一种基于原位的晶体高通量培养及快速上样的装置及方法与流程

1.本发明涉及蛋白质晶体结构解析领域，更具体地涉及一种基于原位的晶体高通量培养及快速上样的装置及方法。


背景技术：

2.随着结构生物学的发展，如何高效而快速的开展蛋白质晶体培养、筛选优化及上样变得越来越重要，原位技术的开发实现了晶体在其生长环境中进行衍射数据的连续收集，省去了转移样品的过程，大大提升了晶体的上样效率，尤其适用于微小晶体或易碎晶体在常低温下的衍射数据采集。
3.原位方法的实现一般通过两种原位板，一种是光束线站专用的原位大板，但一是原位大板与常规尼龙上样环相比尺寸过大，在原位衍射数据采集过程中需要加入或改变其它的电机等硬件系统来配合。二是现有原位板不能像常规尼龙上样环一样进行基于测角仪旋转的快速对中即将晶体快速转移到光路上，需要直接改变电机参数来移动原位板，增加了操作复杂性且具有一定安全隐患；另一种原位板是光束线站兼用的原位小板，其不需要加入或改变线站的电机等硬件系统来配合，可采用常规的晶体上样方式来进行衍射数据采集，但由于原位小板尺寸较小，晶体培养操作难度较高，采用手动上样方式上样效率较低，大大限制了其应用。随着原位技术应用更广泛，如何方便的培养晶体、提升晶体上样的效率变得越来越重要，相关硬件和软件的开发也在不断发展中。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于原位的晶体高通量培养及快速上样的装置及方法，从而解决现有技术中原位小板晶体培养困难及上样效率低的问题。
5.根据本发明的第一方面，提供一种基于原位的晶体高通量培养及快速上样的装置，包括：若干原位上样板，所述原位上样板上具有镂空的点样孔；用于提供镀膜场所的镀膜板，所述镀膜板上具有若干第一镀膜槽和若干第二镀膜槽，每个所述第一镀膜槽具有与所述原位上样板相当的尺寸，每个所述第二镀膜槽具有所述原位上样板的数倍长度以及相等宽度，用于同时容纳多个原位上样板；用于晶体培养的原位结晶板，所述原位结晶板上包括若干池液孔，所述原位结晶板的侧面还包括前后贯穿的若干侧孔，所述侧孔位于所述池液孔的上方；以及通板，所述通板的尺寸适配所述原位结晶板上的侧孔；其中，所述镀膜板与原位结晶板在同一水平面上并排放置时，所述镀膜板上的第一镀膜槽或第二镀膜槽与原位结晶板上的侧孔对齐，放置于所述第一镀膜槽的原位上样板可通过所述侧孔进入原位结晶板，并且所述原位上样板上的至少一个点样孔与所述原位结晶板的一个池液孔组成一个结晶室，从而实现基于原位的晶体高通量培养及快速上样。
6.根据本发明的一个优选方案，所述原位结晶板上的池液孔呈方阵排列，所述池液孔的数量为x
×
y。
7.优选地，所述装置还包括一可拆卸的挡板，所述原位结晶板的上方居中位置具有
沿整个长度方向延伸的一条凹槽，所述挡板的尺寸适配所述凹槽，组配后与挡板相邻的结晶室可以形成密闭的气相扩散空间。
8.在设计本发明的装置时，考虑到原位上样板长度受线站硬件相位限制，所以不能太长，并且原位上样板上要尽量减小无用空间增大点样孔体积，而常用晶体自动点样机上可以使用的结晶板尺寸较大，为了满足线站要求同时又为了充分利用晶体自动点样机，因此需要大批量原位上样板来填充结晶板。这样就出现两个问题，其一，结晶板一列有四个原位上样板，一下子校正四个板子位置有点困难，因为板子加工有误差，而只要原位上样板只要稍微偏一点点就可能会影响后续观察；其二，如果没有挡板，结晶板前后侧孔是贯通的，而原位上样板的尺寸标准是一定的，把四个一模一样的原位上样板插进去而且还要求每个原位上样板上的点样孔与结晶室相对应的难度较高。本发明通过设计这样的挡板就可以同时满足这两方面的需求。
9.由此可以看出，在使用常用的自动点样机和上海光源个别线站的前提下，挡板最适合布置于原位结晶板沿宽度方向的中间位置。
10.优选地，所述原位结晶板与自动点样机适配。
11.优选地，所述原位上样板的小头端具有以便于进入所述侧孔的导向斜面。
12.优选地，所述镀膜板与原位结晶板可在同一水平面上拼接，所述镀膜板的侧面与所述原位结晶板的侧面具有形状互补的结构，实现镀膜板与原位结晶板的稳定装配。优选地，镀膜板与原位结晶板的底盘可以组配，镀膜板的高度与原位结晶板的侧孔卡槽高度相同，从而有利于批量化的将原位上样板放置到原位结晶板中，也有利于从原位结晶板中批量化的取出原位上样板，在镀膜板上批量镀膜。
13.优选地，所述第一镀膜槽和第二镀膜槽分别具有沿周向的至少一部分布置的第一刻痕和第二刻痕，以便于镀膜时进行切割。
14.优选地，第二镀膜槽的数目和原位结晶板的侧孔数目匹配，从而有利于一列原位上样板与原位结晶板的大批量组装或拆卸。
15.优选地，原位结晶板侧孔卡槽数目根据自动点样机常用结晶板尺寸大小设置，从而有利于电机的相位矫正。
16.优选地，通板长宽与侧孔大小适配，从而可以将原位结晶板中的原位上样板一行或一列成批量的推出到镀膜板上。
17.优选地，原位结晶板侧孔内设有镂空的卡槽装置，这样既有利于组配原位上样板，也有利于在显微镜下观察晶体的生长状况。
18.根据本发明的第二方面，提供一种基于原位的晶体高通量培养及快速上样的方法，所述方法包括以下步骤：s1：提供一种如上面所述的基于原位的晶体高通量培养及快速上样的装置；s2：将原位上样板放置于所述镀膜板上的第一镀膜槽中进行背面镀膜，然后通过侧孔将翻面后的原位上样板推入原位结晶板中；s3：利用自动点样机对原位结晶板进行点样操作，然后密封整个原位结晶板，形成多个密闭的结晶室，进行蛋白质结晶；s4：利用通板将原位上样板从所述原位结晶板中批量推出到所述镀膜板上的第二镀膜槽中，每个第二镀膜槽中同时容纳多个原位上样板，进行正面镀膜；s5：最后将双面镀膜的原位上样板固定在磁性底座上，放置到晶体样品盒中，即可在同步辐射光束线站进行自动化上样。
19.根据本发明的一个优选方案，步骤s2包括：用具有低背景散射特性的膜将原位上
样板密封，然后用刀片沿第一镀膜槽上的第一刻痕切割，即可获得单面镀膜的原位上样板；步骤s4还包括：用具有低背景散射特性的膜将原位上样板密封，然后用刀片沿第二镀膜槽上的第二刻痕切割，并将相邻原位上样板分割开，即可获得双面镀膜的原位上样板。
20.根据本发明的一个优选方案，步骤s2还包括：提供可拆卸的挡板，所述原位结晶板的上方居中位置具有沿整个长度方向延伸的凹槽，将所述挡板插入凹槽，即可通过侧孔将单面镀膜的原位上样板分两侧推入原位结晶板中，实现原位上样板与原位结晶板的准确装配。
21.根据本发明提供的一种基于原位的晶体高通量培养及快速上样的装置，其利用镀膜板上较短的第一镀膜槽预先为原位上样板的其中一面镀膜，当结晶完成，再利用较长的第二镀膜槽实现所有原位上样板的另一面的批量镀膜。该镀膜板包含有对齐排列的多个第一镀膜槽和多个第二镀膜槽，在沿第一镀膜槽的边缘还设有相对深度较浅的第一刻痕，将原位上样板放置在第一镀膜槽后，用低背景散射的膜例如聚亚酰胺薄膜将原位上样板密封，然后用刀片沿第一刻痕进行切割，即可获得单面镀膜的原位上样板。待原位上样板在原位结晶板上结晶结束后，每个第二镀膜槽中可同时容纳多个原位上样板，用低背景散射的膜例如聚亚酰胺薄膜将原位上样板没有镀膜的一面镀膜，然后沿第二刻痕切割，即可获得双面镀膜的原位上样板。
22.根据本发明提供的晶体高通量培养及快速上样装置，其利用一个原位结晶板来实现晶体的高通量培养，原位结晶板设有顶部凹槽和侧孔卡槽，挡板可通过顶部凹槽和原位结晶板进行组配，原位上样板可通过侧孔卡槽与原位结晶板进行组配。在将原位上样板的单面镀膜后，先将挡板与原位结晶板的顶部凹槽组配，然后将原位结晶板和镀膜板的底盘组配，将镀膜板上单面镀膜的原位上样板推入到原位结晶板中，重复这个过程，直到原位上样板顶到挡板，在原位结晶板留有侧孔卡槽的另一侧做相同的步骤，完成整个原位结晶板与原位上样板的装配，利用自动点样机对原位结晶板进行点样操作，然后密封整个原位结晶板，形成多个密闭的结晶室，待蛋白质结晶后，取下挡板，利用通板将原位结晶板上的原位上样板推出到镀膜板上，进行双面镀膜，最后将双面镀膜的原位上样板固定在磁性底座上，放置到晶体样品盒uni
‑
puck中，即可在同步辐射光束线站进行自动化上样。
23.根据本发明的晶体高通量培养及快速上样装置及方法，其可以充分的利用原位衍射的优势，除此之外，开发了与自动点样机适配的原位结晶板，与原位结晶板和晶体样品盒适配的原位上样板，与原位上样板适配的镀膜板，实现了在原位前提下，晶体的优化、高通量培养以及快速上样。通过这种方式，大大提升了蛋白质结构解析的效率，向全自动蛋白质结构解析的实现迈出了重要的一步。本发明适用于坐滴法培养的晶体特别是微小晶体的衍射数据采集。
附图说明
24.图1是根据本发明的一个优选实施例的单个原位上样板的放大结构示意图；
25.图2是根据本发明的一个优选实施例的镀膜板的结构示意图；
26.图3是根据本发明的一个优选实施例的原位结晶板的结构示意图；
27.图4是根据本发明的一个优选实施例的挡板的结构示意图；
28.图5是根据本发明的一个优选实施例的通板的结构示意图；
29.图6是镀膜板与原位结晶板在同一平面上拼接的状态示意图；
30.其中，附图标记说明如下：10、原位上样板；11、点样孔；12、小头端；20、镀膜板；21、第一镀膜槽；22、第一刻痕；23、第二镀膜槽；24、第二刻痕；25、镀膜板底盘；30、原位结晶板；31、原位结晶板底盘；32、侧孔；33、顶部凹槽；34、池液孔；35、原位结晶板顶部；40、挡板；50、通板。
具体实施方式
31.下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
32.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
33.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
34.结合图1～图5所示，是根据本发明的一个优选实施例提供的晶体高通量培养及快速上样装置，包括：原位上样板10，镀膜板20，原位结晶板30，挡板40，通板50。
35.如图1所示，原位上样板10上具有镂空的四个点样孔11，以及位于一个端部的小头端12，通过点样孔11可进行点样，小头端12具有如图所示的导向斜面，可便于装配到原位结晶板30中。但是应当理解的是，每个原位上样板10上点样孔11的数目并不仅限于四个。
36.如图2所示，镀膜板20上具有沿前后方向对齐的十二个第一镀膜槽21和十二个第二镀膜槽23，第一镀膜槽21与原位上样板10的尺寸相当，第二镀膜槽23具有原位上样板10的数倍长度以及相等宽度。根据该优选实施例，第二镀膜槽23具有原位上样板10的四倍长度，因此，单个第二镀膜槽23可同时容纳四块原位上样板10。但是应当理解的是，第二镀膜槽23的尺寸可根据原位结晶板30的设计而定，或者说根据池液孔的排列方式而定。第一镀膜槽21和第二镀膜槽23还分别具有沿周向三个侧面布置的第一刻痕22和第二刻痕24，以便于镀膜时进行切割。
37.如图3所示，原位结晶板30上包括96个(8
×
12)池液孔34，原位结晶板30的侧面还包括沿前后方向贯穿的十二个侧孔32，这些侧孔位于池液孔34的上方，该原位结晶板30的上方沿宽度方向的居中位置还具有沿整个长度方向延伸的顶部凹槽33。应当理解的是，在本发明的描述中，以图3为准，从左至右为长度方向，从前往后为宽度方向。
38.如图4所示，挡板40具有长条形结构，将挡板40插入顶部凹槽33中后，可通过侧孔32将单面镀膜的原位上样板10分两侧推入原位结晶板30中，实现原位上样板10与原位结晶板30的准确装配，从根本上避免了单侧装配无法准确定位的问题。同时，该挡板40与顶部凹槽33尺寸匹配，从而在组配后挡板40可以与顶部凹槽33两端的结晶室形成密闭空间，提供蛋白质结晶的气相扩散条件。
39.如图5所示，通板50也具有长条形结构，该通板50的尺寸适配原位结晶板10上的侧
孔32，从而可以将原位结晶板30中的一列四个原位上样板10批量地推出到镀膜板20的第二镀膜槽23上。
40.优选地，镀膜板20与原位结晶板30可在同一水平面上拼接，镀膜板20的侧面与原位结晶板30的侧面具有形状互补的结构。结合图2、图3、图6所示，镀膜板底盘25与原位结晶板底盘31可以组配，镀膜板20的高度与原位结晶板30的侧孔32高度相同，从而有利于批量化地将原位上样板10放置到原位结晶板30中，也有利于从原位结晶板30中批量化地取出原位上样板10，在镀膜板20上批量镀膜。
41.根据上述优选实施例提供的晶体高通量培养及快速上样装置，其使用方法如下：
42.首先，将多个原位上样板10放入镀膜板20的第一镀膜槽21中，用具有低背景散射特性的膜例如聚亚酰胺薄膜将原位上样板10密封，即平铺于原位上样板10的上表面上，然后用刀片沿周向布置的第一刻痕22切割，即可获得单面镀膜的原位上样板10。
43.单面镀膜完成后，将原位上样板10未镀膜的一面朝上，同样放置在第一镀膜槽21中，然后将镀膜板底盘25与原位结晶板底盘31组配，如图6所示，即可依次将第一镀膜槽21中的原位上样板10推入原位结晶板30的侧孔32中，将挡板40插入原位结晶板30的顶部凹槽33后，重复上述步骤为新的原位上样板10单面镀膜，然后推入原位结晶板的侧孔32中直至原位上样板10顶到挡板13，然后在原位结晶板30的另一侧重复此过程直至与原位结晶板组配48个原位上样板。此时，原位上样板10上的每两个点样孔11与原位结晶板30的一个池液孔34组成一个结晶室，每块原位上样板10分别对应两个池液孔34，形成两个结晶室。
44.然后向原位结晶板30的96个池液孔34中加入母液，即可利用自动点样机为原位结晶板30进行自动点样，自动点样机自动将母液与蛋白液以设置的比例加入到与原位结晶板30组配的原位上样板10的点样孔11中，自动点样完成后，即可用透明胶带将原位结晶板顶部35进行密封，从而形成96个密闭的结晶室。
45.蛋白质在密闭的结晶室结晶完成后，先用小刀沿原位结晶板顶部凹槽33的边缘轻轻划开，将挡板40取出，然后再将镀膜板底盘25与原位结晶板底盘31组配，将通板50推入原位结晶板30的侧孔32中，即可将一列4个原位上样板10批量推入镀膜板20的第二镀膜槽23中，重复12次直至铺满第二镀膜槽23，用具有低背景散射特性的膜例如聚亚酰胺薄膜将原位上样板10密封，然后用刀片沿镀膜板20上的第二刻痕24切割，并将相邻原位上样板10轻轻分割开，即可获得48块双面镀膜的原位上样板10。
46.双面镀膜的原位上样板10制作完成后，通过原位上样板10的小头端12将原位上样板10拧入并固定在磁性底座(图未示出)上，再将其放入晶体样品盒uni
‑
puck中，即可在同步辐射光束线站进行自动化上样，最后进行原位的衍射数据采集。
47.应当理解的是，根据本发明提供的原位上样板10，镀膜板20，原位结晶板30并不仅限于图中所示结构，其上的点样孔、镀膜槽、池液孔还可以是其他数量以及其他任意合适的排列方式，只要能实现本发明的技术效果则均在本发明的保护范围之内。
48.以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。