剂包括吐温-20、吐温-80、司班-20、司班-80、曲拉通-100、二甲基亚砜、大豆油、橄榄油、花生油中的任意一种或几种的组合。
