一种基于EHDV核心样颗粒的阻断ELISA抗体检测试剂盒、制备方法及应用与流程

一种基于ehdv核心样颗粒的阻断elisa抗体检测试剂盒、制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体地，涉及一种鹿流行性出血热病毒阻断elisa抗体检测试剂盒、制备方法及其应用。


背景技术：

2.鹿流行性出血热(epizootic hemorrhagic disease virus，ehd)是由呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(orbivirus)的鹿流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus，ehdv)感染引起的鹿、山羊、牛等多种野生和家养反刍动物的虫媒性传染病。ehd主要分布在热带、亚热带和温带地区，但随着全球气候逐渐变暖，其传播媒介——雌性库蠓(culicoides spp.)活动范围不断扩大，该病影响范围相应扩大逐渐呈全球分布的趋势。为此，世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告动物疫病。ehd主要侵害鹿、山羊、牛等多种野生和家养反刍动物，其暴发给可给畜牧业带来严重的经济损失。我国近年来的血清学调查发现，云南、新疆、内蒙古、广西和广东等地均存在ehdv阳性畜群，其中特别需要注意是检出阳性样品中存在对牛有较强致病力的ehdv
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2，6和7型。2013～2017年期间，云南畜牧兽医科学院先后在我国云南、广西和广东等地分离到ehdv
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1、ehdv
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5、ehdv
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6、ehdv
‑
7与ehdv
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10等5种血清型；进一步的对我国15个省份的牛羊血清学调查结果显示，有13个省份的牛群中普遍存在ehdv抗体阳性动物，且阳性率呈现由北向南逐渐升高的趋势。这些研究表明ehdv在我国分布广泛，存在暴发并可能对我国反刍动物养殖业造成重大影响的风险，有必要开展ehd诊断试剂的研究开发。
3.目前ehdv血清学检测方法主要为血清中和试验、间接elisa和竞争elisa方法等方法。其中elisa方法多数以全病毒或单个原核或真核表达的重组蛋白为包被抗原，前者存在扩散病毒的风险，后者不能完全展示抗原表位；而ehdv clps作为一种类似病毒的由ehdv vp3和vp7蛋白组装形成的空心颗粒，不含病毒核酸基因组，不具感染性，由于具有近似病毒结构和形态，可充分展示抗原表位。
4.有鉴于此，提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的是寻求一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测鹿流行性出血热病毒抗体的方法；
6.本发明的第二目的是寻求一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测鹿流行性出血热病毒抗体的阻断elisa试剂盒。该试剂盒的优点之一是使用了ehdv clps作为包被抗原，提高了检测的敏感性和特异性。
7.基于上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.本发明首先提供一种ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒的制备方法，包括：
9.1)酶标板制备步骤：将ehdv clps包被到酶标板；
10.2)酶标抗体制备步骤：用辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗ehdv vp7蛋白的群特异性单克隆抗体作为酶标抗体；
11.在一些实施方式中，所述步骤1)为将ehdv clps用0.1
‑
0.2m的tris盐酸包被液稀释至1
‑
1.5μg/ml，4
‑
6℃包被12
‑
16h，洗涤后加入含1
‑
3％bsa的封闭液封闭；
12.在一些优选的实施方式中，将ehdv clps用0.2m ph8.0的tris盐酸包被液稀释至1
‑
1.5μg/ml，4℃包被12
‑
16h，洗涤后加入含3％bsa的封闭液，37℃封闭，洗涤后保存。
13.在一些更优选的实施方式中，将所述ehdv clps用0.2m ph8.0的tris盐酸包被液稀释至1.25μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被12h，洗涤后加入200μl含3％bsa的封闭液，37℃封闭2h，洗涤后保存。
14.在一些实施方式中，所述酶标抗体工作浓度稀释为1:6000
‑
1:8000，更优选的为1:6000。
15.在一些实施方式中，所述方法还包括：3)显色剂、终止液及阴阳性对照的组装步骤；优选的，所述显色剂和终止液为0.1mg/ml的四甲基联苯胺(tmd)显色液和2m硫酸溶液终止液；所述阳性对照和阴性对照分别为：所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的ehdv阳性的牛血清；所述阴性对照为无ehdv且无疫苗接种的健康牛血清。
16.本发明还提供一种ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒，所述试剂盒由上述方法制备。或，所述试剂盒包括酶标板和酶标抗体；其中，所述酶标板包被有ehdv clps，所述酶标抗体为用辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗ehdv vp7蛋白的群特异性单克隆抗体。
17.在一些实施方式中，所述ehdv clps为ehdv vp3和vp7蛋白组装形成的空心颗粒；优选的，vp3和vp7蛋白序列如seq id no.1和2所示。
18.在一些实施方式中，所述酶标抗体工作浓度稀释为1:6000。
19.在一些优选的实施方式中，所述酶标板的制备方法包括：将所述ehdv clps用0.1
‑
0.2m的tris盐酸包被液稀释至1
‑
1.5μg/ml，4
‑
6℃包被12
‑
16h，洗涤后1
‑
3％bsa的封闭液封闭
20.在一些更优选的实施方式中，所述酶标板的具体制备方法包括：将所述ehdv clps用0.2m ph8.0的tris盐酸包被液稀释至1
‑
1.5μg/ml(优选为1.25μg/ml)，每孔加入100μl，4℃包被12
‑
16h，洗涤后加入200μl含3％bsa的封闭液，37℃封闭2
‑
4h，洗涤后保存。
21.在一些实施方式中，所述试剂盒还包括0.1mg/ml的四甲基联苯胺(tmd)显色液和2m硫酸溶液终止液；所示试剂盒还包括阳性对照和阴性对照：所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的ehdv阳性的牛血清；所述阴性对照为无ehdv且无疫苗接种的健康牛血清。
22.本发明还提供一种上述ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒，或上述的ehdv clps在制备检测ehdv感染或疫苗接种的待测样品的产品中的应用。
23.在一些实施方式中，所述检测为：在每孔加入100μl以pbst稀释的待检血清，稀释比例为1:5
‑
1:10，37℃孵育60
‑
90min；pbst洗涤后加入1：6000稀释的hrp标记的抗ehdv vp7单克隆抗体，37℃孵育30
‑
45min；加入tmb底物孵育后加入终止液h2so4终止反应，酶标仪读取od450值，计算阻断率pi值；
24.在一些实施方式中，所述检测具体为：在每孔加入100μl以pbst稀释的待检血清(稀释比例为1:5)，37℃孵育90min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl 1：6000稀释的hrp标记的抗ehdv vp7单克隆抗体，37℃孵育45min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl tmb底物，室温避光
孵育10min，每孔加入终止液50μl 2m h2so4终止反应，酶标仪读取od
450
值，计算阻断率pi值；
25.在一些优选的实施方式中，当阻断率pi≥24.36％时判定为阳性；pi≤19.74％时判定为阴性；19.74％＜pi＜24.36％时判定为可疑，需重复检测1次，如果仍低于24.36％则判为血清抗体阴性。
26.在一些优选的实施方式中，所述待检血清为感染野毒株或应用过普通的ehdv弱毒疫苗、灭活疫苗或应用过非ehdv vp7缺失疫苗的反刍动物血清。
27.本发明还提供一种基于鹿流行性出血热病毒核心样颗粒的阻断elisa的检测方法，包括以下步骤：
28.(1)包被缓冲液为0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液，以前述包被液稀释鹿流行性出血热病毒核心样颗粒至1
‑
1.5μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被12
‑
16h，pbst洗涤3次；
29.(2)每孔加入200μl含3％bsa的封闭液，37℃封闭2
‑
4h，pbst洗涤3次；
30.(3)将待检血清按照1:5的比例进行稀释后，100μl/孔，设置标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，37℃孵育1
‑
1.5h，pbst洗洗涤3次；
31.(4)将hrp标记的ehdv vp7群特异性单克隆抗体进行1：6000稀释后，100μl/孔，37℃孵育45min，pbst洗3次；
32.(5)每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育10min，每孔加入终止液50μl 2m h2so4终止反应。
33.(6)酶标仪读取od
450
值，计算阻断率pi值。
34.(7)判定标准为：当阻断率pi≥24.36％时判定为阳性；pi≤19.74％时判定为阴性；19.74％＜pi＜24.36％时判定为可疑，需重复检测1次，如果仍低于24.36％则判为血清抗体阴性。
35.在一些实施方式中，上述提及的ehdv clps为ehdv vp3和vp7蛋白组装形成的空心颗粒；
36.在一些优选的实施方式中，所述ehdv clps具体是通过seq id no.1所示的vp3和seq id no.2所示的vp7经重组表达制备。
37.在一些更优选的实施方式中，所述制备为将ehdv vp3基因和vp7基因依次插入至载体pfastbac
tm dual，构建重组质粒pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
vp7，重组质粒转染sf9细胞；收集sf9细胞，用不连续蔗糖密度梯度超速离心进行纯化。
38.相比于现有技术，本发明至少具有如下有益技术效果：
39.(1)本发明提供了一种鹿流行性出血热病毒抗体检测的elisa试剂盒。该试剂盒是利用ehdv clps作为包被抗原，ehdv clps为一种类似病毒的由ehdv vp3和vp7蛋白组装形成的空心颗粒，不含病毒核酸基因组，不具感染性，相较于以全病毒或灭活病毒作为包被抗原，最大程度地避免了病毒扩散的风险。
40.(2)本发明由于核心样颗粒保持着与真病毒类似的形态，且每一个核心样颗粒由780个vp7蛋白与120个vp3蛋白构成，780个vp7蛋白形成的亚单位类似于一件毛刷外衣位于核心样颗粒的外层，因此与以通过原核表达或真核表达获得的ehdv vp7蛋白作为包被抗原相比，核心样颗粒能够更多更好地展示vp7蛋白的抗原表位，从而进一步提升检测的敏感性和特异性。
41.(3)本发明以酶标的ehdv vp7蛋白的群特异性单克隆抗体作为阻断酶标抗体，进
一步提高了检测的敏感性和特异性。
42.(4)本发明在确立以ehdv clps和vp7蛋白的群特异性单克隆抗体制备检测体系后，通过优化试验对包被液、抗体浓度、clps与抗体的浓度关系、封闭液、待检血清的最佳稀释度、最佳孵育时间、最佳显色时间等进行系统优化选择，最终确立一套最佳酶标板制备方法、最佳检测方法，并基于制备成相应的试剂盒等。
43.(5)敏感性试验结果显示，本发明的试剂盒可检出1:1280倍稀释的阳性血清，敏感性达98.3％；特异性试验结果显示，与目前常见的反刍动物病原如蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病病毒、水泡性口炎病毒、小反刍兽疫病毒、羊痘病毒等均不发生交叉反应，特异性100％。
44.综上所述，本试剂盒采用ehdv clps作为包被抗原和以针对ehdv vp7蛋白群特异性单克隆抗体作为阻断酶标抗体构建的阻断elisa抗体检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地检测样品中ehdv的特异性抗体的含量，与进口试剂盒符合率达99％以上，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
附图说明
45.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
46.图1重组质粒pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
vp7结构图；
47.图2重组杆状病毒质粒bacmid
‑
vp3
‑
vp7转染sf9细胞后病变图；
48.图3 sds
‑
page和western blot结果图；
49.a：sds
‑
page结果；b：western blot结果(ehdv绵羊阳性血清)；
50.(1：蔗糖梯度离心收集的底层蛋白；2：蔗糖梯度离心收集的夹层蛋白；3：重组杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
vp7感染的sf9细胞总蛋白；4：野生杆状病毒感染的sf9细胞对照；m：蛋白marker)。
51.图4 ehdv核心样颗粒透射电镜检测图；
52.图5以各种包被液稀释后的ehdv核心样颗粒透射电镜检测图；
53.a:以0.05m ph9.6的碳酸氢盐缓冲液为包被液稀释后的透射电镜结果；
54.b:以0.2m ph7.4的磷酸氢盐缓冲液为包被液稀释后的透射电镜结果；
55.c:以0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液为包被液稀释后的透射电镜结果；
56.d:以0.1m ph8.0 tris盐酸缓冲液为包被液稀释后的透射电镜结果。
具体实施方式
57.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
58.以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
59.除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
60.如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
61.在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
62.本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
63.此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
64.如下实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和伦理道德可获取的生物材料都可按照实施例中的提示替换使用。
65.实例1 ehdv核心样颗粒的制备与纯化
66.(1)重组杆状病毒质粒bacmid
‑
vp3
‑
vp7的构建
67.通过亚克隆，将ehdv vp3基因(seq id no.1)和vp7基因(seq id no.2)依次插入至载体pfastbac
tm dual，构建重组质粒pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
vp7，其结构见图1。将测序正确的重组质粒pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
vp7转化入dh10bac，通过蓝白斑、菌落pcr进行筛选，获得重组杆状病毒质粒bacmid
‑
vp3
‑
vp7。
68.所述seq id no.1如下：
69.atggcagatccaccagatgcaaatgcaccaaaaacgagtccgtatctaaaaggagatgagttatcaagtgacagtggacctttgctttcaatcttcgctctacaagagattatgcaaaaggtgcgacaagcgcaatcggagtatgttgcagcaactaaagatgtcgatctaacggtaccggatgttcaaaaaataatcgatggagttaaagagctggcctcagagacgatctataaaattgtacagaaacccatcatctcgtataggcatgtggtgatgcaatcaagggatagatttctccgggtggacacctattatgaaaggatgtctgaagttggcgataagatagatgagaatgaacccgcgaaattttatgagactataatcaagaaagtaaggcatttacgtaccgagggagcctttatcttacataacatacccacaaaggatcatagaggcatggaaatagcggatcctgagatcctgggcgtcgatgtcaaaagcatattaccggtgctaacggctgagcatagagcgatgatacagcatgttctagatggcgctataatagagaacggtaatatagcgacccgtgatgtcgatgtgtatttgggtgcttgttcagaatcagtgtatcgcatatacaatcgattacaaggatatatcgaggccgttcaattggaagagttgcgcgcagcggtgacatggctcgagcgtctggggaaacgaaaacgcatgactttttcacaagaatttctaacagatt tcagacgtgcagatacggtttgggtactggcgttgaggctgccagccaacccacgcgtgatttgggatgtaccgaggtgctcaatcgcgaatctaataatgaatatagcgacgtgcttaccgacaggagagtatgtttcacccaatcctcgcatagcttcaatcacactgacgcaaagaattactacaactggaccatttgctatattaacgg
gatcgacgccaacggcacaacaattagatgacgttagaaagatatacttagcgttaatgtttccaggacaaataattttagatttaaaaatagatccgggtgaaagaatggacccagctgtacggatggtggcaggagttgttgggcatttaatgtttacagcaggcccacgatttacgaacataactcaaaacatggcaaggcagctagatatcgcactggccgattttttattatatatgtataataccagaatccaagttcagtatggaccgactggagaatccttagattttagaattggtcgtggacagtatgattgtaacgtatttcgcgccaactttcaaacgggtacgggatataatggttggggtttagttgatgttgaaaacagggaaccagcgccctatgatcatgcacaacggtatatacgatattgcaatatagactcacgagaactgatacatccagccacatttggtattggtatgaattaccattgttataatgaaatgttgaggatgttagttgctgcgggtaaggacacagaagctgcatttttccggaatatgttaccgtttcatatggtccgatttgctcgtataaatcaggtaataaatgaagatttacactcagctttctcgatgccagatgatcagtttaacgtgttattagcgaatatgatggtaggccagcaagaaaggattgacccggtgatattggatataagttggatctcaatttggtacgctttcaatagatcttttgagccgatccgtcgaaacgaaatgctggaaagtgcgccgctaatcgagtcggtctatgcctcagaattgacagttatgaagacggatatgcagcagatggccctattacagcgccgtttcccagatgttttaattgaagcccgtcccacgcatttctggaaagctgttatggaggtatcaccagagcctgtacgagcgatcatggatttagcgcattcacatagctttatcaacatccgagatatgatgaggtggataggtttgccttcgatgcagaattccatgaagttggtgctagaagaagaagcttgggcggtggctaatgatttcgaagaattgatgctgactgatcaggtgtatatgtaccgtgatatgcttccggaaccaaggttagatgatatagagagattcaggcaagagggattctactacactaatatgttggatgggccgcctgcgatcgatcgagtggttcaatatacgtatgaggtggcacgattacaggcaaatatgggacaactacgagcggcgttacggaggattatggatgacgaaggatgggttagattcggaggtgtactacgaactgtacggattaaattcttcgactcacgtccacccgaagaaatccttcaagcattaccttttgattaccagacaaatgagaagggcggattgacttatgccacaatcaaatatgcgaatgataccacaatatattatttaatctataatgttgagtattcaaatttacctgattccttagttttaatcaatcctacttatgtgatgaccaaagtttttataaataaacgaatagtagagagggttcgagtgggacaagcgttggccgtaatgaataaaagatttatagcatttaaaggaaagatgcgaattatggatataacgcaagcgctcaaggtgggcaccaagctagcggcgccgaccgtgtag。
70.所述seq id no.2如下：
71.atggacacgattgctgcgagagctctaacagtgatcaaagcttgtaacactctaaaagaggtaagaattgtagtggagtccaatgtcttggagatattagggacagcagttaatagatataacggattgactctaagatcagttacgatgcgaccaacttcgcaggaacaacggaatgaaatgttctatatgtgtctagatatgatattagcagcagcaaatctaaatgtaggaaatatttcccctgattacatacaaaatttggcaacgatcggggtgttggcgacgccagaaataccatata cgatggaatccgcgaacgaaattgctcgaatgagcggggagacaggaacctgggggccggatcgtcaacctttcggctattttttggcagcgccagaagttacccaacatgggcggttcagacagcgagttggccagaatgttactacatcaatcgtatcctcgactttagctcaggtttcaatgaatgctggggcacggggtgatatccaggcgctatttcaaaatcaaaatgatcctgtaatgatttactttgtgtggagacgaattgggactttttcgaatgcagcgggtaatgcacaagatacacctcagggcgtgactctgaacgtggggggtgtaaacatgagggctggtgtgataatagcttatgatgggcaagcgccggttaatgtgaataacccaggtctaggacaaggtatgatcgagattgaagtgatctattatttgagtttagacaaaaccatgacccagtatccatcattacaagcacatatattcaatgtttactcatataagaatcctttgtggcatggactacgagctgcgattcttaacagaacaacgctaccaaacaatataccgcccatttatccgcctcatgatcgcgagaacgttttgttgataatattgctgtcagctttagcagatgcctttagcgtattggcgccagactttaacttatttggtgtagtacctatacaaggtccgattaatagggctgttgcacaaaacgcctatgtgtga。
72.(2)重组杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
vp7的获得
73.转染试剂盒将重组杆状病毒质粒bacmid
‑
vp3
‑
vp7转染sf9细胞。转染后48h～72h可以观察到明显的细胞病变：与正常sf9细胞相比，细胞数量明显变少，细胞体积变大、变圆，且发生臌胀、变得容易脱落，并有少量细胞破碎，见图2。转染后超过72h，sf9细胞出现大量破碎。
74.(3)ehdv核心样颗粒的制备与纯化
75.在28℃，130rpm条件下，大量悬浮培养sf9细胞；待细胞密度达到3～4
×
106/ml，细胞活性超过95％时，将sf9细胞稀释至1
×
106/ml继续培养；当细胞密度达到2
×
106/ml时，再次将sf9细胞稀释至1
×
106/ml，并按照低moi(0.001pfu/cell)接种重组杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
vp7，继续培养96h后收集sf9细胞。大量收取重组病毒感染的细胞，加入适量的裂解缓冲液，放置4℃过夜，反复冻融3次后，4℃，10000r/min离心10min，取上清，用不连续蔗糖密度梯度超速离心进行纯化。用tris盐酸缓冲液配置30％和60％蔗糖，依次加入24ml裂解上清液、6ml30％和6ml 60％蔗糖，于4℃，21500r/min水平转头超速离心3h。收集夹层蛋白和底部沉淀，并进行sds
‑
page及western blot验证。
76.sds
‑
page和western blot结果如图3所示，sds
‑
page结果显示在夹层蛋白和底部沉淀中均出现了两条分别为100ku和38ku左右的主要条带；western blot结果也显示在夹层蛋白和底部沉淀中均有两条大小在100ku和38ku左右的且可与ehdv阳性血清发生特异性结合的主要条带，分别与ehdv的vp3和vp7蛋白相对应。这些结果表明，通过蔗糖梯度离心收集的夹层蛋白和底部沉淀均可能存在ehdv核心样颗粒。
77.将夹层蛋白和底部沉淀稀释后，用2％磷钨酸负染液负染后，透射电镜下观察。结果如图4所示，在夹层蛋白和底部沉淀中均含有大量的密集且形态均一的中空颗粒，颗粒直径在60～70nm左右，且表面有明显的刺状突起，其形态大小与文献报道和本实验室制备获得的蓝舌病病毒核心样颗粒相似。
78.实例2基于ehdv核心样颗粒的阻断elisa方法建立
79.(1)最适包被液的确定
80.以ehdv clps为包被抗原建立elisa方法的难点在于包被过程需确保ehdv clps的形态结构不被包被液破坏。为此，本发明为确定最适合的包被液，将包被液分别设置为0.05m ph9.6的碳酸氢盐缓冲液(cb)、0.2m ph7.4的磷酸氢盐缓冲液(pbs)、0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液(tb)和0.1m ph8.0 tris盐酸缓冲液，以这些缓冲液对纯化获得的ehdv clps进行稀释，并在透射电镜下观察颗粒形态。结果(见图5)显示，以0.05m ph9.6的碳酸氢盐缓冲液(cb)为包被液进行稀释后，ehdv clps结构形态完全被破坏(图5a)；0.2m ph7.4的磷酸氢盐缓冲液(pbs)为包被液进行稀释后，同样的出现ehdv clps结构形态完全被破坏的情况(图5b)；而分别以0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液(tb)和0.1m ph8.0 tris盐酸缓冲液为包被液进行稀释后，ehdv clps结构形态保持不变(图5c和5d)。
81.为进一步确定最适包被液，以上述包被液将纯化的ehdv clps稀释至1.0μg/ml，4℃包被12h，封闭液37℃封闭2h，洗涤后加入100μl hrp标记的抗ehdv vp7特异性单克隆抗体(1:4000稀释)37℃孵育1h，洗涤后显色10min，加入终止液后,酶标仪上读取od
450
值。结果见表1，以0.05m ph9.6的碳酸氢盐缓冲液(cb)和0.2m ph7.4的磷酸氢盐缓冲液(pbs)为包被液的od
450
值均小于0.5；而0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液为包被液的od
450
值最高，大于1.5；为此，0.1
‑
0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液效果较好，优选的，确定最适的抗原包被液为
0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液。
82.表1最适包被液的确定
[0083][0084]
(2)ehdv核心样颗粒包被浓度与酶标单克隆抗体的最佳稀释倍数确定
[0085]
按照棋盘滴定法进行，将实例1纯化获得的ehdv核心样颗粒用0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释成0.25μg/ml、0.75μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml,每个浓度在酶标板中横向包被12孔，100μl/孔，4℃过夜。pbst洗涤3次后，加入封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h；pbst洗涤3次；纵向分别加入1：1000、1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:16000倍稀释的本实验制备的hrp标记的抗ehdv vp7特异性单克隆抗体，37℃孵育1h；pbst洗涤3次；加入底物tmb，100μl/孔，室温避光显色10min后，以50μl/孔加入2mol/l h2so4终止反应，用酶标仪读取各孔od
450nm
值。选择od
450
值在1.0左右的抗原浓度与酶标物稀释度为最佳工作条件。结果如表2，确定最适抗原包被浓度及酶标单抗稀释度分别为1.25
‑
2.5ug/ml和1:6000
‑
1:8000，最优选的为1.25μg/ml和1:6000。
[0086]
表2 ehdv核心样颗粒包被浓度与酶标单抗稀释度的确定
[0087][0088]
(3)最适封闭液的确定
[0089]
为确定最适封闭液，选择3种常用的封闭液分别为0.5％bsa、1％bsa、2％bsa、3％bsa、2.5％脱脂乳、5％脱脂乳、0.5％明胶、1％明胶、1％兔血清、5％兔血清、1％马血清、5％马血清进行封闭，其余步骤按照前述的操作步骤进行。试验结果见表3，3％bsa作为封闭液时，od
450
值在最接近1.0，因此确定最适封闭液为3％bsa。
[0090]
表3最适封闭液的确定
[0091][0092]
(4)待检血清的最佳稀释度确定
[0093]
按照上述优化的最适抗原包被浓度、最适包被液进行包被，最适封闭液进行4℃过夜封闭，洗涤3次后，先分别加入1：5、1：10、1：20和1：40稀释的ehdv阳性血清和阴性血清，37℃孵育45min；洗涤3次，加入最佳浓度的酶标单抗，按照上述方法加入显色液，终止液并进行读数，并计算阳性血清的阻断率(percentage inhibition，pi)，pi＝[(阴性血清od
450nm
－检测血清od
450nm
)/阴性血清od
450nm
]
×
100％)，以pi最大时作为最适的待检血清最佳稀释度。结果如表4所示，1：5
‑
1:10稀释血清效果较好，优选1:5为最佳稀释。
[0094]
表4待检血清的最佳稀释度确定
[0095][0096]
(5)待检血清的最佳孵育时间的确定
[0097]
使用上述确定的最适反应条件，分别检测ehdv阳性血清和阴性血清各1份，每份血清重复2孔，37℃分别作用30min、45min、60min、90min，其他步骤不变，计算不同作用时间阳性血清的平均pi，以pi最大的作为待检血清的最佳孵育时间。结果见表5，待检血清的最佳孵育时间为60
‑
90min，优选90min最佳。
[0098]
表5待检血清的最佳孵育时间的确定
[0099][0100]
(6)酶标单抗的最佳孵育时间的确定
[0101]
按上述最优条件，改变酶标单抗的孵育时间分别为37℃30min、45min、60min、90min，分别检测ehdv阳性血清和阴性血清，并计算不同条件下阳性血清的平均pi，以pi最大的作为酶标单抗的最佳孵育时间。结果见表6，酶标单抗的最佳孵育时间为30
‑
45min，优选45min最佳。
[0102]
表6酶标单抗的最佳孵育时间的确定
[0103][0104]
(7)最佳显色时间的确定
[0105]
按照上述最优条件检测ehdv阳性血清和阴性血清，在加入tmb显色液后，分别在显色5min、10min和15min时终止反应，计算不同条件下阳性血清的平均pi，以pi最大的作为最佳显色时间。结果见表7，最佳显色时间为5
‑
10min，优选10min最佳。
[0106]
表7最佳显色时间的确定
[0107][0108]
(8)基于ehdv核心样颗粒的阻断elisa方法
[0109]
根据步骤(1)
‑
(7)摸索的阻断elisa最佳反应条件为：
[0110]
在96孔酶标板加入用0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释至1.25μg/ml的ehdv核心
样颗粒，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗涤3次；每孔加入200μl含3％bsa的pbst封闭液，37℃封闭2h；pbst洗涤3次；每孔加入100μl以pbst稀释的待检血清(1:5)或标准阳性血清或标准阴性血清，37℃孵育90min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl 1：6000稀释的hrp标记的抗ehdv vp7单克隆抗体37℃孵育45min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育10min，每孔加入终止液50μl 2m h2so4终止反应，酶标仪读取od
450
值，计算阻断率pi值。
[0111]
实例3临界值的确定结果
[0112]
按照确定的阻断elisa操作程序检测80份已知ehdv阴性血清，读取od
450nm
值，结果经统计学分析，计算出血清样品的平均阻断率为10.5％，标准差(s)为4.62％，
[0113]
当阻断率pi≥24.36％时判定为阳性，
[0114]
当阻断率pi≤19.74％时判定为阴性，
[0115]
当阻断率19.74％＜pi＜24.36％时判定为可疑，
[0116]
需重复检测1次，如果仍低于24.36％则判为血清抗体阴性。
[0117]
实例4敏感性试验
[0118]
使用按照实例2的方法制备的3批基于ehdv核心样颗粒的阻断elisa抗体检测试剂盒批次20201206、20210110和20210206)，按照实施例2的使用方法对ehdv感染牛血清20份、ehdv感染绵羊血清20份、ehdv感染山羊血清20份进行检测，实验结果见表8，本发明的试剂盒共检测出59份，有1份未检出，结果表明本试剂盒对40份已知阳性血清的敏感性为98.3％。
[0119]
表8敏感性试验
[0120][0121]
实例5特异性试验
[0122]
为确定本发明的特异性，用实例2所建立的方法分别于不同时间段包被的酶标板(批次20201206、20210110和20210206)，并按照实例2的阻断elisa方法分别检测60份健康反刍动物血清、5份牛蓝舌病阳性血清(bt)、2份牛口蹄疫阳性血清(fmd
‑
o)、2份牛口蹄疫阳性血清(fmd
‑
a)、2份牛病毒性腹泻病阳性血清(bvd)、2份牛水泡性口炎阳性血清(vs)、3份绵羊小反刍兽疫阳性血清(ppr)、3份羊痘阳性血清(sp)。
[0123]
试剂盒的特异性检测结果如下表(表9)显示，对40份健康猪血清的检测结果显示，
3批试剂盒的特异性均为100.0％。对5份牛蓝舌病阳性血清(bt)、2份牛口蹄疫阳性血清(fmd
‑
o)、2份牛口蹄疫阳性血清(fmd
‑
a)、2份牛病毒性腹泻病阳性血清(bvd)、2份牛水泡性口炎阳性血清(vs)、3份绵羊小反刍兽疫阳性血清(ppr)、3份羊痘阳性血清(sp)，因此3批试剂盒对这7种共19份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。
[0124]
表9本发明试剂盒特异性试验结果
[0125][0126]
实例6重复性试验
[0127]
取同一批次包被的酶标板3条和3次不同批次包被的酶标板各1条，用ehdv阴性血清4份、阳性血清4份进行批内、批间重复试验，计算批内和批间的变异系数。重复性试验结果表明，8份血清在批内和批间试验中的变异系数均小于10％，证明该阻断elisa检测方法具有良好的重复性。
[0128]
实例7符合性试验
[0129]
用本发明建立的阻断elisa检测方法与进口商品化试剂盒(全病毒包板)同时检测了200份临床血清样品，结果如表11所示；结果显示本发明的阻断elisa方法和商品化试剂盒阳性符合率为100％，阴性符合率为98.7％，总符合率为99％；与商品化试剂盒具有较高的符合率，可用于临床检测ehdv血清样品。
[0130]
表11阻断elisa检测结果与商品化试剂盒检测符合率
[0131][0132]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

技术特征：
1.一种ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：步骤1)酶标板制备：将ehdv clps包被到酶标板，所述ehdv clps为ehdv vp3和vp7蛋白组装形成的空心颗粒；步骤2)酶标抗体制备：用辣根过氧化物酶hrp标记的抗ehdv vp7蛋白的群特异性单克隆抗体作为酶标抗体。2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)为：将ehdv clps用0.1
‑
0.2m的tris盐酸包被液稀释至1
‑
1.5μg/ml，4
‑
6℃包被12
‑
16h，洗涤后加入含1
‑
3％bsa的封闭液封闭；所述步骤2)酶标抗体浓度稀释为1:6000
‑
1:8000；优选的，所述步骤1)具体为：将所述ehdv clps用0.2m ph8.0的tris盐酸包被液稀释至1.25μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被12h，洗涤后加入200μl含3％bsa的封闭液，37℃封闭2h，洗涤后保存。3.一种ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由权利要求1
‑
2任一方法制备。4.一种ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，包括酶标板和酶标抗体；其中，所述酶标板包被有ehdv clps，所述ehdv clps为ehdv vp3和vp7蛋白组装形成的空心颗粒；所述酶标抗体为用辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗ehdv vp7蛋白的群特异性单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板的制备方法包括：将所述ehdv clps用0.1
‑
0.2m的tris盐酸包被液稀释至1
‑
1.5μg/ml，4
‑
6℃包被12
‑
16h，洗涤后1
‑
3％bsa的封闭液封闭；所述酶标抗体工作浓度稀释为1:6000
‑
1:8000；优选的所述酶标板的制备方法为：将所述ehdv clps用0.2m ph8.0的tris盐酸包被液稀释至1.25μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被12h，洗涤后加入200μl含3％bsa的封闭液，37℃封闭2h，洗涤后保存。6.根据权利要求4
‑
5任一所述的阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括0.1mg/ml的四甲基联苯胺(tmd)显色液和2m硫酸溶液终止液。7.根据权利要求4
‑
6任一所述的阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于：所示试剂盒还包括阳性对照和阴性对照：所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的ehdv阳性的牛血清；所述阴性对照为无ehdv且无疫苗接种的健康牛血清。8.权利要求3
‑
7中任一项所述的ehdv阻断elisa抗体检测试剂盒在制备检测ehdv感染或疫苗接种的待测样品的产品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测为：在每孔加入100μl以pbst稀释的待检血清，稀释比例为1:5
‑
1:10，37℃孵育60
‑
90min；pbst洗涤后加入1：6000稀释的hrp标记的抗ehdv vp7单克隆抗体，37℃孵育30
‑
45min；加入tmb底物孵育后加入终止液h2so4终止反应，酶标仪读取od450值，计算阻断率pi值；优选的，所述检测具体为：在每孔加入100μl以pbst稀释的待检血清，稀释比例为1:5，37℃孵育90min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl 1：6000稀释的hrp标记的抗ehdv vp7单克隆抗体，37℃孵育45min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育10min，每孔加入终止液50μl 2m h2so4终止反应，酶标仪读取od
450
值，计算阻断率pi值；更优选的，当阻断率pi≥24.36％时判定为阳性；pi≤19.74％时判定为阴性；19.74％
＜pi＜24.36％时判定为可疑，需重复检测1次，如果仍低于24.36％则判为血清抗体阴性。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述待检血清为感染野毒株或应用过普通的ehdv弱毒疫苗、灭活疫苗或应用过非ehdv vp7缺失疫苗的反刍动物血清。
技术总结
本发明提供了一种基于鹿流行性出血热病毒(EHDV)核心样颗粒(CLPs)的阻断ELISA抗体检测试剂盒、制备方法及其应用。本发明所述试剂盒敏感性高、特异性好、操作便捷，结果判定采用阻断率(PI)法，准确度高，与进口试剂盒相比，检测符合率达99％以上。测符合率达99％以上。测符合率达99％以上。


技术研发人员：黄超华 花群义 曹琛福 史卫军 吴江 林彦星 林永涛 翁巧玉 曾少灵 杨俊兴
受保护的技术使用者：深圳海关动植物检验检疫技术中心
技术研发日：2021.03.25
技术公布日：2021/6/29