抗‑紧密连接蛋白抗体及其用途1.交叉引用2.本技术要求于2018年12月07日提交的专利合作条约申请号pct/cn2018/119797的优先权，所述申请出于所有目的通过引用整体并入本文。3.发明背景4.胃食管癌和胰腺癌是未满足医疗需求最高的恶性肿瘤。胃癌(gc)是与癌症相关的死亡的第三大最常见原因，并且最大比例的胃癌患者分布在东亚，尤其是在韩国、蒙古、日本和中国。在发达国家，胰腺癌的死亡率是所有癌症中最高的，并且预计在美国和中国都会增加。发明概要5.在某些实施方案中，本文公开了抗‑紧密连接蛋白18.2抗体和包含其的药物组合物。在某些实施方案中，本文还描述了用抗‑紧密连接蛋白18.2抗体治疗患有癌症的受试者的方法和用抗‑紧密连接蛋白18.2抗体诱导细胞杀灭效应的方法。6.在某些实施方案中，本文公开了抗‑紧密连接蛋白18.2(抗‑cldn18.2)抗体，其包含比参考抗体175d10的半数最大有效浓度(ec50)低的ec50，其中参考抗体175d10包含seqidno:98所示的重链(hc)序列和seqidno:99所示的轻链(lc)序列。7.在某些实施方案中，本文公开了抗‑紧密连接蛋白18.2(抗‑cldn18.2)抗体，其在翻译后修饰位点处包含至少一种突变。8.在某些实施方案中，本文公开了抗‑紧密连接蛋白18.2(抗‑cldn18.2)抗体，其在fc区中包含至少一个赋予增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的突变，其中所述增强的adcc是与包含seqidno:98所示的重链(hc)序列和seqidno:99所示的轻链(lc)序列的参考抗体175d10进行比较的。在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体的ec50为约5nm或更低。在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体的ec50为约5nm、约4nm、约3nm、约2nm、约1nm、约0.5nm或更低。9.在某些实施方案中，本文公开了抗‑紧密连接蛋白18.2(抗‑cldn18.2)抗体，其包含相对于参考抗体175d10的结合亲和力更高的对cldn18.2的结合亲和力，其中参考抗体175d10包含seqidno:98所示的重链(hc)序列和seqidno:99所示的轻链(lc)序列。10.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含可变重链(vh)区和可变轻链(vl)区，其中vh区包含：cdr1序列gfsltsyx1vx2；其中x1选自n或g；并且x2选自y或h；cdr2序列viwx3x4gx5tx6yx7x8x9lx10s；其中x3选自n或p；x4选自t或g；x5选自a或n；x6选自r或n；x7选自n、q或e；x8选自s或i；x9选自t或a；x10选自k或m；和cdr3序列dx11x12x13x14x15x16x17x18x19x20；其中x11选自s或r；x12选自a或r；x13选自m或l；x14选自p或a；x15选自a或m；x16选自i或d；x17选自p或y；x18存在或不存在，如果存在，则为f；x19存在或不存在，如果存在，则为a；并且x20存在或不存在，如果存在，则为y。在一些实施方案中，vh区包含cdr1序列x21x22x23x24x25sfgmh；其中x21存在或不存在，如果存在，则为g；x22存在或不存在，如果存在，则为f；x23存在或不存在，如果存在，则为t；x24存在或不存在，如果存在，则为f；并且x25存在或不存在，如果存在，则为s；cdr2序列yissgsx26x27iyyx28dx29x30kg；其中x26选自s或g；x27选自p或s；x28选自v或a；x29选自k或t；并且x30选自l或v；以及cdr3序列ax31x32x33x34x35x36x37x38x39x40x41；其中x31选自g或t；x32选自y或s；x33选自a或y；x34选自v或y；x35选自r或y；x36选自n或g；x37选自a或n；x38选自l或a；x39选自d或l；x40选自y或e；并且x41存在或不存在，如果存在，则为y。在一些实施方案中，vh区包含由seqidno:1组成的cdr1序列，cdr2序列viwntgatryx7sx9lks，和由seqidno:3组成的cdr3序列，其中x7选自n、q或e；并且x9选自t或a。在一些实施方案中，vh区包含由seqidno:13组成的cdr1序列，cdr2序列viwpggntnyx7x8alms，和由seqidno:15组成的cdr3序列，其中x7选自n或e；并且x8选自s和i。在一些实施方案中，vh区包含选自seqidno:1、7、10或13的cdr1序列；和选自seqidno:2、4、5、6、8、11、14、16或17的cdr2序列；和选自seqidno:3、9、12或15的cdr3序列。在一些实施方案中，vh区包含由seqidno:1组成的cdr1序列；选自seqidno：2、4、5或6的cdr2序列；和由seqidno:3组成的cdr3序列。在一些实施方案中，vh区包含由seqidno:13组成的cdr1序列；选自seqidno:14、16或17的cdr2序列；和由seqidno:15组成的cdr3序列。在一些实施方案中，vh区包含由seqidno:7组成的cdr1序列，由seqidno:8组成的cdr2序列，和由seqidno:9组成的cdr3序列。在一些实施方案中，vh区包含由seqidno:10组成的cdr1序列，由seqidno:11组成的cdr2序列，和由seqidno:12组成的cdr3序列。在一些实施方案中，vl区包含选自seqidno:18、21、24‑28、31‑35、38或39的cdr1序列；选自seqidno:19、22、29或36的cdr2序列；和选自seqidnos:20、23、30或37的cdr3序列。在一些实施方案中，vl区包含选自seqidno:21或24‑27的cdr1序列；由seqidno:22组成的cdr2序列；和由seqidno:23组成的cdr3序列。在一些实施方案中，vl区包含选自seqidno:28或31‑34的cdr1序列；由seqidno:29组成的cdr2序列；和由seqidno:30组成的cdr3序列。在一些实施方案中，vl区包含选自seqidno:35、38或39的cdr1序列；由seqidno:36组成的cdr2序列；和由seqidno:37组成的cdr3序列。在一些实施方案中，vl区包含由seqidno:18组成的cdr1序列，由seqidno:19组成的cdr2序列，和由seqidno:20组成的cdr3序列。11.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体是结合片段。在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包括单价fab'、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)，或骆驼科动物抗体或它们的结合片段。在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段，或双特异性抗体或其结合片段。12.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含位于翻译后修饰位点处的突变。在一些实施方案中，所述突变位于vh区的氨基酸位置60、61或62处，并且其中所述氨基酸位置对应于seqidno:40的位置60、61或62。在一些实施方案中，所述突变位于seqidno:40的氨基酸位置60或62处。在一些实施方案中，所述突变位于seqidno:57的氨基酸位置60或61处。在一些实施方案中，位于氨基酸残基n60处的突变是突变为谷氨酰胺或谷氨酸。在一些实施方案中，位于氨基酸残基s61处的突变是突变为异亮氨酸。在一些实施方案中，位于氨基酸残基t62处的突变是突变为丙氨酸。在一些实施方案中，所述突变位于vl区的氨基酸位置31或32处，并且其中所述氨基酸位置对应于seqidno:46、52或60的位置31或32。在一些实施方案中，所述突变位于seqidno:46、52或60的氨基酸位置31或32处。在一些实施方案中，位于氨基酸残基n31处的突变是突变为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，位于氨基酸残基s32处的突变是突变为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。在一些实施方案中，所述突变使经修饰的抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力相对于参考抗体175d10增强。13.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包括嵌合抗体或其结合片段。在一些实施方案中，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:40‑43的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:44的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些实施方案中，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:45的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:46‑50的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些实施方案中，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:51的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:52‑56的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些实施方案中，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:57‑59的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:60‑62的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些实施方案中，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:63的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的ch区，以及含有与seqidno:64的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的cl区。14.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包括人源化抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:65‑68的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:69‑73的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些实施方案中，所述人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:74‑76的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:77‑80的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些实施方案中，所述人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:81‑84的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:85‑88的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些实施方案中，所述人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:89‑92的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:93‑97的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。15.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含igm框架。16.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含igg2框架。17.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含igg1框架。18.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含位于fc区中的一种或多种突变。在一些实施方案中，所述一种或多种突变包括位于以下位置处的突变：氨基酸位置s239、氨基酸位置i332、氨基酸位置f243、氨基酸位置r292、氨基酸位置y300、氨基酸位置v305、氨基酸位置p396，或其组合。在一些实施方案中，位于fc区中的一种或多种突变赋予参考抗体175d10增强的adcc。在一些实施方案中，与参考抗体175d10相比，抗‑cldn18.2抗体具有补体‑依赖性细胞毒性(cdc)活性。19.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体进一步缀合至有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是澳瑞他汀或其衍生物。在一些实施方案中，澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀e(mmae)。在一些实施方案中，澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀f(mmaf)。20.在一些实施方案中，药物与抗体的比率(dar)为约2、约3或约4。21.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体与参考抗体175d10共享结合表位。22.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体具有与小鼠和食蟹猴cldn18.2蛋白的交叉结合活性。23.在某些实施方案中，本文公开了特异性地结合至cldn18.2的同等型(isoform)的抗‑紧密连接蛋白18.2(抗‑cldn18.2)抗体。在一些实施方案中，cldn18.2的同等型是在细胞系snu620中表达的同等型。24.在某些实施方案中，本文公开了编码本文所述的抗‑cldn18.2抗体的核酸聚合物。25.在某些实施方案中，本文公开了包含编码本文所述的抗‑cldn18.2抗体的核酸聚合物的载体。26.在某些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含：本文所述的抗‑cldn18.2抗体；以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于全身施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肠胃外施用。27.在某些实施方案中，本文公开了一种治疗患有以cldn18.2蛋白的过表达为特征的癌症的受试者的方法，其包括：向所述受试者施用本文所述的抗‑cldn18.2抗体或本文所述的药物组合物，从而治疗所述受试者的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是胃肠癌。在一些实施方案中，所述胃肠癌是胃癌。在一些实施方案中，所述胃肠癌是胰腺癌。在一些实施方案中，所述胃肠癌是食管癌或胆管癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌或卵巢癌。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂、靶向治疗剂、基于激素的治疗剂、基于干细胞的治疗剂或辐射。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂和抗‑cldn18.2抗体同时施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂和抗‑cldn18.2抗体依序施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂在抗‑cldn18.2抗体之前施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂在施用抗‑cldn18.2抗体之后施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂和抗‑cldn18.2抗体是作为单独的剂量配制的。在一些实施方案中，所述受试者是人。28.在某些实施方案中，本文公开了诱导细胞杀灭效应的方法，该方法包括：使多个细胞与包含有效载荷的抗‑cldn18.2抗体接触足以使抗cldn18.2抗体内化并由此诱导细胞杀灭效应的时间。在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含本文所述的抗‑cldn18.2抗体。在一些实施方案中，所述有效载荷包括类美登素(maytansinoid)、澳瑞他汀(auristatin)、紫杉烷、加利车霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、阿马托毒素(amatoxin)，或其衍生物。在一些实施方案中，所述有效载荷包括澳瑞他汀或其衍生物。在一些实施方案中，所述效载荷是单甲基澳瑞他汀e(mmae)。在一些实施方案中，所述有效载荷是单甲基澳瑞他汀f(mmaf)。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞来自胃肠癌。在一些实施方案中，所述胃肠癌是胃癌。在一些实施方案中，所述胃肠癌是胰腺癌。在一些实施方案中，所述胃肠癌是食管癌或胆管癌。在一些实施方案中，所述细胞来自肺癌或卵巢癌在一些实施方案中，所述方法是体外方法。在一些实施方案中，所述方法是体内方法。在一些实施方案中，所述受试者是人。29.在某些实施方案中，本文公开了试剂盒，其包括本文所述的抗‑cldn18.2抗体、本文所述的载体，或包含本文所述的抗‑cldn18.2抗体的药物组合物。30.附图简述31.在所附权利要求中具体阐述了本公开的各个方面。通过参考以下详述将能获得对本公开的特征和优势的更好的理解，所述详述阐述利用了本公开的原理的例示性实施方案以及附图，在附图中：32.图1例示了cldn18.2在hek293细胞上的工程化表达。33.图2例示人cldn18.2dna序列。34.图3例示了cldn18.2ecl1dna。35.图4a‑图4c例示了纯化的抗‑cldn18.2小鼠产生的抗体在cho‑cldn18.2细胞上的剂量依赖性结合曲线。与175d10的最大结合相比，抗体显示出最高(图4a)、较高(图4b)和类似或较弱(图4c)的最大结合。36.图5a‑图5b例示了结合至胃癌细胞系snu601(图5a)和snu620(图5b)的抗体。编号“1”、“2”、“3”和“4”分别指示282a12、175d10、101c6和同种型对照。37.图6a‑图6d例示了特异性地结合至cho‑cldn18.2细胞系的嵌合364d1a7和413h9f8。图6a和图6b例示了嵌合364d1a7在cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2细胞系上的结合曲线。图6c和图6d例示了嵌合413h9f8在cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2细胞系上的结合曲线。cho‑cldn18.1细胞系用于图6a和图6c所示的实验，并且cho‑cldn18.2细胞系用于图6b和图6d所示的实验。嵌合175d10和亲本抗体用作对照。38.图7a‑图7d例示了嵌合282a12f3变异体与cho‑cldn18.2细胞系的剂量依赖性结合。图7a和图7c例示了嵌合抗体(xi282a12f3)和具有突变ptm位点的嵌合抗体(282a12f3‑vh‑n60q和282a12f3‑vh‑n60e)在cho‑cldn18.1细胞系上的结合曲线。图7b和图7d例示了嵌合抗体(xi282a12f3)和具有突变ptm位点的嵌合抗体(282a12f3‑vh‑n60q和282a12f3‑vh‑n60e)在cho‑cldn18.2细胞系上的结合曲线。39.图8a‑图8d例示了嵌合413h9f8变异体与cho‑cldn18.2细胞系的剂量依赖性结合。图8a和图8c示出了鼠抗体(413h9f8)、嵌合抗体(xi413h9f8)和具有突变ptm位点的嵌合抗体(413h9f8‑vl‑n31e、413h9f8‑vl‑s32l和413h9f8‑vl‑s32v)在cho‑cldn18.1细胞系上的结合曲线。图8b和图8d示出了鼠抗体(413h9f8)、嵌合抗体(xi413h9f8)和具有突变ptm位点的嵌合抗体(413h9f8‑vl‑n31e、413h9f8‑vl‑s32l和413h9f8‑vl‑s32v)在cho‑cldn18.2细胞系上的结合曲线。40.图9a‑图9d例示了嵌合364d1a7变异体与cho‑cldn18.2细胞系的剂量依赖性结合。图9a和图9c示出了鼠抗体(364d1a7)、嵌合抗体(xi364d1a7)和具有突变ptm位点的嵌合抗体(364d1a7‑vl‑n31e、364d1a7‑vl‑s32l和364d1a7‑vl‑s32v)在cho‑cldn18.1细胞系上的结合曲线。图9b和图9d示出了鼠抗体(364d1a7)、嵌合抗体(xi364d1a7)和具有突变ptm位点的嵌合抗体(364d1a7‑vl‑n31e、364d1a7‑vl‑s32l和364d1a7‑vl‑s32v)在cho‑cldn18.2细胞系上的结合曲线。41.图10a‑10b例示了嵌合357b8f8变异体与cho‑cldn18.2细胞系的剂量依赖性结合。图10a示出了具有突变ptm位点的嵌合357b8f8抗体在cho‑cldn18.1细胞系上的结合曲线。图10b示出了具有突变ptm位点的嵌合357b8f8抗体在cho‑cldn18.2细胞系上的结合曲线。42.图11a‑图11c例示了示例性嵌合抗体变异体在snu620癌细胞系上的结合。具有突变ptm位点的嵌合抗体在snu620胃癌细胞系上的结合曲线如下：图11a，413h9f8；图11b，264d1a7；和图11c，357b8f8。43.图12a‑图12d例示了嵌合抗体与cho‑cldn18.2细胞系的竞争性结合。在与示例性浓度的xi175d10、282a12f3(t62a)、413h9f8‑vl‑s32v、364d1a7‑vl‑s32v或higg1一起孵育之后，监测xi175d10(图12a)、282a12f3(t62a)(图12b)、413h9f8‑vl‑s32v(图12c)和364d1a7‑vl‑s32v(图12d)在cho‑cldn18.2细胞上的结合。44.图13a‑图13e例示了示例性抗体对不同种类的cldn18.2的种间结合活性。确定hz282(图13a)、xi175d10(图13b)、413h9f8‑vl‑s32v(图13c)、364d1a7‑vl‑s32v(图13d)和357b8f8‑vh‑s61i‑vl‑s32i(图13e)在表达人cldn18.2(实心正方形)、小鼠cldn18.2(实心圆圈)或食蟹猴cldn18.2(实心三角形)的cho细胞上的结合亲和力。将higg1设置为阴性对照。45.图14a‑图14b例示了由抗‑cldn18.2抗体和fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞诱导的cldn18.2特异性adcc活性。在cho‑cldn18.1(图14a)和cho‑cldn18.2细胞系(图14b)中确定了抗‑cldn18.2抗体变异体的adcc活性。46.图15例示了嵌合抗体变异体在nci‑n87细胞系上的adcc活性。在效应细胞(fcr‑tank(cd16a‑15v)):靶细胞比率为2:1且孵育时间为16小时的情况下分析adcc活性。数据是从重复孔获得的。47.图16例示了嵌合抗体变异体在nugc4‑18.2细胞系上的adcc活性。在效应细胞(pbmc):靶细胞比率为40:1且孵育时间为5小时的情况下分析adcc活性。数据来自一个供者，是利用重复孔获得的。48.图17例示了嵌合抗体变异体在cho‑18.2细胞系上的cdc活性。49.图18a‑图18b例示了结合至cho‑cldn18.2的人源化282a12f3(t62a)抗体。图18a示出了人源化282a12f3(t62a)抗体在cho‑cldn18.2细胞上的结合曲线。图18b示出了人源化282a12f3(t62a)抗体在cho‑cldn18.1细胞上的结合曲线。50.图19a‑图19b例示了结合至snu620胃癌细胞的人源化282a12f3(t62a)抗体。图19a示出了人源化282a12f3(t62a)抗体hz282‑1～hz282‑10在snu620胃癌细胞上的结合曲线。图19b示出了人源化282a12f3(t62a)抗体hz282‑11～hz282‑20在snu620胃癌细胞上的结合曲线。51.图20a‑图20d例示了人源化413h9f8‑vl‑s32v(策略1)与cho‑cldn18.2细胞的结合亲和力。人源化413h9f8‑vl‑s32v抗体的完整结合曲线如下所例示：413h9f8‑cp1、413h9f8‑cp2和413h9f8‑cp3在图20a中；413h9f8‑cp4、413h9f8‑cp5和413h9f8‑cp6在图20b中；413h9f8‑cp7、413h9f8‑cp8和413h9f8‑cp9在图20c中；以及413h9f8‑cp10、413h9f8‑cp811和413h9f8‑cp12在图20d中。实验在cho‑cldn18.2细胞中进行。52.图21a‑图21d例示了策略2中的人源化413h9f8‑vl‑s32v在cho‑cldn18.2细胞上的结合亲和力。人源化413h9f8‑vl‑s32v抗体的完整结合曲线如下所示：413h9f8‑h1l1、413h9f8‑h2l1、413h9f8‑h3l1和413h9f8‑h4l1在图21a中；413h9f8‑h1l2、413h9f8‑h2l2、413h9f8‑h3l2和413h9f8‑h4l2在图21b中；413h9f8‑h1l3、413h9f8‑h2l3、413h9f8‑h3l3和413h9f8‑h4l3在图21c中；以及413h9f8‑h1l4、413h9f8‑h2l4、413h9f8‑h3l4和413h9f8‑h4l4在图21d中。实验在cho‑cldn18.2细胞中进行。53.图22a‑图22e例示了人源化364d1a7‑vl‑s32v在cho‑cldn18.2细胞上的结合亲和力。人源化364d1a7‑vl‑s32v抗体的完整结合曲线如下所示：364d1a7‑h1l1、364d1a7‑h2l1、364d1a7‑h3l1和364d1a7‑h4l1在图22a中；364d1a7‑h1l2、364d1a7‑h2l2、364d1a7‑h3l2和364d1a7‑h4l2在图22b中；364d1a7‑h1l3、364d1a7‑h2l3、364d1a7‑h3l3和364d1a7‑h4l3在图22c中；364d1a7‑h1l4、364d1a7‑h2l4、364d1a7‑h3l4和364d1a7‑h4l4在图22d中；364d1a7‑h1l5、364d1a7‑h2l5、364d1a7‑h3l5和364d1a7‑h4l5在图22e中。实验在cho‑cldn18.2细胞中进行。54.图23a‑图23c例示了人源化413h9f8‑vl‑32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体在cho‑cldn18.2细胞上的结合亲和力。图23a和图23b示出了人源化413h9f8‑vl‑s32v抗体在cho‑cldn18.2细胞上的完整结合曲线。图23c示出了人源化364d1a7‑vl‑s32v抗体在cho‑cldn18.2细胞上的完整结合曲线。55.图24a‑图24c例示了人源化抗体变异体与cr‑tank(cd16a‑15v)细胞一起对nci‑n87‑cldn18.2胃癌细胞系的adcc活性。分析了413h9f8(图24a和图24b)和364d1a7(图24c)抗体的人源化抗体与fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞一起在8:1的效应细胞:靶细胞比率下诱导针对nci‑n87‑cldn18.2细胞的adcc的能力。将混合的细胞培养4小时。56.图25a‑图25c例示了人源化抗体变异体与人pbmc一起对nugc4‑cldn18.2胃癌细胞系的adcc活性。分析了413h9f8(图25a和图25b)和364d1a7(图25c)抗体的人源化抗体与人pbmc一起在40:1的效应细胞:靶细胞比率下诱导针对nugc4‑cldn18.2细胞的adcc的能力。将细胞培养5小时。数据来自一个供者，是利用重复孔获得的。57.图26a‑图26b示出了人源化抗体变异体在cho‑18.2细胞系上的cdc活性。确定了人源化413h9f8‑vl‑s32v(图26a)和364d1a7‑vl‑s32v(图26b)抗体与人血清一起对cho‑cldn18.2细胞的cdc活性。58.图27例示了该研究中使用的mab‑mc‑vc‑pab‑mmae的示例性设计结构。59.图28a‑图28b例示了抑制hek293‑cldn18.2细胞的存活力的cldn18.2‑特异性adc。在用adcxi175d10‑vcmmae(dar＝4.02)、282a12f3(t62a)‑vcmmae(dar＝3.94)和higg1‑vcmmae(dar＝3.91)以及裸抗体xi175d10282a12f3(t62a)和higg1处理5天后，确定hek293‑cldn18.2(图28a)和hk293(图28b)细胞的存活力。确定表达cldn18.2的hek293细胞系中的存活力。60.图29a‑图29b例示了抑制nci‑n87‑cldn18.2和nugc4‑cldn18.2细胞的存活力的cldn18.2‑特异性adc。在用adcxi175d10‑vcmmae(dar＝4.02)、282a12f3(t62a)‑vcmmae(dar＝3.94)和higg1‑vcmmae(dar＝3.91)处理5天后，确定nci‑n87‑cldn18.2(图29a)和nugc4‑cldn18.2(图29b)细胞的存活力。61.图30a‑图30b例示了cldn18.2‑特异性adc抑制panc‑1‑cldn18.2细胞的存活力。图30a示出了282a12f3(t62a)在panc‑1‑cldn18.2细胞上的adcc功效。图30b示出了在用cldn18.2‑特异性adc，xi175d10‑vcmmae(dar＝4.02)、282a12f3(t62a)‑vcmmae(dar＝3.94)和higg1‑vcmmae(dar＝3.91)处理5天后panc‑1‑cldn18.2细胞的存活力。62.图31例示了413h9f8‑cp2变异体与fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞一起对cho‑cldn18.2细胞系的adcc活性。63.图32例示了413h9f8‑cp2和413h9f8‑h2l2变异体与人pbmc一起对nugc4‑cldn18.2胃癌细胞系的adcc活性。64.图33a‑33b例示了nugc4‑cldn18.2细胞(图33a)和nci‑n87‑cldn18.2细胞(图33b)对抗‑cldn18.2抗体的内化。65.图34例示了抗‑cldn18.2抗体在裸小鼠内的人胃癌ga0006患者来源的异种移植(pdx)模型中的功效。66.图35a‑35e例示了抗‑cldn18.2抗体在nu/nu小鼠内的小鼠胰腺癌异种移植模型中的功效。67.图36例示了抗‑cld1n8.2抗体和化疗在人胃癌ga0006患者来源的异种移植(pdx)模型中的组合功效。68.发明详述69.紧密连接蛋白(cldn)是调节上皮细胞屏障功能和极性，从而在顶端和基底外侧质膜结构域之间形成边界的中央紧密接合蛋白。迄今为止，已经描述了具有不同器官特异性表达模式的cldn家族的27个成员。已经证明，紧密连接蛋白的表达水平在人瘤形成中往往是异常的。cldn‑18同等型2(cldn18.2)是cldn家族成员之一，是一种选择性的胃谱系抗原，并且它在正常组织中的表达仅局限于胃粘膜的分化上皮细胞。70.cldn18.2蛋白在小鼠、大鼠、兔、狗、猴和人中高度保守，并包含四个跨膜结构域和两个胞外结构域。第一胞外结构域内的51个氨基酸残基中的约8个与肺组织特异性cldn‑18同等型1(cldn18.1)不同，并可用作单克隆抗体结合的表位。71.在癌症的情况下，cldn18.2已被证明能参与肿瘤的发育和进展。实际上，cldn18.2已经被证明能展示在人胃癌细胞及其转移瘤的表面上(sahin，等人，“claudin‑18splicevariant2isapan‑cancertargetsuitablefortherapeuticantibodydevelopment,”clincancerres2008；14:7624‑34)，并且已在胰腺癌中观察到它的异位激活(woll，等人，“claudin18.2isatargetforimab362antibodyinpancreaticneoplasms,”intjcancer2014；134:731‑739；和tanaka，等人，“claudin‑18isanearly‑stagemarkerofpancreaticcarcinogenesis,”jhistochemcytochem2011；59:942‑952)。在胆管癌、食管癌、卵巢癌和肺癌中也观察到cldn18.2的异常激活，其与低的整体存活率和淋巴结转移相关(shinozaki，等人，“claudin‑18inbiliaryneoplasms.itssignificanceintheclassificationofintrahepaticcholangiocarcinoma,”virchowsarch2011；459:73‑80；和micke，等人.,“aberrantlyactivatedclaudin6and18.2aspotentialtherapytargetsinnon‑small‑celllungcancer,”intjcncer2014；135:2206‑2214)。72.在某些实施方案中，本文公开了抗‑cldn18.2抗体及其用途。在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体是嵌合抗体。在其他例子中，抗‑cldn18.2抗体是人源化抗体。在另外的例子中，本文公开了利用抗‑cldn18.2抗体的治疗方法和诱导细胞杀灭效应的方法。73.抗‑紧密连接蛋白18.2抗体74.在某些实施方案中，本文公开了抗‑紧密连接蛋白18.2(抗‑cldn18.2)抗体。在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体结合至cldn18.2的胞外结构域。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体结合至cldn18.2的第一胞外结构域。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体结合至cldn18.2的第一胞外结构域内的八个残基区域，例如人cldn18.2的残基32‑41(uniprotkb标识符p56856‑2)。在一些实施方案中，本文还描述了抗‑cldn18.2抗体，其包含位于翻译后修饰位点处的一种或多种突变，具有与参考抗‑cldn18.2抗体不同的功能特性，以及/或者具有针对cldn18.2的同等型的选择性。75.在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含比参考抗‑cldn18.2抗体的半数最大有效浓度(ec50)低的ec50。在一些例子中，参考抗体是175d10，其包含分别由seqidno:98和seqidno:99所示的重链(hc)序列和轻链(lc)序列。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体的ec50为约5nm或更低。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体的ec50为约4nm、约3nm、约2nm、约1nm、约0.5nm或更低。76.在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含相对于参考抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力更高的与cldn18.2的结合亲和力。在一些情况下，参考抗体是175d10，其包含分别由seqidno:98和seqidno:99所示的重链序列和轻链序列。77.在一些实施方案中，与参考抗‑cldn18.2抗体相比，本文所述的抗‑cldn18.2抗体具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。在一些情况下，参考抗体是175d10，其包含分别由seqidno:98和seqidno:99所示的重链序列和轻链序列。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体进一步包含位于fc区中的赋予增强的adcc的突变。78.在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含位于翻译后修饰位点处的至少一种突变。79.在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体特异性地结合至cldn18.2的同等型。在一些情况下，cldn18.2的同等型是在细胞系snu620中表达的同等型。80.在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含可变重链(vh)区和可变轻链(vl)区，其中vh区包含cdr1序列gfsltsyx1vx2；cdr2序列viwx3x4gx5tx6yx7x8x9lx10s；和cdr3序列dx11x12x13x14x15x16x17x18x19x20；其中x1选自n或g；x2选自y或h；x3选自n或p；x4选自t或g；x5选自a或n；x6选自r或n；x7选自n、q或e；x8选自s或i；x9选自t或a；x10选自k或m；x11选自s或r；x12选自a或r；x13选自m或l；x14选自p或a；x15选自a或m；x16选自i或d；x17选自p或y；x18存在或不存在，如果存在，则为f；x19存在或不存在，如果存在，则为a；并且x20存在或不存在，如果存在，则为y。81.在一些例子中，vh区包含cdr1序列x21x22x23x24x25sfgmh；cdr2序列yissgsx26x27iyyx28dx29x30kg；和cdr3序列ax31x32x33x34x35x36x37x38x39x40x41；其中x21存在或不存在，如果存在，则为g；x22存在或不存在，如果存在，则为f；x23存在或不存在，如果存在，则为t；x24存在或不存在，如果存在，则为f；x25存在或不存在，如果存在，则为s；x26选自s或g；x27选自p或s；x28选自v或a；x29选自k或t；并且x30选自l或v；x31选自g或t；x32选自y或s；x33选自a或y；x34选自v或y；x35选自r或y；x36选自n或g；x37选自a或n；x38选自l或a；x39选自d或l；x40选自y或e；并且x41存在或不存在，如果存在，则为y。82.在一些实施方案中，vh区包含选自表1的cdr1、cdr2和cdr3序列。[0083][0084]在一些例子中，vh区包含由seqidno:1组成的cdr1序列，cdr2序列viwntgatryx7sx9lks和由seqidno:3组成的cdr3序列，其中x7选自n、q或e；并且x9选自t或a。[0085]在一些例子中，vh区包含由seqidno:13组成的cdr1序列，cdr2序列viwpggntnyx7x8alms，和由seqidno:15组成的cdr3序列，其中x7选自n或e；并且x8选自s或i。[0086]在一些例子中，vh区包含选自seqidno:1、7、10或13的cdr1序列；选自seqidno:2、4、5、6、8、11、14、16或17的cdr2序列；和选自seqidno:3、9、12或15的cdr3序列。[0087]在一些例子中，vh区包含由seqidno:1组成的cdr1序列；选自seqidno:2、4、5或6的cdr2序列；和由seqidno:3组成的cdr3序列。[0088]在一些例子中，vh区包含由seqidno:13组成的cdr1序列；选自seqidno:14、16或17的cdr2序列；和由seqidno:15组成的cdr3序列。[0089]在一些例子中，vh区包含由seqidno:7组成的cdr1序列，由seqidno:8组成的cdr2序列，和由seqidno:9组成的cdr3序列。[0090]在一些例子中，vh区包含由seqidno:10组成的cdr1序列，由seqidno:11组成的cdr2序列，和由seqidno:12组成的cdr3序列。[0091]在一些实施方案中，vl区包含选自表2的cdr1、cdr2和cdr3序列。[0092][0093][0094]在一些例子中，vl区包含选自seqidno:18、21、24‑28、31‑35、38或39的cdr1序列；选自seqidno:19、22、29或36的cdr2序列；和选自seqidno:20、23、30或37的cdr3序列。[0095]在一些例子中，vl区包含选自seqidno:21或24‑27的cdr1序列；由seqidno:22组成的cdr2序列；和由seqidno:23组成的cdr3序列。[0096]在一些例子中，vl区包含选自seqidno:28或31‑34的cdr1序列；由seqidno:29组成的cdr2序列；和由seqidno:30组成的cdr3序列。[0097]在一些例子中，vl区包含选自seqidno:35、38或39的cdr1序列；由seqidno:36组成的cdr2序列；和由seqidno:37组成的cdr3序列。[0098]在一些例子中，vl区包含由seqidno:18组成的cdr1序列，由seqidno:19组成的cdr2序列，和由seqidno:20组成的cdr3序列。[0099]在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含cdr1序列gfsltsyx1vx2；cdr2序列viwx3x4gx5tx6yx7x8x9lx10s；和cdr3序列dx11x12x13x14x15x16x17x18x19x20；其中x1选自n或g；x2选自y或h；x3选自n或p；x4选自t或g；x5选自a或n；x6选自r或n；x7选自n、q或e；x8选自s或i；x9选自t或a；x10选自k或m；x11选自s或r；x12选自a或r；x13选自m或l；x14选自p或a；x15选自a或m；x16选自i或d；x17选自p或y；x18存在或不存在，如果存在，则为f；x19存在或不存在，如果存在，则为a；并且x20存在或不存在，如果存在，则为y；和vl区，所述vl区包含选自seqidno:18、35、38或39的cdr1序列；选自seqidno:19或36的cdr2序列；和选自seqidno:20或37的cdr3序列。[0100]在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含cdr1序列x21x22x23x24x25sfgmh；cdr2序列yissgsx26x27iyyx28dx29x30kg；和cdr3序列ax31x32x33x34x35x36x37x38x39x40x41；其中x21存在或不存在，如果存在，则为g；x22存在或不存在，如果存在，则为f；x23存在或不存在，如果存在，则为t；x24存在或不存在，如果存在，则为f；x25存在或不存在，如果存在，则为s；x26选自s或g；x27选自p或s；x28选自v或a；x29选自k或t；并且x30选自l或v；x31选自g或t；x32选自y或s；x33选自a或y；x34选自v或y；x35选自r或y；x36选自n或g；x37选自a或n；x38选自l或a；x39选自d或l；x40选自y或e；并且x41存在或不存在，如果存在，则为y；和vl区，所述vl区包含选自seqidno:21、24‑28或31‑34的cdr1序列；选自seqidno:22或29的cdr2序列；和选自seqidno:23或30的cdr3序列。[0101]在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含由seqidno:1组成的cdr1序列，cdr2序列viwntgatryx7sx9lks，和由seqidno:3组成的cdr3序列，其中x7选自n、q或e；并且x9选自t或a；和vl区，所述vl区包含由seqidno:18组成的cdr1序列，由seqidno:19组成的cdr2序列，和由seqidno:20组成的cdr3序列。[0102]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含由seqidno:13组成的cdr1序列，cdr2序列viwpggntnyx7x8alms，和由seqidno:15组成的cdr3序列，其中x7选自n或e；并且x8选自s或i；和vl区，所述vl区包含选自seqidno:35、38或39的cdr1序列；由seqidno:36组成的cdr2序列；和由seqidno:37组成的cdr3序列。[0103]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含选自seqidno:1、7、10或13的cdr1序列；选自seqidno:2、4、5、6、8、11、14、16或17的cdr2序列；和选自seqidno:3、9、12或15的cdr3序列；和vl区，所述vl区包含选自seqidno:18、21、24‑28、31‑35、38或39的cdr1序列；选自seqidno：19、22、29或36的cdr2序列；和选自seqidno:20、23、30或37的cdr3序列。[0104]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含由seqidno:1组成的cdr1序列；选自seqidno:2、4、5或6的cdr2序列；和由seqidno:3组成的cdr3序列；和vl区，所述vl区包含由seqidno:18组成的cdr1序列，由seqidno:19组成的cdr2序列，和由seqidno:20组成的cdr3序列。[0105]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含由seqidno:13组成的cdr1序列；选自seqidno:14、16或17的cdr2序列；和由seqidno:15组成的cdr3序列；和vl区，所述vl区包含选自seqidno:35、38或39的cdr1序列；由seqidno:36组成的cdr2序列；和由seqidno:37组成的cdr3序列。[0106]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含由seqidno:7组成的cdr1序列，由seqidno:8组成的cdr2序列，和由seqidno:9组成的cdr3序列；和vl区，所述vl区包含选自seqidno:21或24‑27的cdr1序列；由seqidno:22组成的cdr2序列；和由seqidno:23组成的cdr3序列。[0107]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体包含vh区，所述vh区包含由seqidno:10组成的cdr1序列，由seqidno:11组成的cdr2序列，和由seqidno:12组成的cdr3序列；和vl区，所述vl区包含选自seqidno:28或31‑34的cdr1序列；由seqidno:29组成的cdr2序列；和由seqidno:30组成的cdr3序列。[0108]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体是全长抗体或其结合片段。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体是嵌合抗体或其结合片段。在其他情况下，抗‑cldn18.2抗体是人源化抗体或其结合片段。在另外的情况下，抗‑cldn18.2抗体是单克隆抗体或其结合片段。[0109]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体包括单价fab'、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)，或骆驼科动物抗体或其结合片段。[0110]在一些例子中，抗‑cldn18.2抗体是双特异性抗体或其结合片段。示例性双特异性抗体形式包括但不限于旋钮入孔(kih)、不对称重新工程化技术‑免疫球蛋白(art‑ig)、triomab四价体瘤、双特异性单克隆抗体(bimab、bsmab、bsab、bsmab、bs‑mab或bi‑mab)、azymetric、由基于t细胞受体的抗体所致的双特异性衔接(beat)、双特异性t‑细胞衔接体(bite)、biclonics、fab‑scfv‑fc、二合一/双重作用fab(daf)、finomab、scfv‑fc‑(fab)‑融合、对接‑和‑锁定(dnl)、adaptir(先前称为scorpion)、串联双抗体(tandab)、双重‑亲和力‑重新靶向(dart)、纳米抗体、三体抗体、串联scfv(tafv)、三头、串联dab/vhh、三重dab/vhh，或四价dab/vhh。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体是双特异性抗体或其结合片段，其包含brinkmann和kontermann,“themakingofbispecificantibodies,”mabs9(2):182‑212(2017)的图2所例示的双特异性抗体形式。[0111]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含位于翻译后修饰位点处的突变。在一些例子中，突变位于vh区内。在其他情况下，突变位于vl区内。在另外的例子中，两种或更多种突变位于vh区、vl区或其组合内。[0112]在一些例子中，所述突变位于抗‑cldn18.2抗体的vh区的氨基酸位置60、61或62处，其中所述氨基酸位置对应于seqidno:40的位置60、61或62。在一些例子中，所述突变位于氨基酸位置60或61处，该氨基酸位置对应于seqidno:40的位置60或61。在一些例子中，所述突变位于氨基酸位置60或62处，该氨基酸位置对应于seqidno:40的位置60或62。在一些情况下，所述突变位于seqidno:40的氨基酸位置60(n60)或61(s61)处。在一些情况下，所述突变位于seqidno:40的氨基酸位置60(n60)或62(t62)处。在一些情况下，所述突变使抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力相对于参考抗体175d10增强。[0113]在一些例子中，所述突变位于抗‑cldn18.2抗体的vh区的氨基酸位置60、61或62处，其中所述氨基酸位置对应于seqidno:57的氨基酸位置60、61或62。在一些例子中，所述突变位于氨基酸位置60或61处，该氨基酸位置对应于seqidno:57的位置60或61。在一些例子中，所述突变位于氨基酸位置60或62处，该氨基酸位置对应于seqidno:57的位置60或62。在一些情况下，所述突变位于seqidno:57的氨基酸位置60(n60)或61(s61)处。在一些情况下，所述突变位于seqidno:57的氨基酸位置60(n60)或62(t62)处。在一些情况下，所述突变使抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力相对于参考抗体175d10增强。[0114]在一些例子中，氨基酸残基n60被突变为极性氨基酸或酸性氨基酸。在一些例子中，氨基酸残基n60被突变为选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的极性氨基酸。在一些例子中，氨基酸残基n60被突变为选自天门冬氨酸或谷氨酸的氨基酸。在一些情况下，氨基酸残基n60被突变为谷氨酰胺。在一些情况下，氨基酸残基n60被突变为谷氨酸。[0115]在一些例子中，氨基酸残基s61被突变为非极性残基，该非极性残基任选地选自丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些情况下，氨基酸残基s61被突变为异亮氨酸。[0116]在一些例子中，氨基酸残基t62被突变为非极性残基，该非极性残基任选地选自丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些情况下，氨基酸残基t62被突变为丙氨酸。[0117]在一些例子中，所述突变位于抗‑cldn18.2抗体的vl区的氨基酸位置31或32处，其中所述氨基酸位置对应于seqidno:46的位置31或32。在一些情况下，所述突变位于seqidno:46的氨基酸位置31(n31)或32(s32)处。在一些情况下，所述突变使抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力相对于参考抗体175d10增强。[0118]在一些例子中，所述突变位于抗‑cldn18.2抗体的vl区的氨基酸位置31或32处，其中所述氨基酸位置对应于seqidno:52的位置31或32。在一些情况下，所述突变位于seqidno:52的氨基酸位置31(n31)或32(s32)处。在一些情况下，所述突变使抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力相对于参考抗体175d10增强。[0119]在一些例子中，所述突变位于抗‑cldn18.2抗体的vl区的氨基酸位置31或32处，其中所述氨基酸位置对应于seqidno:60的位置31或32。在一些情况下，所述突变位于seqidno:60的氨基酸位置31(n31)或32(s32)处。在一些情况下，所述突变使抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力相对于参考抗体175d10增强。[0120]在一些情况下，氨基酸残基n31被突变为酸性氨基酸。在一些情况下，氨基酸残基n31被突变为天冬氨酸或谷氨酸。在一些情况下，氨基酸残基n31被突变为天冬氨酸。在一些情况下，氨基酸残基n31被突变为谷氨酸。[0121]在一些情况下，氨基酸残基s32被突变为非极性残基，该非极性残基任选地选自丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些情况下，氨基酸残基s32被突变为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。在一些情况下，氨基酸残基s32被突变为亮氨酸。在一些情况下，氨基酸残基s32被突变为缬氨酸。在一些情况下，氨基酸残基s32被突变为异亮氨酸。[0122]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含位于抗‑cldn18.2抗体的vh区的氨基酸位置60、61或62处的突变，其中所述氨基酸位置对应于seqidno:57的位置60、61或62；以及位于抗‑cldn18.2抗体的vl区的氨基酸位置31或32处的突变，其中所述氨基酸位置对应于seqidno:60的位置31或32。在一些例子中，所述突变位于氨基酸位置60或61处，该氨基酸位置对应于seqidno:57的位置60或61。在一些例子中，所述突变位于氨基酸位置60或62处，该氨基酸位置对应于seqidno:57的位置60或62。在一些情况下，所述突变位于seqidno:57的氨基酸位置60(n60)或61(s61)处。在一些情况下，所述突变位于seqidno:57的氨基酸位置60(n60)或62(t62)处。在一些情况下，所述突变位于seqidno:60的氨基酸位置31(n31)或32(s32)处。在一些情况下，所述突变使抗‑cldn18.2抗体的结合亲和力相对于参考抗体175d10增强。[0123]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体是嵌合抗体或其结合片段。在一些例子中，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:40‑43的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:44的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些情况下，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:45的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:46‑50的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些情况下，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:51的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:52‑56的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些情况下，嵌合抗体或其结合片段包含含有与seqidno:57‑59的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:60‑62的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。[0124]在一些实施方案中，嵌合抗‑cldn18.2抗体的vh区和vl区在表3中例示出。带下划线的区域表示相应的cdr1、cdr2或cdr3序列。[0125][0126][0127][0128]在一些情况下，嵌合抗体或其结合片段进一步包含含有与seqidno:63的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的ch区，以及含有与seqidno:64的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的cl区。在一些情况下，嵌合抗体或其结合片段包含如表4所列的ch区和cl区。[0129][0130]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体是人源化抗体或其结合片段。在一些例子中，人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:65‑68的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:69‑73的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些例子中，人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:74‑76的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:77‑80的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些例子中，人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:81‑84的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:85‑88的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。在一些例子中，人源化抗体或其结合片段包含含有与seqidno:89‑92的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vh区，以及含有与seqidno:93‑97的至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的vl区。[0131]在一些实施方案中，人源化抗‑cldn18.2抗体的vh区和vl区在表5中例示出。加下划线区表示相应的cdr1、cdr2或cdr3序列。[0132][0133][0134][0135][0136]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含如表6所例示出的vh区和vl区。[0137][0138]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含如表7所例示出的vh区和vl区。[0139][0140][0141]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含如表8所例示出的vh区和vl区。[0142][0143][0144]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含如表9所例示出的vh区和vl区。[0145][0146]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体包含选自igm、igg(如，igg1、igg2、igg3或igg4)、iga或ige的框架区。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体包含igm框架。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体包含igg(如，igg1、igg2、igg3或igg4)框架。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体包含igg1框架。在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体包含igg2框架。[0147]在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体包含位于框架区中(例如，位于ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域、铰链区或其组合中)的一种或多种突变。在一些情况下，所述一种或多种突变调节fc受体相互作用，例如以增加fc效应细胞功能，诸如adcc和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。在一些情况下，所述一种或多种突变稳定抗体和/或增加抗体的半衰期。在另外的情况下，所述一种或多种突变调节糖基化。[0148]在一些实施方案中，fc区包含调节fc受体相互作用以例如增强效应细胞功能(诸如adcc和/或cdc)的一种或多种突变。在此类例子中，当被突变时调节效应细胞功能的示例性残基包括s239、f243、r292、y300、v305、p396、k326、a330、i332或e333，其中该残基位置对应于igg1，且残基编号遵照kabat编号(kabat等人,1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu索引)。在一些例子中，所述一种或多种突变包括s239d、f243l、r292p、y300l、v305i、p396l、k326w、a330l、i332e、e333a、e333s或其组合。在一些情况下，所述一种或多种突变包括s239d、i332e或其组合。在一些情况下，所述一种或多种突变包括f243l、r292p、y300l、v305i、p396l、i332e或其组合。在一些情况下，所述一种或多种突变包括s239d、a330l、i332e或其组合。在一些情况下，所述一种或多种突变包括k326w、e333s或其组合。在一些情况下，所述突变包括e333a。[0149]在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体与参考抗体175d10共享结合表位。[0150]在一些情况下，抗‑cldn18.2抗体具有与小鼠和食蟹猴cldn18.2蛋白的交叉结合活性。[0151]抗体生产[0152]在一些实施方案中，根据标准方案通过向生产动物注射抗原组合物来培育抗‑cldn18.2抗体。参见，如harlow和lane,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,1988。当利用整个蛋白质或蛋白质的较大部分时，可以通过用该蛋白质和适合的佐剂(如弗氏、弗氏完全、水包油乳剂等)免疫生产动物来培育抗体。当利用较小的肽时，将肽与较大的分子缀合以制备免疫刺激性缀合物是有利的。可商购用于这种用途的常用缀合蛋白包括牛血清白蛋白(bsa)和钥孔戚血蓝素(klh)。为了培育针对特定表位的抗体，可以利用源自全序列的肽。替代地，为了产生针对蛋白质靶标的相对短的肽部分的抗体，如果多肽与诸如卵清蛋白、bsa或klh的运载体(carrier)蛋白联接，则可以引发优越的免疫响应。[0153]多克隆或单克隆抗‑cldn18.2抗体可以从被遗传改造成产生人免疫球蛋白的动物中产生。可以通过首先产生不产生动物天然抗体的“敲除”动物，并用人抗体基因座稳定转化(例如，通过利用人类人工染色体来稳定转化)该动物来产生转基因动物。在此类情况下，该动物只会产生人抗体。用于产生此类动物并从中获得抗体的技术描述于美国专利第6,162,963号和第6,150,584号中，该美国专利通过引用整体并入本文。此类抗体可以称为人异种抗体。[0154]替代地，可以从含有人可变区的噬菌体文库产生抗‑cldn18.2抗体。参见，美国专利号6,174,708，其通过引用全部并入本文。[0155]在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗‑cldn18.2抗体是由杂交瘤产生的。[0156]对于单克隆抗‑cldn18.2抗体，杂交瘤可通过分离受刺激的免疫细胞(诸如来自被接种动物的脾脏的免疫细胞)而形成。然后可以使这些细胞与能够在细胞培养物中无限期复制的永生化细胞(诸如骨髓瘤细胞或转化的细胞)融合，从而产生永生的分泌免疫球蛋白的细胞系。所利用的永生细胞系可被选择为缺乏利用某些营养物所必需的酶。许多这样的细胞系(诸如骨髓瘤)是本领域技术人员已知的，并且包括例如：胸苷激酶(tk)或次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hgprt)。这些缺陷使得能够根据融合细胞在例如次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷培养基(hat)上生长的能力来选择融合细胞。[0157]另外，抗‑cldn18.2抗体可以通过遗传工程化来产生。[0158]本文公开的抗‑cldn18.2抗体在人中诱导不期望的免疫响应(例如过敏性休克)的倾向可能会降低，并且也可能会表现出触发将会阻止抗体治疗剂或显像剂的重复用药的免疫响应(如，人‑抗‑鼠‑抗体“hama”响应)的倾向降低。此类抗‑cldn18.2抗体包括但不限于人源化、嵌合或异种人抗‑cldn18.2抗体。[0159]嵌合抗‑cldn18.2抗体可以例如通过重组手段，通过将从鼠(或其他动物来源的)杂交瘤克隆中获得的鼠可变轻链区和重链区(vk和vh)与人恒定轻链区和重链区组合以产生主要具有人结构域的抗体来制备。此类嵌合抗体的产生在本领域中是众所周知的，并且可以通过标准手段(如，例如美国专利第5,624,659号中所述的，其通过引用整体并入本文)来实现。[0160]如运用于非人类(如啮齿动物或灵长类动物)抗体的术语“人源化”是含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的混合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。在大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(cdr)的残基被来自诸如小鼠、大鼠、兔或灵长类动物的非人物种(供者抗体)的具有期望特异性、亲和力和能力的cdr的残基替代。在一些例子中，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在受者抗体或输入的cdr或框架序列中均未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步完善和优化抗体性能，并最大程度地降低在被引入到人身体中时的免疫原性。在一些实例中，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本所有的fr区为人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分。[0161]人源化抗体可被工程化为含有人样免疫球蛋白结构域，并且仅掺有动物源性抗体的互补决定区。这可以通过仔细检查单克隆抗原结合单元或单克隆抗体的可变区的高变环的序列，并使它们与人抗原结合单元或人抗体链的结构相适应来实现。参见，如美国专利no.6,187,287，其通过引用整体并入本文。[0162]用于使非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。“人源化”抗体是这样的抗体，其中的至少部分序列已经从其初始形式被改变成更像人免疫球蛋白。在一些型式中，重(h)链和轻(l)链恒定(c)区被人序列替代。这可以是包含可变(v)区和异源免疫球蛋白c区的融合多肽。在一些型式中，互补决定区(cdr)包含非人抗体序列，而v框架区也已被转化为人序列。参见例如ep0329400。在一些型式中，v区通过设计人和小鼠v区的共有序列，并转化在cdr外部的在共有序列之间不同的残基来人源化。[0163]原则上，来自人源化抗体的框架序列可以用作cdr移植的模板；然而，已经证明直接将cdr替换到这种框架中可能会导致与抗原的结合亲和力显著损失。glaser等人(1992)j.immunol.149:2606；tempest等人(1992)biotechnology9:266；和shalaby等人(1992)j.exp.med.17:217。人抗体(huab)与原始鼠抗体(muab)的同源性越高，人框架向鼠cdr中引入可能会降低亲和力的畸变的可能性就越小。基于针对抗体序列数据库的序列同源性搜索，huabic4与mum4ts.22具有良好的框架同源性，但是其他高度同源的huab也是适合的，尤其是来自人亚类i的κl链或来自人亚类iii的h链。kabat等人(1987)。各种计算机程序诸如encad(levitt等人(1983)j.mol.biol.168:595)可用于预测v区的理想序列。因此，本发明涵盖了具有不同可变(v)区的huab。确定适合的v区序列并优化这些序列在本领域技术人员的能力范围内。用于获得具有降低的免疫原性的抗体的方法也描述在美国专利第5,270,202号和第ep699,755号中。[0164]可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员熟悉的。可获得例示并展示了选定候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入序列中选择出fr残基并加以组合，从而获得所需的抗体特征，诸如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。[0165]主题抗原结合单元的人源化过程可以如下。基于用于移植的人抗体种系的同源性、规范结构和物理特性，选择出最适合的种系受体重链和轻链可变区。对mvh/vl与移植的hvh/vl进行计算机建模，并生成原型人源化抗体序列。如果建模表明需要框架反向突变，则生成具有指示的fw改变的第二变异体。合成编码所选种系框架和鼠cdr的dna片段。将合成的dna片段亚克隆到igg表达载体中，并通过dna测序来确认序列。使人源化抗体在诸如293f的细胞中表达，并且例如在mdm吞噬作用测定法和抗原结合测定法中测试该蛋白质。例如通过在表达靶抗原的细胞上的facs，将人源化抗原结合单元与亲本抗原结合单元在抗原结合亲和力上进行比较。如果该亲和力比亲本抗原结合单元低大于2倍，则可以如上所述的那样产生和测试第二轮人源化变异体。[0166]如上所指出的，抗‑cldn18.2抗体可以是“单价”或“多价”的。前者每个抗原结合单元具有一个结合位点，而后者含有能够结合至多于一种相同或不同种类抗原的多个结合位点。根据结合位点的数目，抗原结合单元可以是二价的(具有两个抗原结合位点)、三价的(具有三个抗原结合位点)、四价的(具有四个抗原结合位点)，以此类推。[0167]多价抗‑cldn18.2抗体可基于其结合特异性进一步分类。“单特异性”抗‑cldn18.2抗体是能够结合至一种或多种相同种类抗原的分子。“多特异性”抗‑cldn18.2抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的分子。尽管此类分子正常情况下将仅结合两种不同的抗原(即双特异性抗‑cldn18.2抗体)，但是当该表述在本文中使用时，其涵盖具有另外的特异性的抗体(如三特异性抗体)。本公开进一步提供了多特异性抗‑cldn18.2抗体。多特异性抗‑cldn18.2抗体是能够结合至至少两种不同抗原的多价分子，如分别对两种和三种不同抗原表现出结合特异性的双特异性和三特异性分子。[0168]多核苷酸和载体[0169]在一些实施方案中，本公开提供了编码本文公开的任何抗‑cldn18.2抗体的经分离的核酸。在另一个实施方案中，本公开提供了包含编码本文公开的任何抗‑cldn18.2抗体的核酸序列的载体。在一些实施方案中，本发明提供了编码本文公开的抗‑cldn18.2抗体的轻链cdr和重链cdr的经分离的核酸。[0170]可以通过重组dna技术、合成化学技术或其组合来制备主题抗‑cldn18.2抗体。例如，通常使用本领域已知的标准分子技术，将编码抗‑cldn18.2抗体的所需组分的序列(包括轻链cdr和重链cdr)组装克隆至表达载体中。这些序列可以从编码所需蛋白质序列的其他载体、使用各自的模板核酸从pcr产生的片段，或通过编码所需序列的合成寡核苷酸的组装来组装。表达系统可以通过用包含目标抗‑cldn18.2抗体的表达载体转染适合的细胞来创建。[0171]与现有抗体的轻链或重链的各个区域相对应的核苷酸序列可以容易地使用常规技术来获得和测序，所述常规技术包括但不限于杂交、pcr和dna测序。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞用作抗体核苷酸序列的优选来源。可以从公共或私人储库获得巨大数量的产生单克隆抗体阵列的杂交瘤细胞。最大的保藏代理是美国典型培养物保藏中心(atcc.org)，其提供了多种良好表征的杂交瘤细胞系。替代地，抗体核苷酸可以从免疫或未免疫的啮齿动物或人获得，并形成器官，诸如脾脏和外周血淋巴细胞。适用于提取和合成抗体核苷酸的特定技术描述于orlandi等人(1989)proc.natl.acad.sci.u.s.a86:3833‑3837；larrick等人(1989)biochem.biophys.res.commun.160:1250‑1255；sastry等人(1989)proc.natl.acad.sci.,u.s.a.86:5728‑5732；和美国专利号5,969,108中。[0172]编码抗‑cldn18.2抗体的多核苷酸也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源非人序列来进行修饰。以这种方式，制备了保留原始抗‑cldn18.2抗体的结合特异性的嵌合抗体。[0173]还应理解，本公开中实施的多核苷酸包括编码示例性多肽的功能等效物及其片段的那些。功能上等效的多肽包括增强、降低或不显著影响由此编码的多肽的特性的那些。功能等效物可以是具有保守氨基酸取代的多肽，包括融合物的类似物，和突变体。[0174]由于遗传密码的简并性，抗原结合单元编码序列以及适合于构建本发明的多核苷酸和载体的序列的核苷酸可能有相当大的变化。序列变异体可以具有经修饰的dna或氨基酸序列，一种或多种取代、缺失或添加，其净效应是保留所需的抗原结合活性。例如，可以在编码区中制造既不改变编码的氨基酸也不导致保守的变化的各种取代。这些取代被涵盖在本发明中。保守性氨基酸取代包括在以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。尽管保守取代确实有效地改变了要产生的多肽中所含的一个或多个氨基酸残基，但是预期该取代不会干扰所得要产生的抗原结合单元的抗原结合活性。不改变编码的氨基酸残基的核苷酸取代可用于优化不同系统中的基因表达。适合的取代是本领域技术人员已知的，并且进行了适合的取代，例如以反映表达系统中优选的密码子用法。[0175]在需要时，重组多核苷酸可包含有助于检测基因产物的表达和纯化的异源序列。此类序列的实例是本领域已知的，并且包括编码报告蛋白(如β‑半乳糖苷酶、β‑内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(cat)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)及其衍生物)的序列。其他有助于纯化的异源序列可以编码诸如以下的表位：myc，ha(源自流感病毒血凝素)，his‑6，flag，或免疫球蛋白、谷胱甘肽s‑转移酶(gst)和麦芽糖结合蛋白(mbp)的fc部分。[0176]本文公开的多核苷酸可以缀合至各种各样的上述化学功能部分。常用的部分包括能够产生可检测信号的标记、信号肽、增强免疫反应性的剂、促进与固体支持物偶联的剂、疫苗运载体、生物响应修饰剂、顺磁性标记和药物。所述部分可以是重组地或通过本领域已知的其他方式共价连接的多核苷酸。[0177]本文公开的多核苷酸可以包含另外的序列，诸如同一转录单元内的另外的编码序列，控制元件(诸如启动子、核糖体结合位点和聚腺苷酸化位点)，处于相同或不同启动子控制下的另外的转录单元，允许宿主细胞的克隆、表达和转化的序列，以及提供本发明实施方案可能需要的任何此类构建体。[0178]可以使用化学合成、重组克隆方法、pcr或其任何组合获得本文公开的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是本领域众所周知的，并因此在本文中无需详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列数据来通过采用dna合成仪或从商业服务处订购获得所需的多核苷酸。[0179]可以将包含所需序列的多核苷酸插入到适合的载体中，进而可将该载体引入到适合的宿主细胞中以进行复制和扩增。因此，本文考虑了包含一种或多种上述多核苷酸的各种各样的载体。还提供了表达载体的可选择文库，其包含至少一种编码本文公开的抗‑cldn18.2抗体的载体。[0180]载体一般包含表达抗原结合单元所需的转录或翻译控制序列。适合的转录或翻译控制序列包括但不限于复制起点，启动子，增强子，阻遏物结合区，转录起始位点，核糖体结合位点，翻译起始位点和用于转录和翻译的终止位点。[0181]启动子的选择将在很大程度上取决于引入载体的宿主细胞。也可以利用通常与所需的轻链或重链基因相关的启动子，前提是此类控制序列与宿主细胞系统相容。也可以使用细胞特异性或组织特异性启动子。本领域技术人员已经描述并采用了巨大量的多样的组织特异性启动子。在选择性动物细胞中可操作的示例性启动子包括肝细胞特异性启动子和心肌特异性启动子。根据受者细胞类型的选择，本领域技术人员将知道可适用于构建本发明表达载体的其他适合的细胞特异性或组织特异性启动子。[0182]使用已知的分子克隆或基因工程技术，可以将适当的转录控制序列、增强子、终止子或本领域已知的任何其他遗传元件以操作关系整合，任选地另外与根据本发明表达的完整的可选择融合基因一起整合。除了上述元件之外，载体还可以含有可选择标记(例如，编码用该载体转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质的基因)，但是此种标记基因可以被携带在共同引入到宿主细胞中的另一个核苷酸序列上。[0183]本文所述的多核苷酸和载体具有几种特定用途。它们可用于例如在表达系统中产生抗原结合单元。此类多核苷酸可用作实现所需多核苷酸扩增的引物。此外，多核苷酸还可用于包括疫苗、诊断剂和药物在内的药物组合物中。[0184]宿主细胞尤其可以用作主题多核苷酸的储库，用作载体，或者用作用于基于所需抗‑cldn18.2抗体的抗原结合特异性产生和筛选所述抗‑cldn18.2抗体的媒介物。[0185]因此，本公开提供了鉴定与所需抗原具有免疫反应性的抗‑cldn18.2抗体的方法。此类方法可以涉及以下步骤：(a)制备抗‑cldn18.2抗体的遗传多样性文库，其中所述文库包含至少一种主题抗‑cldn18.2抗体；(b)使抗‑cldn18.2抗体的文库与所需抗原接触；(c)检测抗‑cldn18.2抗体与抗原之间的特异性结合，从而鉴定与所需抗原具有免疫反应性的抗‑cldn18.2抗体。[0186]抗‑cldn18.2抗体特异性地结合至所需抗原的能力可以通过本领域充分确立的各种各样的程序来测试。参见harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork；gherardi等人(1990)j.immunol.meth.126:61‑68。通常，可以通过免疫测定法，例如通过使标记的抗‑cldn18.2抗体与固定在固体支持物或衬底上的抗原反应来直接检测表现出所需结合特异性的抗‑cldn18.2抗体。一般来说，用在免疫测定过程中展现出低水平的非特异性结合的材料来制备抗原粘附在其上的衬底。示例性固体支持物由一种或多种以下类型的材料制成：塑料聚合物、玻璃、纤维素、硝化纤维素、半导体材料和金属。在一些实例中，衬底是培养皿、色谱珠、磁性珠等。[0187]对于这样的固相测定法，未反应的抗‑cldn18.2抗体通过洗涤除去。但是，在液相测定法中，未反应的抗‑cldn18.2抗体是通过其他一些分离技术(诸如过滤或色谱法)去除的。在将抗原与标记的抗‑cldn18.2抗体结合后，确定被结合的标记的量。这种技术的变化形式是竞争性测定法，其中抗原被原始结合分子结合至饱和。当将主题抗‑cldn18.2抗体群体引入到复合物中时，只有表现出更高结合亲和力的那些才能够竞争，并从而保持与抗原的结合。[0188]替代地，与给定抗原的特异性结合可以通过细胞分选来评估，所述细胞分选涉及将所需抗原呈递在待分选的细胞上，然后用与可检测剂偶联的抗‑cldn18.2抗体标记靶细胞，然后在细胞分选仪中将标记的细胞与未标记的细胞分离。精细的细胞分离方法是荧光激活的细胞分选(facs)。使以细流形式排成单列行进的细胞通过激光束，然后测量被荧光标记的抗‑cldn18.2抗体结合的每个细胞的荧光。[0189]洗脱的抗‑cldn18.2抗体的后续分析可能涉及蛋白质测序，以描绘轻链和重链的氨基酸序列。基于推导的氨基酸序列，然后可以通过重组克隆方法获得编码抗‑cldn18.2抗体的cdna，所述重组克隆方法包括pcr、文库筛选、现有核酸数据库中的同源性搜索，或其任何组合。常用的数据库包括但不限于genbank、embl、ddbj、pdb、swiss‑prot、est、sts、gss和htgs。[0190]当抗‑cldn18.2抗体的文库展示在噬菌体或细菌颗粒上时，优选使用亲和色谱法进行选择。该方法通常以将噬菌体抗‑cldn18.2抗体的文库与抗原包被的板、柱基质、细胞结合或者与溶液中的生物素化抗原结合，然后捕获来进行。洗涤与固相结合的噬菌体或细菌，然后将其用可溶性半抗原、酸或碱洗脱。替代地，可使用渐增浓度的抗原来使抗‑cldn18.2抗体与亲和基质解离。对于对抗原具有极高亲和力或亲合力的某些抗‑cldn18.2抗体而言，如wo92/01047中所述，有效洗脱可能需要高ph或温和的还原溶液。[0191]选择的效率可能取决于数个因素的组合，所述因素包括洗涤过程中的解离动力学，以及单个噬菌体或细菌上的多种抗‑cldn18.2抗体是否可以同时与固体支持物上的抗原结合。例如，具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可通过利用短时间洗涤、多价展示以及高的抗原在固体支持物上的包被密度来保留。相反，具有缓慢解离动力学(和良好的结合亲和力)的抗‑cldn18.2抗体的选择可通过利用长时间洗涤、单价噬菌体以及低的抗原包被密度来促进。[0192]需要时，可以针对不相关的抗原预先选择抗‑cldn18.2抗体文库，以反选不需要的抗体。还可以针对相关抗原预先选择文库，以分离出例如抗独特型抗体。[0193]宿主细胞[0194]在一些实施方案中，本公开提供了表达本文公开的任一种抗‑cldn18.2抗体的宿主细胞。主题宿主细胞通常包含编码本文公开的任一种抗‑cldn18.2抗体的核酸。[0195]本发明提供了用上述多核苷酸、载体或载体文库转染的宿主细胞。载体可以通过许多适当的方式中的任一种来引入到适合的原核或真核细胞中，所述方式包括电穿孔，微粒轰击；脂质转染，感染(其中载体偶联至感染因子)，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae‑葡聚糖或其他物质进行的转染。用于引入载体的方式的选择往往取决于宿主细胞的特征。[0196]对于大多数动物细胞而言，任何上面提及的方法都适合于载体递送。优选的动物细胞是能够大量如以毫克水平表达外源引入的基因产物的脊椎动物细胞，优选哺乳动物细胞。优选细胞的非限制性实例是nih3t3细胞、cos、hela和cho细胞。[0197]一旦被引入到适合的宿主细胞中，抗‑cldn18.2抗体的表达就可以使用本领域已知的任何核酸或蛋白质测定法来确定。例如，轻链cdr或重链cdr或者抗‑cldn18.2抗体的转录mrna的存在可以通过常规杂交测定(如northern印迹分析)、扩增程序(如rt‑pcr)、sage(美国专利号5,695,937)和基于阵列的技术(参见例如美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934)使用与编码抗‑cldn18.2抗体的多核苷酸的任何区域互补的探针来检测和/或定量。[0198]载体的表达也可以通过检查表达的抗‑cldn18.2抗体来确定。本领域有多种技术可用于蛋白质分析。它们包括但不限于放射免疫测定、elisa(酶联免疫放射测定)、“三明治”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定和sds‑page。[0199]有效载荷[0200]在一些实施方案中，本文所述的抗‑cldn18.2抗体进一步缀合至有效载荷。在一些例子中，有效载荷直接缀合至抗‑cldn18.2抗体。在其他例子中，有效载荷经由接头间接缀合至抗‑cldn18.2抗体。在一些情况下，有效负载包括小分子、蛋白质或其功能片段、肽或核酸聚合物。[0201]在一些情况下，缀合至抗‑cldn18.2抗体的有效载荷的数量(例如，药物与抗体比率或dar)为约1:1，即一个有效载荷对应于一个抗‑cldn18.2抗体。在一些情况下，有效载荷与抗‑cldn18.2抗体的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。在一些情况下，有效载荷与抗‑cldn18.2抗体的比率为约2:1。在一些情况下，有效载荷与抗‑cldn18.2抗体的比率为约3:1。在一些情况下，有效载荷与抗‑cldn18.2抗体的比率为约4:1。在一些情况下，有效负载与抗‑cldn18.2抗体的比率为约6:1。在一些情况下，有效载荷与抗‑cldn18.2抗体的比率为约8:1。在一些情况下，有效载荷与抗‑cldn18.2抗体的比率为约12:1。[0202]在一些实施方案中，有效载荷为小分子。在一些例子中，所述小分子是细胞毒性有效载荷。示例性细胞毒性有效载荷包括但不限于微管破坏剂、dna修饰剂或akt抑制剂。[0203]在一些实施方案中，有效载荷包括微管破坏剂。示例性微管破坏剂包括但不限于2‑甲氧基雌二醇、澳瑞他汀、查尔酮、秋水仙碱、康普瑞汀、念珠藻素、迪科他汀、圆皮海绵内酯、多拉他汀、艾槽塞洛素(eleutherobin)、埃博霉素、软海绵素、劳利玛利德、美登素、诺斯卡品(noscapinoid)、紫杉醇、派洛西德、方莫新(phomopsin)、鬼臼毒素、利索新、海绵他汀、紫杉烷、托布来新、长春花生物碱、长春瑞滨，或其衍生物或类似物。[0204]在一些实施方案中，托布来新是托布来新类似物或衍生物，诸如美国专利号8580820和8980833及美国公开号20130217638、20130224228和201400363454中所描述的托布来新类似物或衍生物。[0205]在一些实施方案中，美登素是类美登素。在一些实施方案中，类美登素是dm1、dm4或安丝菌素。在一些实施方案中，类美登素是dm1。在一些实施方案中，类美登素是dm4。在一些实施方案中，类美登素是安丝菌素。在一些实施方案中，类美登素是类美登素衍生物或类似物，诸如美国专利号5208020、5416064、7276497和6716821或美国公布号2013029900和us20130323268中所描述的类美登素衍生物或类似物。[0206]在一些实施方案中，有效载荷是多拉他汀或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，多拉他汀是多拉他汀10或多拉他汀15，或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，多拉他汀10类似物是澳瑞他汀(auristatin)、索博列多汀(soblidotin)、新罗他汀(symplostatin)1或新罗他汀3。在一些实施方案中，多拉他汀15类似物是西马多汀(cemadotin)或塔斯多汀(tasidotin)。[0207]在一些实施方案中，多拉他汀10类似物是澳瑞他汀或澳瑞他汀衍生物。在一些实施方案中，澳瑞他汀或澳瑞他汀衍生物是澳瑞他汀e(ae)、澳瑞他汀f(af)、澳瑞他汀e5‑苯甲酰基戊酸酯(aevb)、单甲基澳瑞他汀e(mmae)、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)或单甲基澳瑞他汀d(mmad)、澳瑞他汀pe或澳瑞他汀pye。在一些实施方案中，澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀e(mmae)。在一些实施方案中，澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀f(mmaf)。在一些实施方案中，澳瑞他汀是澳瑞他汀衍生物或类似物，诸如美国专利号6884869、7659241、7498298、7964566、7750116、8288352、8703714和8871720中所描述的澳瑞他汀衍生物或类似物。[0208]在一些实施方案中，有效载荷包括dna修饰剂。在一些实施方案中，dna修饰剂包括dna切割剂、dna嵌入剂、dna转录抑制剂或dna交联剂。在一些例子中，dna切割剂包括博来霉素a2、加利车霉素，或其衍生物或类似物。在一些例子中，dna嵌入剂包括多柔比星、表柔比星、pnu‑159682、倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯并苯并二氮杂寡霉素c、道诺霉素、戊柔比星、托泊替康，或其衍生物或类似物。在一些例子中，dna转录抑制剂包括更生霉素。在一些例子中，dna交联剂包括丝裂霉素c。[0209]在一些实施方案中，dna修饰剂包括安吖啶、蒽环类药物、喜树碱、多柔比星、倍癌霉素、烯二炔、依托泊苷、吲哚啉并苯并二氮杂纺锤菌素、替尼泊苷，或其衍生物或类似物。[0210]在一些实施方案中，蒽环类药物是多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素‑c、更生霉素、光神霉素、奈莫柔比星、匹杉琼、沙柔比星或戊柔比星。[0211]在一些实施方案中，喜树碱的类似物是托泊替康、伊立替康、希拉替康、蔻西替康、依喜替康、勒托替康、吉马替康、贝洛替康、鲁比替康或sn‑38。[0212]在一些实施方案中，倍癌霉素是倍癌霉素a、倍癌霉素b1、倍癌霉素b2、倍癌霉素c1、倍癌霉素c2、倍癌霉素d、倍癌霉素sa，或cc‑1065。在一些实施方案中，烯二炔是加利车霉素、埃斯佩拉霉素(esperamicin)，或达内霉素(dynemicin)a。[0213]在一些实施方案中，吡咯并苯并二氮杂是氨茴霉素、阿贝霉素(abbeymycin)、奇卡霉素(chicamycin)、dc‑81、甲基氨茴霉素(mazethramycin)、新茴霉素(neothramycins)a、新茴霉素b、普罗茴霉素(porothramycin)、普拉卡素(prothracarcin)、西班米星(sibanomicin)(dc‑102)、西伯利亚霉素(sibiromycin)或茅层霉素(tomaymycin)。在一些实施方案中，吡咯并苯并二氮杂是茅层霉素衍生物，诸如美国专利号8404678和8163736中所描述的茅层霉素衍生物。在一些实施方案中，吡咯并苯并二氮杂如美国专利号8426402、8802667、8809320、6562806、6608192、7704924、7067511、us7612062、7244724、7528126、7049311、8633185、8501934和8697688和美国公布号us20140294868中所述。[0214]在一些实施方案中，吡咯并苯并二氮杂是吡咯并苯并二氮杂二聚体。在一些实施方案中，pbd二聚体是对称二聚体。对称pbd二聚体的实例包括但不限于sjg‑136(sg‑2000)、zc‑423(sg2285)、sjg‑720、sjg‑738、zc‑207(sg2202)和dsb‑120(表2)。在一些实施方案中，pbd二聚体是不对称二聚体。不对称pbd二聚体的实例包括但不限于sjg‑136衍生物，诸如美国专利号8697688和9242013和美国公布号20140286970中所描述的sjg‑136衍生物。[0215]在一些实施方案中，有效载荷包括akt抑制剂。在一些情况下，akt抑制剂包括依帕他塞(ipatasertib)(gdc‑0068)或其衍生物。[0216]在一些实施方案中，有效载荷包括聚合酶抑制剂，包括但不限于聚合酶ii抑制剂，诸如a‑阿马尼汀(a‑amanitin)和聚(adp‑核糖)聚合酶(parp)抑制剂。示例性parp抑制剂包括但不限于依尼帕尼(bsi201)、他拉唑帕尼(bmn‑673)、奥拉帕尼(azd‑2281)、奥拉帕尼、卢卡帕尼(ag014699,pf‑01367338)、维利帕尼(abt‑888)、cep9722、mk4827、bgb‑290或3‑氨基苯甲酰胺。[0217]在一些实施方案中，有效载荷包括可检测部分。示例性可检测部分包括荧光染料；酶；底物；化学发光部分；特异性结合部分，诸如链霉亲和素、亲合素或生物素；或放射性同位素。[0218]在一些实施方案中，有效载荷包括免疫调谐剂(immunomodulatoryagent)。有用的免疫调谐剂包括阻止激素对肿瘤起作用的抗激素药(anti‑hormone)和抑制细胞因子产生、下调自身抗原表达或掩盖mhc抗原的免疫抑制剂。代表性抗激素药包括抗雌激素药，包括例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)‑咪唑、4‑羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、ly117018、奥那司酮(onapnstone)和托瑞米芬；和抗雄激素药，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和抗肾上腺剂。示例性免疫抑制剂包括但不限于2‑氨基‑6‑芳基‑5‑取代的嘧啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、溴隐亭(bromocryptine)、达那唑、氨苯砜、戊二醛、mhc抗原和mhc片段的抗‑独特型抗体、环孢菌素a、类固醇(诸如糖皮质类固醇)、链球菌激酶或雷帕霉素。[0219]在一些实施方案中，有效载荷包括免疫调节剂(immunemodulator)。示例性免疫调节剂包括但不限于更昔洛韦(gancyclovier)、依那西普、他克莫司、西罗莫司、沃罗孢素(voclosporin)、环孢菌素、雷帕霉素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯(mycophenolgatemofetil)、甲氨蝶呤(methotrextrate)、糖皮质激素及其类似物、黄嘌呤、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、肿瘤坏死因子(tnf)(如，tnfα)、白介素(如，白介素‑1(il‑1)、il‑2、il‑3、il‑6、il‑10、il‑12、il‑18和il‑21)、集落刺激因子(如，粒细胞‑集落刺激因子(g‑csf)和粒细胞巨噬细胞‑集落刺激因子(gm‑csf))、干扰素(如，干扰素‑α、干扰素‑β、干扰素‑γ)、称为“s1因子”的干细胞生长因子、促红细胞生成素和血小板生成素，或其组合。[0220]在一些实施方案中，有效载荷包括免疫毒素。免疫毒素包括但不限于蓖麻毒素、放射性核素、商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素a、白喉毒素、蓖麻毒素a链、真菌毒素(诸如局限曲菌素(restrictocin))和磷脂酶。一般参见“chimerictoxins,”olsnes和pihl,pharmac.ther.15:355‑381(1981)；和“monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,”baldwin和byers编辑,第159‑179、224‑266页，academicpress(1985)。[0221]在一些例子中，有效载荷包括核酸聚合物。在此类例子中，核酸聚合物包括短干扰核酸(sina)、短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)、反义寡核苷酸。在其他例子中，核酸聚合物包括编码例如细胞毒性蛋白或肽或者凋亡触发蛋白或肽的mrna。示例性细胞毒性蛋白或肽包括细菌细胞毒素，诸如形成α孔的毒素(如，来自大肠杆菌的细胞溶素a)、形成β孔的毒素(如，α‑溶血素、pvl‑潘通瓦伦丁杀白细胞素(pantonvalentineleukocidin)、气溶素、梭菌ε毒素、产气荚膜梭菌肠毒素)、二元毒素(炭疽毒素、浮肿毒素、肉毒梭菌c2毒素、螺旋梭菌毒素、产气荚膜梭菌iota毒素、艰难梭菌细胞致死毒素(a和b))、朊病毒、parasporin、胆固醇依赖性细胞溶素(如，肺炎球菌溶血素)、小孔形成毒素(如，短杆菌肽a)、蓝藻毒素(如，微囊藻素、节球藻毒素)、血毒素、神经毒素(如，肉毒神经毒素)、细胞毒素、霍乱毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素a、破伤风毒素，或免疫毒素(伊达比星、蓖麻毒素a、crm9、商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)dt)。示例性凋亡触发蛋白或肽包括凋亡蛋白酶激活因子‑1(apaf‑1)、细胞色素c、半胱天冬酶起始蛋白(caspaseinitiatorprotein)(casp2、casp8、casp9、casp10)、凋亡诱导因子(aif)、p53、p73、p63、bcl‑2、bax、颗粒酶b、聚adp核糖聚合酶(parp)和p21‑激活激酶2(pak2)。在另外的例子中，核酸聚合物包括核酸诱饵。在一些例子中，核酸诱饵是蛋白质结合核酸的模拟物，诸如基于rna的蛋白质结合模拟物。示例性核酸诱饵包括反式激活区(tar)诱饵和rev响应元件(rre)诱饵。[0222]在一些情况下，有效载荷是适体。适体是与特定靶分子结合的小的寡核苷酸或肽分子。示例性核酸适体包括dna适体、rna适体或xna适体，所述xna适体是包含一种或多种非天然核苷酸的rna和/或dna适体。示例性核酸适体包括arc19499(archemixcorp.)、reg1(regadobiosciences)和arc1905(ophthotech)。[0223]根据本文所述的实施方案的核酸任选地包括天然存在的核酸，或一种或多种核苷酸类似物，或者具有与天然存在的核酸在其他方面不同的结构。例如，2’‑修饰包括卤代基、烷氧基和烯丙氧基基团。在一些实施方案中，2'‑oh基团被选自h、or、r、卤代基、sh、sr、nh2、nhr、nr2或cn的基团取代，其中r是c1‑c6烷基、烯基或炔基，并且卤代基为f、cl、br或i。经修饰的连键的实例包括硫代磷酸根和5'‑n‑亚磷酰胺连键。[0224]根据本文所述的实施方案，使用具有多种不同核苷酸类似物、经修饰的主链或非天然存在的核苷间连键的核酸。在一些情况下，核酸包括天然核苷(即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或经修饰的核苷。经修饰的核苷酸的实例包括碱基修饰的核苷(如，阿糖胞苷(aracytidine)、肌苷、异鸟苷、水粉荤素、假尿苷、2,6‑二氨基嘌呤、2‑氨基嘌呤、2‑硫代胸苷、3‑脱氮杂‑5‑氮杂胞苷、2'‑脱氧尿苷、3‑硝吡咯、4‑甲基吲哚、4‑硫代尿苷、4‑硫代胸苷、2‑氨基腺苷、2‑硫代胸苷、2‑硫代尿苷、5‑溴胞苷、5‑碘尿苷、肌苷、6‑氮杂尿苷、6‑氯嘌呤、7‑脱氮杂腺苷、7‑脱氮杂鸟苷、8‑氮杂腺苷、8‑叠氮基腺苷、苯并咪唑、m1‑甲基腺苷、吡咯并嘧啶、2‑氨基‑6‑氯嘌呤、3‑甲基腺苷、5‑丙炔基胞苷、5‑丙炔基尿苷、5‑溴尿苷、5‑氟尿苷、5‑甲基胞苷、7‑脱氮杂腺苷、7‑脱氮杂鸟苷、8‑氧腺苷、8‑氧鸟苷、o(6)‑甲基鸟嘌呤和2‑硫代胞苷)、化学或生物修饰的碱基(如甲基化碱基)、经修饰的糖(如2'‑氟核糖、2'‑氨基核糖、2'‑叠氮基核糖、2'‑o‑甲基核糖、l‑对映体核苷阿拉伯糖和己糖)、经修饰的磷酸根基团(例如硫代磷酸根和5'‑n‑亚磷酰胺连键)，以及它们的组合。用于核酸化学合成的天然和经修饰的核苷酸单体是容易获得的。在一些情况下，相对于仅由天然存在的核苷酸组成的核酸，包含此类修饰的核酸显示出改善的性质。在一些实施方案中，本文所述的核酸修饰被用于减少和/或防止核酸酶(例如，核酸外切酶、核酸内切酶等)的消化。例如，可以通过在一条或两条链的3'端纳入核苷酸类似物来稳定核酸的结构，以减少消化。[0225]不同的核苷酸修饰和/或主链结构可存在于核酸的各个位置。此类修饰包括吗啉代、肽核酸(pna)、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸、2'‑氟n3‑p5'‑亚磷酰胺、1’,5’‑脱水己糖醇核酸(hna)或其组合。[0226]缀合化学[0227]在一些例子中，有效载荷通过天然连接(nativeligation)缀合至本文所述的抗‑cldn18.2抗体。在一些例子中，所述缀合如以下所述：dawson等人“synthesisofproteinsbynativechemicalligation,”science1994,266,776–779；dawson，等人“modulationofreactivityinnativechemicalligationthroughtheuseofthioladditives,”j.am.chem.soc.1997,119,4325–4329；hackeng，等人“proteinsynthesisbynativechemicalligation:expandedscopebyusingstraightforwardmethodology.,”proc.natl.acad.sci.usa1999,96,10068–10073；或wu，等人“buildingcomplexglycopeptides:developmentofacysteine‑freenativechemicalligationprotocol,”angew.chem.int.ed.2006,45,4116–4125。在一些例子中，所述缀合如美国专利号8,936,910所述。[0228]在一些例子中，有效载荷通过利用“无痕”偶联技术(philochem)的定点方法缀合至本文所述的抗‑cldn18.2抗体。在一些例子中，所述“无痕”偶联技术利用结合部分上的n‑末端1,2‑氨基硫醇基团，该基团然后与含有醛基团的多核酸分子缀合。(参见casi等人，“site‑specifictracelesscouplingofpotentcytotoxicdrugstorecombinantantibodiesforpharmacodelivery,”jacs134(13):5887‑5892(2012))[0229]在一些例子中，有效载荷通过利用掺入到结合部分中的非天然氨基酸的定点方法缀合至本文所述的抗‑cldn18.2抗体。在一些例子中，非天然氨基酸包括对乙酰基苯丙氨酸(pacphe)。在一些例子中，pacphe的酮基基团选择性地偶联至烷氧基‑胺衍生的缀合部分从而形成肟键。(参见axup等人，“synthesisofsite‑specificantibody‑drugconjugatesusingunnaturalaminoacids,”pnas109(40):16101‑16106(2012))。[0230]在一些例子中，有效载荷通过利用酶‑催化的过程的定点方法缀合至本文所述的抗‑cldn18.2抗体。在一些例子中，所述定点方法利用smartagtm技术(redwood)。在一些例子中，所述smartagtm技术包括利用甲酰甘氨酸生成酶(fge)在甲醛标记的存在下通过氧化过程从半胱氨酸生成甲酰甘氨酸(fgly)残基，随后经由肼基‑pictet‑spengler(hips)连接将fgly缀合至烷基肼‑官能化的多核酸分子。(参见wu等人，“site‑specificchemicalmodificationofrecombinantproteinsproducedinmammaliancellsbyusingthegeneticallyencodedaldehydetag,”pnas106(9):3000‑3005(2009)；agarwal,等人，“apictet‑spenglerligationforproteinchemicalmodification,”pnas110(1):46‑51(2013))。[0231]在一些例子中，酶催化的过程包括微生物谷氨酰胺转移酶(mtg)。在一些情况下，有效载荷利用微生物谷氨酰胺转移酶催化的过程与抗‑cldn18.2抗体缀合。在一些例子中，mtg催化识别序列内的谷氨酰胺的酰胺侧链与官能化的多核酸分子的伯胺之间的共价键的形成。在一些例子中，mtg由茂原链霉菌(streptomycesmobarensis)产生。(参见strop等人，“locationmatters:siteofconjugationmodulatesstabilityandpharmacokineticsofantibodydrugconjugates,”chemistryandbiology20(2)161‑167(2013))。[0232]在一些例子中，有效载荷通过如pct公布号wo2014/140317中描述的利用序列特异性转肽酶的方法缀合至本文所述的抗‑cd38抗体、抗‑icam1抗体，或多特异性抗体(例如，双特异性抗‑cd38/icam1抗体)。[0233]在一些例子中，有效载荷通过如美国专利公开号2015/0105539和2015/0105540中描述的方法缀合至本文所述的抗‑cldn18.2抗体。[0234]接头[0235]在一些例子中，上述接头包括由支化或非支化单体的长链以及/或者二维的或三维的单体交联网络组成的天然或合成的聚合物。在一些例子中，接头包括多糖、木质素、橡胶，或聚环氧烷(如，聚乙二醇)。[0236]在一些例子中，接头包括但不限于α‑、ω‑二羟基聚乙二醇，可生物降解的基于内酯的聚合物，如聚丙烯酸、聚乳酸(polylactideacid,pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚烯烃、聚酰胺、聚氰基丙烯酸酯、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二酯(pet，petg)、聚对苯二甲酸乙二酯(pete)、聚四亚甲基二醇(ptg)或聚氨酯以及它们的混合物。如本文所用，混合物是指在同一化合物内以及就嵌段共聚物而言使用不同聚合物。在一些情况下，嵌段共聚物是这样的聚合物，其中聚合物的至少一部分由另一种聚合物的单体构成。在一些例子中，接头包括聚环氧烷。在一些例子中，接头包括peg。在一些例子中，接头包括聚乙烯酰亚胺(polyethyleneimide,pei)或羟乙基淀粉(hes)。[0237]在一些情况下，聚环氧烷(如peg)是多分散或单分散的化合物。在一些例子中，多分散的材料包括用平均重量(重均)尺寸和分散度表征的该材料的不同分子量的分散分布。在一些例子中，单分散的peg包含一种分子尺寸。在一些实施方案中，接头是多分散或单分散的聚环氧烷(如peg)，并且指示的分子量代表聚环氧烷(如peg)分子的分子量的平均值。[0238]在一些实施方案中，接头包含聚环氧烷(如peg)，并且聚环氧烷(如peg)的分子量为约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100，1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000da。[0239]在一些实施方案中，聚环氧烷(如，peg)是离散的peg，其中离散的peg是包含多于一个重复环氧乙烷单元的聚合peg。在一些例子中，离散的peg(dpeg)包含2至60、2至50，或2至48个重复环氧乙烷单元。在一些例子中，dpeg包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、42、48、50或更多个重复环氧乙烷单元。在一些例子中，dpeg包含约2或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dpeg是由纯的(如约95％、98％、99％或99.5％)起始材料以逐步方式合成为单分子量化合物。在一些情况下，dpeg具有特定的分子量，而不是平均分子量。在一些情况下，本文所述的dpeg是来自quantabiodesign，lmd的dpeg。[0240]在一些例子中，接头是离散的peg，其任选地包含2至60、2至50，或2至48个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，接头包含dpeg，所述dpeg包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、42、48、50或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，接头是来自quantabiodesign，lmd的dpeg。[0241]在一些实施方案中，接头(l)是多肽接头。在一些例子中，多肽接头包含至少2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸残基。在一些例子中，多肽接头包含至少2、3、4、5、6、7、8或更多个氨基酸残基。在一些例子中，多肽接头包含至多2、3、4、5、6、7、8或更少个氨基酸残基。在一些情况下，多肽接头是可裂解的多肽接头(如，酶促或化学方式)。在一些情况下，多肽接头是不可裂解的多肽接头。在一些例子中，多肽接头包括val‑cit(缬氨酸‑瓜氨酸)、gly‑gly‑phe‑gly、phe‑lys、val‑lys、gly‑phe‑lys、phe‑phe‑lys、ala‑lys、val‑arg、phe‑cit、phe‑arg、leu‑cit、ile‑cit、trp‑cit、phe‑ala、ala‑leu‑ala‑leu或gly‑phe‑leu‑gly。在一些例子中，多肽接头包括肽，诸如：val‑cit(缬氨酸‑瓜氨酸)、gly‑gly‑phe‑gly、phe‑lys、val‑lys、gly‑phe‑lys、phe‑phe‑lys、ala‑lys、val‑arg、phe‑cit、phe‑arg、leu‑cit、ile‑cit、trp‑cit、phe‑ala、ala‑leu‑ala‑leu或gly‑phe‑leu‑gly。在一些情况下，多肽接头包含l‑氨基酸、d‑氨基酸，或l‑氨基酸和d‑氨基酸两者的混合物。[0242]在一些例子中，接头包括同源双功能接头。示例性同源双功能接头包括但不限于洛曼试剂二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)dsp、3'3'‑二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(dtssp)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(bs)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基dst)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(egs)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(dsg)、碳酸n,n′‑二琥珀酰亚胺酯(dsc)、已二亚氨酸二甲酯(dma)、庚二亚氨酸二甲酯(dmp)、辛二亚氨酸二甲酯(dms)、3,3′‑二硫代双丙亚氨酸二甲酯(dtbp)、1,4‑二‑3′‑(2′‑吡啶基二硫代)丙酰氨基)丁烷(dpdpb)、双马来酰亚胺基己烷(bmh)、含芳基卤的化合物(dfdnb)，诸如如1,5‑二氟‑2,4‑二硝基苯或1,3‑二氟‑4,6‑二硝基苯、4,4′‑二氟‑3,3′‑二硝基苯基砜(dfdnps)、双‑[β‑(4‑叠氮基水杨酰氨基)乙基]二硫化物(based)、甲醛、戊二醛、1,4‑丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3′‑二甲基联苯胺、联苯胺、α,α′‑对‑二氨基二苯基、二碘‑对‑二甲苯磺酸、n,n′‑亚乙基‑双(碘乙酰胺)，或n,n′‑六亚甲基‑双(碘乙酰胺)。[0243]在一些实施方案中，接头包括异源双功能接头。示例性异源双功能接头包括但不限于具胺反应性的巯基交联剂，诸如3‑(2‑吡啶基二硫代)丙酸n‑琥珀酰亚胺酯(spdp)、长链3‑(2‑吡啶基二硫代)丙酸n‑琥珀酰亚胺酯(lc‑spdp)、水溶性长链3‑(2‑吡啶基二硫代)丙酸n‑琥珀酰亚胺酯(磺基‑lc‑spdp)、琥珀酰亚胺基氧基羰基‑α‑甲基‑α‑(2‑吡啶基二硫代)甲苯(smpt)、6‑[α‑甲基‑α‑(2‑吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基‑lc‑smpt)、4‑(n‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑甲酸琥珀酰亚胺酯(smcc)、4‑(n‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基‑smcc)、间马来酰亚胺基苯甲酰基‑n‑羟基琥珀酰亚胺酯(mb)、间马来酰亚胺基苯甲酰基‑n‑羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基‑mb)、(4‑碘代乙酰基)氨基苯甲酸n‑琥珀酰亚胺酯(siab)、(4‑碘代乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基‑siab)、4‑(对‑马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(smpb)、4‑(对‑马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基‑smpb)、n‑(γ‑马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(gmb)、n‑(γ‑马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基‑gmb)、6‑((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(siax)、6‑[6‑(((碘代乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸琥珀酰亚胺酯(siaxx)、4‑(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‑1‑甲酸琥珀酰亚胺酯(siac)、6‑((((4‑碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‑1‑羰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(siacx)、碘乙酸对硝基苯基酯(npia)；具羰基反应性和巯基反应性的交联剂，诸如4‑(4‑n‑马来酰亚胺基苯chem11(15):2493‑2497(2013)中描述的无痕的芳基‑三氮烯接头。在一些例子中，接头是在blaney等人，“tracelesssolid‑phaseorganicsynthesis,”chem.rev.102:2607‑2024(2002)中描述的无痕接头。在一些例子中，接头是如美国专利号6,821,783中描述的无痕接头。[0249]使用方法[0250]在某些实施方案中，本文公开了一种治疗患有以cldn18.2蛋白的过表达为特征的癌症的受试者的方法。在一些情况下，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗‑cldn18.2抗体或包含抗‑cldn18.2抗体的药物组合物以治疗受试者中的癌症。在一些情况下，癌症是胃肠癌。示例性胃肠癌包括食道、胆囊和胆道、肝脏、胰腺、胃、小肠、大肠、结肠、直肠和/或肛门的癌症。[0251]在一些例子中，胃肠癌是胃(或胃部)癌。在一些情况下，胃(或胃部)癌包括胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肠道间质瘤(gist)、类癌瘤、鳞状细胞癌、小细胞癌或平滑肌肉瘤。[0252]在一些例子中，胃肠癌是胰腺癌。在一些情况下，胰腺癌包括外分泌肿瘤，诸如胰腺腺癌，腺泡细胞癌，导管内乳头状‑黏液性赘生物(ipmn)或黏液性囊腺癌；或胰腺神经内分泌肿瘤(pnet)(也称为胰岛细胞瘤)，诸如胃泌素瘤，胰高血糖素瘤(glucaganoma)，胰岛素瘤，生长抑素瘤，vipoma，或无功能的胰岛细胞瘤。[0253]在一些例子中，胃肠癌是食道癌。在一些情况下，食道癌包括食道腺癌、鳞状细胞癌或小细胞癌。[0254]在一些例子中，胃肠癌是胆管癌。[0255]在一些例子中，癌症是肺癌。在一些情况下，肺癌包括非小细胞肺癌(nsclc)，诸如肺腺癌、鳞状细胞癌，或大细胞癌；或小细胞肺癌(sclc)。[0256]在一些例子中，癌症是卵巢癌。在一些情况下，卵巢癌包括上皮性卵巢肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢间质肿瘤或原发性腹膜癌。[0257]在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用另外的治疗剂。在一些例子中，所述另外的治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂、靶向治疗剂、基于激素的治疗剂，或基于干细胞的治疗剂。[0258]在一些例子中，所述另外的治疗剂包括化学治疗剂。示例性化学治疗剂包括但不限于烷基化剂，诸如环磷酰胺、二氯甲基二乙胺mechlorethamine、苯丁酸氮芥chlorambucil、美法仑、达卡巴嗪或亚硝基脲；蒽环类药物，诸如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌或戊柔比星；细胞骨架破坏剂，诸如紫杉醇、多西他赛、abraxane或泰索帝；埃博霉素；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，诸如伏立诺他或罗米地辛；拓扑异构酶i抑制剂，诸如伊立替康或托泊替康；拓扑异构酶ii抑制剂，诸如依托泊苷、替尼泊苷或他氟泊苷；激酶抑制剂，诸如硼替佐米、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、维拉非尼或维莫德吉；核苷酸类似物和前体类似物，诸如阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、多西氟啶doxifluridine、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫鸟嘌呤；基于铂的剂，诸如卡铂、顺铂或奥沙利铂；维甲酸，诸如维甲酸(tretinoin)、阿利维甲酸(alitretinoin)，或贝沙罗汀(bexarotene)；或长春花生物碱及衍生物，诸如长春碱、长春新碱、长春地辛或长春瑞滨。[0259]在一些例子中，所述另外的治疗剂包括免疫治疗剂。在一些例子中，免疫疗法是过继细胞疗法。示例性过继细胞疗法包括来自adaptimmune的afptcr、mage‑a10tcr或ny‑eso‑tcr；来自unumtherapeutics的actr087/利妥昔单抗；来自junotherapeutics的抗‑bcmacar‑t细胞疗法、抗‑cd19“武装(armored)”car‑t细胞疗法、jcar014、jcar018、jcar020、jcar023、jcar024或jtcr016；来自celgene/junotherapeutics的jcar017；来自intrexon的抗‑cd19car‑t细胞疗法；来自kitepharma的抗‑cd19car‑t细胞疗法、axicabtageneciloleucel、kite‑718、kite‑439或ny‑eso‑1t‑细胞受体疗法；来自sorrentotherapeutics的抗‑ceacar‑t疗法；来自tnktherapeutics/sorrentotherapeutics的抗‑psmacar‑t细胞疗法；来自atarabiotherapeutics的ata520；来自aurorabiopharma的au101和au105；来自cellmedica的baltaleucel‑t(cmd‑003)；来自bluebirdbio的bb2121；来自bellicumpharmaceuticals的bpx‑501、bpx‑601或bpx‑701；来自kiromic的bsk01；来自immunocore的imcgp100；来自jouncetherapeutics的jtx‑2011；来自lionbiotechnologies的ln‑144或ln‑145；来自mustangbio的mb‑101或mb‑102；来自celyad的nkr‑2；来自celgene的pnk‑007；来自novartispharmaceuticals的tisagenlecleucel‑t；或来自tessatherapeutics的tt12。[0260]在一些例子中，免疫疗法是基于树突细胞的疗法。[0261]在一些例子中，免疫疗法包括基于细胞因子的疗法，包括例如白介素(il)(诸如il‑2、il‑15或il‑21)、干扰素(ifn)‑α或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm‑csf)。[0262]在一些例子中，免疫疗法包括免疫检查点调节剂。示例性免疫检查点调节剂包括pd‑1调节剂，诸如来自bristol‑myerssquibb的纳武单抗(opdivo)，来自merck的派姆单抗(keytruda)，来自agenus的agen2034，来自beigene的bgb‑a317，来自boehringer‑ingelheimpharmaceuticals的bl‑754091，来自cbtpharmaceuticals的cbt‑501(杰诺单抗(genolimzumab))，来自incyte的incshr1210，来自janssenresearch&development的jnj‑63723283，来自medimmune的medi0680，来自macrogenics的mga012，来自novartispharmaceuticals的pdr001，来自pfizer的pf‑06801591，来自regeneronpharmaceuticals/sanofi的regn2810(sar439684)，或来自tesaro的tsr‑042；ctla‑4调节剂，诸如伊匹单抗(yervoy)或来自agenus的agen1884；pd‑l1调节剂，诸如来自astrazeneca的度伐利尤单抗(durvalumab)(imfinzi)，来自genentech的阿替利珠单抗(mpdl3280a)，来自emdserono/pfizer的阿维鲁单抗，来自cytomxtherapeutics的cx‑072，来自novartispharmaceuticals的faz053，来自3dmedicine/alphamab的kn035，来自elililly的ly3300054，或来自emdserono的m7824(抗‑pd‑l1/tgfbeta陷阱)；lag3调节剂，诸如来自bristol‑myerssquibb的bms‑986016，来自novartispharmaceuticals的imp701，来自novartispharmaceuticals的lag525或来自regeneronpharmaceuticals的regn3767；ox40调节剂，诸如来自bristol‑myerssquibb的bms‑986178，来自glaxosmithkline的gsk3174998，来自agenus/incyte的incagn1949，来自medimmune的medi0562，来自pfizer的pf‑04518600或来自genentechp的rg7888；gitr调节剂，诸如来自novartispharmaceuticals的gwn323，来自agenus/incyte的incagn1876，来自medimmune的medi1873，来自merck的mk‑4166或来自leaptherapeutics的trx518；kir调节剂，诸如来自bristol‑myerssquibb的丽瑞单抗；或tim调节剂，诸如来自novartispharmaceuticals的mbg453或来自tesaro的tsr‑022。[0263]在一些例子中，所述另外的治疗剂包括基于激素的治疗剂。示例性的基于激素的治疗剂包括但不限于芳香酶抑制剂，诸如来曲唑、阿那曲唑、依西美坦或氨格鲁米特(aminoglutethimide)；促性腺激素释放激素(gnrh)类似物，诸如亮丙瑞林或戈舍瑞林；选择性雌激素受体调节剂(serm)，诸如他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬或氟维司群；抗雄激素药，诸如氟他胺或比卡鲁胺；孕激素，诸如醋酸甲地孕酮或醋酸甲羟孕酮；雄激素，诸如氟甲睾酮；雌激素，诸如雌激素二乙基己烯雌酚(des)、estrace或聚雌二醇磷酸酯；或生长抑素类似物诸如奥曲肽。[0264]在一些例子中，所述另外的治疗剂是一线治疗剂。[0265]在一些实施方案中，所述抗‑cldn18.2抗体和所述另外的治疗剂同时施用。[0266]在一些例子中，所述抗‑cldn18.2抗体和所述另外的治疗剂依序施用。在此类例子中，所述抗‑cldn18.2抗体在施用另外的治疗剂之前施用给受试者。在其他例子中，所述抗‑cldn18.2抗体在施用所述另外的治疗剂之后施用给受试者。[0267]在一些情况下，所述另外的治疗剂和所述抗‑cldn18.2抗体是作为分开的剂量配制的。[0268]在一些例子中，受试者已经受手术。在一些例子中，所述抗‑cldn18.2抗体和任选的所述另外的治疗剂在手术后施用给受试者。在一些情况下，所述抗‑cldn18.2抗体和任选的所述另外的治疗剂在手术前施用给受试者。[0269]在一些例子中，受试者已经受辐射。在一些例子中，所述抗‑cldn18.2抗体和任选的所述另外的治疗剂在辐射治疗期间或之后施用给受试者。在一些情况下，所述抗‑cldn18.2抗体和任选的所述另外的治疗剂在受试者经受辐射前施用给受试者。[0270]在一些例子中，受试者是人。[0271]在一些实施方案中，本文还描述了诱导细胞杀灭效应的方法。在一些情况下，所述方法包括使多个细胞与包含有效载荷的抗‑cldn18.2抗体接触足以使抗cldn18.2抗体内化从而诱导细胞杀灭效应的时间。在一些情况下，有效载荷包括类美登素、澳瑞他汀、紫杉烷、加利车霉素、倍癌霉素、阿马托毒素，或其衍生物。在一些情况下，有效载荷包括澳瑞他汀或其衍生物。在一些情况下，有效载荷是单甲基澳瑞他汀e(mmae)。在一些情况下，有效载荷是单甲基澳瑞他汀f(mmaf)。[0272]在一些例子中，所述细胞是癌细胞。在一些情况下，所述细胞来自胃肠癌。在一些情况下，所述胃肠癌是胃癌。在一些情况下，所述胃肠癌是胰腺癌。在一些情况下，所述胃肠癌是食管癌或胆管癌。在一些情况下，所述细胞来自肺癌或卵巢癌。[0273]在一些实施方案中，所述方法是体外方法。[0274]在一些实施方案中，所述方法是体内方法。[0275]药物组合物[0276]在一些实施方案中，抗‑cldn18.2抗体被进一步配制为药物组合物。在一些例子中，所述药物组合物被配制用于通过多种施用途径向受试者施用，所述途径包括但不限于肠胃外(如，静脉内、皮下、肌内、动脉内、真皮内、腹膜内、玻璃体内、脑内或脑室内)、经口、鼻内、经颊、经直肠或透皮施用途径。在一些例子中，本文所述的药物组合物被配制用于肠胃外(如，静脉内、皮下、肌内、动脉内、真皮内、腹膜内、玻璃体内、脑内或脑室内)施用。在其他例子中，本文所述的药物组合物被配制用于经口施用。在另一些其他例子中，本文所述的药物组合物被配制用于鼻内施用。[0277]在一些实施方案中，药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉剂、速释制剂、控释制剂、速溶制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、搏动释放制剂、多颗粒制剂(如纳米颗粒制剂)以及速释和控释混合制剂。[0278]在一些例子中，药物制剂包括多颗粒制剂。在一些例子中，药物制剂包括纳米颗粒制剂。示例性纳米颗粒包括但不限于顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、类富勒烯材料(fullerene‑likematerial)、无机纳米管、树枝状聚合物(诸如具有共价连接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳和量子粒(quantumdot)。在一些例子中，纳米颗粒是金属纳米颗粒，例如以下的纳米颗粒：钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、钆、铝、镓、铟、锡、铊、铅、铋、镁、钙、锶、钡、锂、钠、钾、硼、硅、磷、锗、砷、锑，以及它们的组合、合金或氧化物。[0279]在一些例子中，如在核‑壳纳米颗粒中那样，纳米颗粒包括核或者核和壳。在一些情况下，纳米颗粒的至少一个尺寸小于约500nm、400nm、300nm、200nm或100nm。[0280]在一些实施方案中，所述药物组合物包含基于与本文公开的组合物的相容性和所需剂型的释放谱特性选择的运载体或运载体材料。示例性运载体材料包括例如粘合剂、助悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂等。药学上相容的运载体材料包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠(sugarssodiumstearoyllactylate)、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶凝淀粉等。参见，如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,nineteenth编辑(easton,pa.:mackpublishingcompany,1995)；hoover,johne.,remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pennsylvania1975；liberman,h.a.和lachman,l.，编辑,pharmaceuticaldosageforms,marceldecker,newyork,n.y.,1980；和pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第七版(lippincottwilliams&wilkins1999)。[0281]在一些例子中，所述药物组合物进一步包含ph调节剂或缓冲剂，其包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲剂，诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。此类酸、碱和缓冲剂以使所述组合物的ph维持在可接受范围内所需的量被包含在内。[0282]在一些例子中，所述药物组合物包含使所述组合物的克分子渗透压重量浓度落入可接受的范围内所需的量的一种或多种盐。此类盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些；适合的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。[0283]在一些例子中，所述药物组合物进一步包含用于稳定化合物的稀释剂，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(其也可以提供ph值的控制或维持)在本领域中用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些例子中，稀释剂增加了所述组合物的体积以促进压缩或产生足够的体积以便均质掺合用于胶囊灌装。此类化合物可以包括如，乳糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇、右旋糖、微晶纤维素诸如二碱式磷酸钙、磷酸氢二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，诸如(amstar)；甘露糖醇、羟丙基甲基纤维素、醋酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果剂的糖(confectioner’ssugar)；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrate)；水解的谷物固体(hydrolyzedcerealsolid)、直链淀粉；粉状纤维素，碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露糖醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。[0284]在一些情况下，所述药物组合物包含崩解试剂(disintegrationagent)或崩解剂(disintegrant)以促进物质的分解或崩解。术语“崩解”包括与胃肠液接触时剂型的溶解和分散。崩解试剂的实例包括淀粉，如天然淀粉，诸如玉米淀粉或马铃薯淀粉；预胶化淀粉，诸如national1551或或羟基乙酸淀粉钠，诸如或纤维素，诸如木质产品，甲基结晶纤维素，如ph101、ph102、ph105、p100、ming和甲基纤维素，交联羧甲基纤维素，或交联纤维素，诸如交联的羧甲基纤维素钠交联的羧甲基纤维素或交联的交联羧甲基纤维素，交联的淀粉诸如羟基乙酸淀粉钠，交联的聚合物诸如交联聚维酮，交联的聚乙烯吡咯烷酮；藻酸盐诸如藻酸或藻酸的盐诸如藻酸钠；粘土诸如hv(硅酸铝镁)；树胶诸如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆、刺梧桐胶(karaya)、果胶或黄蓍胶；羟基乙酸淀粉钠；膨润土；天然海绵；表面活性剂；树脂诸如阳离子交换树脂；柑橘渣(citruspulp)；月桂基硫酸钠；月桂基硫酸钠与淀粉的组合，等。[0285]在一些例子中，所述药物组合物包含填充剂，诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、二碱式磷酸钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉、右旋糖、葡萄糖结合剂、右旋糖酐、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠、聚乙二醇等。[0286]润滑剂和助流剂也任选地包含在本文所述的药物组合物中，以防止、减少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性润滑剂包括，如硬脂酸、氢氧化钙、滑石、硬脂酰富马酸钠，烃诸如矿物油，或氢化植物油诸如氢化大豆油高级脂肪酸和它们的碱金属和碱土金属盐诸如铝、钙、镁、锌，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(如，peg‑4000)或甲氧基聚乙二醇诸如carbowaxtm，油酸钠，苯甲酸钠，山嵛酸甘油酯，聚乙二醇，月桂基硫酸镁或钠，胶态二氧化硅诸如syloidtm，淀粉诸如玉米淀粉，硅油，表面活性剂等。[0287]增塑剂包括用于软化微囊化材料或薄膜涂层以使它们没那么易碎的化合物。适合的增塑剂包括例如聚乙二醇(诸如peg300、peg400、peg600、peg1450、peg3350和peg800)、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。增塑剂还可以充当分散剂或湿润剂。[0288]增溶剂包括诸如以下的化合物：三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、月桂基硫酸钠、多库酯钠(sodiumdoccusate)、维生素etpgs、二甲基乙酰胺、n‑甲基吡咯烷酮、n‑羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200‑600、三缩四乙二醇、二乙二醇单乙基醚、丙二醇和异山梨醇二甲醚等。[0289]稳定剂包括诸如以下的化合物：任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等。[0290]助悬剂包括诸如以下的化合物：聚乙烯吡咯烷酮，如聚乙烯吡咯烷酮k12、聚乙烯吡咯烷酮k17、聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30；乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)；聚乙二醇，如聚乙二醇的分子量可以为约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400；羧甲基纤维素钠；甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素；乙酸硬脂酸羟甲基纤维素；聚山梨醇酯‑80；羟乙基纤维素；藻酸钠；树胶诸如黄蓍树胶和阿拉伯树胶，瓜尔树胶，黄原胶(xanthans)包括黄原树胶(xanthangum)；糖；纤维素制品诸如如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素；聚山梨醇酯‑80；藻酸钠；聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯；聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯；聚维酮等。[0291]表面活性剂包括诸如以下的化合物：月桂基硫酸钠、多库酯钠、tween60或80、三醋精、维生素etpgs、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物(如(basf))等。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚(如辛基酚聚醚10、辛基酚聚醚40)。有时会包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。[0292]粘度增强剂包括如甲基纤维素、黄原树胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、卡波姆胶、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖，以及它们的组合。[0293]润湿剂包括诸如以下的化合物：油酸、单硬脂酸甘油酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、月桂基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、tween80、维生素etpgs、铵盐等。[0294]治疗方案[0295]在一些实施方案中，施用本文所述的药物组合物以用于治疗应用。在一些实施方案中，所述药物组合物按以下方式施用：每天一次、每天两次、每天三次或更多次。所述药物组合物按以下方式施用：每日、每天、每隔一天、每周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或者更多次。所述药物组合物施用至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更长时间。[0296]在患者的状况确实有所改善的情况下，根据医生的判断，可连续给予所述组合物的施用；替代地，暂时降低正在施用的组合物的剂量或暂时中止施用一定长度的时间(即，“药物假期”)。在一些例子中，药物假期的长度在2天与1年之间变化，包括，仅举例来说，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。药物假期期间的剂量减少是10％‑100％，包括，仅举例来说，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。[0297]一旦患者的状况有所改善，必要时施用维持剂量。随后，可以随着症状的变化将施用剂量或施用频率或两者降低至保持改善的疾病、病症或疾患的水平。[0298]在一些实施方案中，对应于此类量的给定剂的量根据诸如特定的化合物、疾病的严重程度、需要治疗的受试者或宿主的特性(如体重)的多种因素而变化，但是常规地以本领域已知的方式根据病例的具体情况来确定，所述具体情况包括例如所施用的特定剂，施用途径以及受治疗的受试者或宿主。在一些例子中，所需剂量方便地以单次剂量形式提供，或者以同时(或在较短的时间段内)或以适当间隔施用的分次剂量形式提供，例如以每天两次、三次、四次或更多次的亚剂量形式提供。[0299]前述范围仅仅是建议性的，因为关于单个治疗方案的变量数量很大，与这些推荐值有相当大的偏差并不少见。此类剂量根据许多变量而变化，所述变量不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或疾患、施用模式、个体受试者的需求、所治疗的疾病或疾患的严重性，以及从业者的判断。[0300]在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗功效通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，包括但不限于测定ld50(50％群体致死剂量)和ed50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性效应与治疗效应之间的剂量比为治疗指数并且它可表示为ld50与ed50的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据被用于制定人类使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包括具有最小毒性的ed50的循环浓度的范围内。剂量可在这个范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。[0301]试剂盒/制品[0302]在某些实施方案中，本文公开了与一种或多种本文所述的组合物和方法一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包括被区室化以容纳一个或多个容器(诸如小瓶、管等)的运载体、包装或容器，所述一个或多个容器中的每个均包含将在本文所述的方法中使用的单独元件之一。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料制成。[0303]本文提供的制品含有包装材料。药用包装材料的实例包括但不限于，泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶和任何适合于所选的制剂和预期的施用和治疗模式的包装材料。[0304]例如，所述一个或多个容器包括如本文公开的抗‑cldn18.2抗体、用于产生一种或多种本文所述的抗体的宿主细胞，和/或包含编码本文所述的抗体的核酸分子的载体。此类试剂盒任选地包括与其在本文所述的方法中的使用有关的识别性描述或标签或说明。[0305]试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签，以及带有使用说明的包装插页。通常还将包括一组说明书。[0306]在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其它字符被附接、模制或蚀刻至容器本身内时，该标签在容器上；当标签例如作为包装插页存在于存放有容器的贮器或运载体内时，该标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于特定的治疗应用。标签还指示内容物的使用指南，诸如在本文所述的方法中的使用指南。[0307]在某些实施方案中，所述药物组合物以含有一个或多个含有本文提供的化合物的单位剂型的包装或分配器设备的形式呈现。包装例如含有金属或塑料箔，诸如泡罩包装。在一个实施方案中，包装或分配器设备随附有施用说明书。在一个实施方案中，包装或分配器还随附有与容器相关联的呈由调控药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的告示，所述告示反映了所述机构对人用或兽用施用的药物形式的批准。此类告示例如是由美国食品和药物管理局批准的处方药标签，或批准的产品插页。在一个实施方案中，还可制备含有在相容的药物运载体中配制的本文提供的化合物的组合物、将其放置于适当的容器中并贴上治疗指示的疾患的标签。[0308]某些术语[0309]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与要求保护的主题所属领域中的技术人员通常所理解的相同的含义。要理解的是，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例和说明性的，并不限制要求保护的任何主题。在本技术中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。必须指出的是，除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。在本技术中，除非另有说明，否则"或"的使用意指"和/或"。此外，术语“包括(including)”以及其它形式，诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。[0310]如本文所用，范围和量可表示为“约”特定值或范围。“约”也包括精确量。因此，“约5μl”意指“约5μl”以及“5μl”。一般地，术语“约”包括预期在实验误差内，如在15％、10％或5％内的量。[0311]本文所使用的章节标题仅出于组织目的并且不应被解释为限制所描述的主题。[0312]如本文所用，术语“一个或多个个体”、“一个或多个受试者”和“一个或多个患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，哺乳动物是非人类。这些术语均不要求或不限于以医护人员(如，医生、注册护士、执业护师、医生助理、护理员或临终关怀人员)的监督(如，持续或间歇性)为特征的状况。[0313]术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性、环状或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖已例如经由硫酸化、糖基化、脂质化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、转移rna介导的氨基酸向蛋白质中的添加(诸如精氨酰化)、泛素化或任何其他操作(诸如与标记组分的缀合)而被修饰的氨基酸聚合物。[0314]如本文所用，术语“氨基酸”是指包括甘氨酸及d或l光学异构体两者在内的天然和/或非天然或合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和肽模拟物。[0315]“源自”指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的起源。优选地，所述多肽具有与所述序列中编码的多肽的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，或其这样的部分，其中所述部分由至少10‑20个氨基酸，或至少20‑30个氨基酸，或至少30‑50个氨基酸组成，或者所述部分可用所述序列中编码的多肽进行免疫鉴定。该术语还包括从指定的核酸序列表达的多肽。[0316]关于kabat编号系统，抗体重链分子内的cdr通常存在于氨基酸位置31至35处，其可在以下位置处任选地包含一个或两个另外的氨基酸：35之后(在kabat编号方案中称为35a和35b)(cdr1)，氨基酸位置50至65(cdr2)，和氨基酸位置95至102处(cdr3)。使用kabat编号系统，抗体轻链分子内的cdr通常存在于氨基酸位置24至34处(cdr1)，氨基酸位置50至56处(cdr2)和氨基酸位置89至97处(cdr3)。如本领域技术人员众所周知的，使用kabat编号系统，由于fr和/或cdr的缩短或延长，抗体可变结构域的实际线性氨基酸序列可含有更少或另外的氨基酸，并且因此氨基酸的kabat数目不一定与其线性氨基酸数目相同。实施例[0317]这些实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。[0318]实施例1‑靶标和试剂[0319]在novobiosci和genomeditech中产生了过表达cldn18.2的hek293和cho细胞，用于免疫和筛选目的。表达cldn18.2的hek293细胞通过ires与gfp共表达。gfp和cldn18.2的表达通过用可商购获得的针对cldn18的荧光标记抗体(ab203563)染色来证明(图1)。通过dna测序证实了cldn18.2在cho细胞上的表达。[0320]实施例2‑免疫[0321]使用以下免疫方案对大鼠进行免疫以产生抗体(表10)。简而言之，在前两次免疫中，使用了两种类型的dna构建体，要么是仅胞外环1(ecl1，图3)，要么是全长cldn18.2(图2)dna。第三次免疫是用过表达cldn18.2的hek293细胞完成的，并且第四次免疫是用相应的dna或dna与过表达cldn18.2的细胞进行的。最后的加强是用过表达cldn18.2的hek293细胞完成的。使用四只大鼠进行融合。[0322]表10.大鼠免疫方案.[0323][0324]*被选择用于融合的大鼠[0325]对于小鼠免疫(表11)，在4轮免疫加最后的加强中使用了过表达cldn18.2的cho或hek293细胞。每组使用四只小鼠，并且进行3次融合以产生杂交瘤。[0326]表11.小鼠免疫方案.[0327][0328]*被选择用于融合的小鼠[0329]实施例3‑通过facs结合筛选原代杂交瘤克隆[0330]杂交瘤上清液特异性地结合至cho‑cldn18.2。接种总共80个96孔板，并通过基于细胞的elisa从经免疫动物的杂交瘤中对其进行筛选。基于od值>0.3，鉴定出194个克隆为阳性。为了获得特异性地结合至cldn18.2而非cldn18.1的抗体，筛选了来自用经工程化的细胞系cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2免疫的大鼠或小鼠的杂交瘤。简而言之，将50μlcho‑cldn18.1或cho‑cldn18.2细胞(细胞密度：2x106细胞/ml，存活力>90％)与等体积杂交瘤上清液在96孔板中于4℃下孵育1h。用facs缓冲液(含2％fbs的dpbs)洗涤后，将细胞/抗体混合物用二抗(山羊抗大鼠igg(h l)iflour647，genscript或与647‑缀合的兔抗小鼠igg，jacksonimmunoresearch)染色。最后，将混合物洗涤并用facs缓冲液重悬，并在bdfacscelesta上进行facs分析。使用flowjo软件分析原始数据。[0331]与分别与cho‑cldn18.1细胞结合相比，来自经免疫大鼠的7个杂交瘤和来自经免疫小鼠的31个杂交瘤表现出更强的与cho‑cldn18.2的特异性结合。[0332]实施例4‑纯化的抗体特异性地结合至cho‑cldn18.2[0333]通过蛋白g亲和纯化从上清液产生纯化的抗体。简而言之，将杂交瘤上清液在8000rpm和4℃下离心30分钟。接下来，将上清液用0.22μm微滤膜过滤。将nacl以1gnacl:10ml上清液的比率添加到上清液中。将上清液样品在4℃下以3ml/min的速度上样至纯化柱中。将蛋白g树脂用4‑5个柱体积的1xpbs平衡，然后用洗脱液(0.1mtris，ph12)洗涤。然后立即将中和缓冲液添加到含有洗脱的抗体的收集管中，以中和ph。接下来，将洗脱的抗体在室温下针对1xpbs透析2小时。抗体随后被储存用于分析。[0334]根据上述方法，使用过表达cldn18.2或cldn18.1的细胞在结合测定中测试纯化的大鼠抗体。4种纯化的大鼠抗体181b7b7、193h11d8、184a10d8和282a12f3显示出与cldn18.2特异性结合，而不与cldn18.1特异性结合。特别是，282a12f3与参考抗体175d10相比表现出更强的与cldn18.2的结合，并且两种纯化的大鼠抗体101c6a8和186a4b9结合至cldn18.1和cldn18.2两者。[0335]包括325f12h3、325e8c8、328g2c4、350g12e1、357b8f8、360f1g1、364d1a7、382a11h12、399h6a10、406d10h7、408b9d4、409e2c5、413b5b4、413h9f8、416e8g10、417h3b1、420g5e2和429g1b7在内的18种纯化的小鼠抗体显示出与cldn18.2特异性结合，而不与cldn18.1特异性结合。特别地，325e8c8、350g12e1、357b8f8、364d1a7、408b9d4和413h9f8与参考抗体175d10相比显示出更强的与cho‑cldn18.2的结合。[0336]实施例5‑纯化的抗体的结合曲线[0337]产生结合曲线以对杂交瘤抗体的结合亲和力进行排名。简而言之，将每个孔总共1x105个cho‑cldn18.2细胞接种到96孔板中，并用facs缓冲液(含2％fbs的dpbs)洗涤两次。用系列稀释的纯化的杂交瘤抗体将细胞孵育1h。一级抗体孵育后，将细胞用facs缓冲液洗涤两次。然后，将细胞用二级抗体(alexa647‑缀合的兔抗小鼠igg，jacksonimmunoresearch)染色。通过bdfacscelesta检测染色细胞的alexafluor647信号，并确定几何平均荧光信号。利用flowjo软件进行分析。将数据绘制为抗体浓度的对数与平均荧光信号的关系图。通过graphpadprism6(graphpad软件)进行非线性回归分析，并计算ec50值。[0338]如图4a‑图4c所示，经纯化的抗‑cldn18.2小鼠‑产生的抗体显示出对cho‑cldn18.2细胞的剂量依赖性结合。与参考抗体175d10相比，在18种测试的抗体中，五种抗体325e8c8、350g12e1、364d1a7、408b9d4和413h9f8显示出最高的最大结合(图4a)。五种抗体417h3b1、413b5b4、357b8f8、360f1g1和429g1b7显示出比175d10高的，但比抗体325e8c8、350g12e1、364d1a7、408b9d4和413h9f8低的最大结合(图4b)。另外的测试的抗体与175d10相比显示出相似或更弱的最大结合(图4c)。选定的针对cldn18.2的抗‑cldn18.2抗体的ec50为约10nm或更小(表12)。[0339]表12.与源自小鼠免疫的杂交瘤克隆的抗体的cho‑cldn18.2细胞的结合亲和力(ec50).[0340][0341][0342]本文和下表中使用的术语“na.”表示“不适用”。[0343]实施例6‑抗体与胃癌细胞系的结合[0344]胃癌细胞系snu601和snu620具有cldn18.2的内源表达。通过使用cldn18.2特异性引物的rt‑pcr和dna测序，证实了cldn18.2在snu601和snu620细胞上的表达。分选具有高水平cldn18.2表达的snu601和snu620细胞进行结合测定。如前所述的那样进行结合测定。大鼠产生的克隆282a12和101c6以及参考抗体175d10均与胃癌系snu601结合，但是克隆282a12和101c6也与su620结合(图5a和图5b)。[0345]snu620细胞系用于确定小鼠单克隆抗体与内源表达的cldn18.2的结合亲和力。所有鼠免疫的阳性抗体均以10μg/ml的终浓度进行测试。18个小鼠单克隆抗体中的15个(包括325f12h3、325e8c8、328g2c4、350g12e1、360f1g1、364d1a7、406d10h7、408b9d4、409e2c5、413b5b4、413h9f8、416e8g10、417h3b1、420g5e2和429g1b7)与175d10相比，显示出更强的与su620的结合。特别地，413h9f8、364d1a7和408b9d4牢固结合至snu620癌细胞。[0346]总之，诸如282a12f3、364d1a7和413h9f8的抗体特异性地结合至cho‑cldn18.2和胃癌snu620(表13)。[0347]表13.cldn18.2‑特异性抗体的结合活性的概述.[0348][0349]实施例7‑嵌合[0350]通过使鼠和大鼠轻链可变区在pcdna3.1( )质粒中表达来使鼠和大鼠抗体嵌合，该质粒包含编码信号序列的氨基酸的dna序列和人igg1的恒定区。人igg1的重链和轻链恒定区(ch和cl)的序列在表4中给出。[0351]如先前所述的那样测定嵌合抗体在cho‑cldn18.2细胞系上的结合亲和力。如图6a‑图6d所示，嵌合抗体282a12f3、64d1a7和413h9f8特异性地结合至cldn18.2。与参考抗体175d10相比，嵌合282a12f3、64d1a7和413h9f8显示出更强的结合亲和力。[0352]实施例8‑抗体序列分析和翻译后修饰位点的去除[0353]分析了由杂交瘤技术产生的抗体序列的翻译后修饰(ptm)，其有时在治疗性蛋白质开发过程中会引起问题，诸如异质性增加、生物活性降低、稳定性降低、免疫原性、片段化和聚集。ptm的潜在影响取决于其位置，并且在一些情况下取决于溶剂暴露。分析所有序列的cdr的天冬酰胺脱氨、天冬氨酸异构化、游离半胱氨酸硫醇基团、n‑糖基化、氧化和由潜在水解位点进行的片段化。[0354]使用igblast工具进行亲本序列与人种系序列的多重比对。基于亲本抗体序列与人种系的比对，鉴定出最高同源性条目。[0355]使用定制的构建同源性模型协议生成抗体282a12f3、413h9f8和364d1a7的结构模型。基于候选结构模板片段与靶标的序列同一性以及模板结构的定性晶体学度量，从pdb数据库中对候选结构模板片段进行评分、排名和选择。分别基于282a12f3、413h9f8、364d1a7的同源性建模数据，鉴定了框架区(fr)和cdr区中的暴露残基，突出了蛋白质结构表面上潜在的ptm位点。基于ptm分析数据和人种系模板的序列同一性，将三种抗体282a12f3、413h9f8和364d1a7用作亲本抗体，以用于进一步的人源化。[0356]在表达cldn18.2或cldn18.1的细胞以及表达作为阳性对照的参考抗体175d10的细胞上测试了去除ptm位点的突变体的结合测试。如图7a‑图10b所示，在潜在的ptm位点去除之后，来自282a12f3克隆的282a12f3‑vh‑n60q、282a12f3‑vh‑n60e和282a12f3(t62a)，来自413h9f8克隆的413h9f8‑vl‑n31e、413h9f8‑vl‑s32l和413h9f8‑vl‑s32v，和来自364d1a7克隆的364d1a7‑vl‑n31e、364d1a7‑vl‑s32l和364d1a7‑vl‑s32v显示出与cho‑cldn18.2而不是cho‑cldn18.1细胞系的特异性结合。与参考抗体175d10相比，所有具有潜在ptm位点去除的抗体均具有更强的与cho‑cldn18.2细胞的结合。来自357b8f8克隆的357b8f8‑vh‑n60e‑vl‑n31e、357b8f8‑vh‑n60e‑vl‑s32i、357b8f8‑vh‑s61i‑vl‑n31e和357b8f8‑vh‑s61i‑vl‑s32i显示出与cho‑cldn18.2的特异性结合，然而只有357b8f8‑vh‑s61i‑vl‑s32i显示出与175d10(xi175d10)相当的与cho‑cldn18.2的结合亲和力。[0357]如上所述的那样测试具有ptm去除突变的嵌合克隆与具有内源性cldn18.2表达的snu620的结合。如图11a‑图11c所示，413h9f8和364d1a7变异体两者都以不同的水平结合至snu620。与n31e突变体相比，s32v和s32l突变体显示出更佳的与cho‑cldn18.2和snu620细胞的结合活性。克隆413h9f8显示出比364d1a7更佳的与cldn18.2的结合活性。嵌合357b8f8及其ptm去除变异体无法结合至snu620癌细胞系，这与参考抗体175d10相似。[0358]实施例9‑嵌合抗体的竞争性结合[0359]为了研究cldn18.2‑结合抗体的表位结合基团，使用cho‑cldn18.2细胞测试了四种嵌合抗体的竞争结合活性。通过基于cho‑cldn18.2细胞的结合测定法确定每种抗体的工作浓度。收集细胞并用pbs洗涤，然后在96孔板中加入50μl的于pbs中的1x105个细胞。用pbs以3倍系列从60μg/ml稀释测试抗体12点，并将50μl稀释的抗体与细胞混合，并在4℃下孵育120min。接下来，将孔用pbs洗涤。对于竞争性结合测定，以工作浓度(分别是5、1、0.5和1μg/ml的xi175d10、282a12f3(t62a)、413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v)添加100μl生物素标记的抗‑cldn18.2抗体。在100μl/孔下以1:800稀释度添加生物素标记的山羊抗人iggfc作为对照。将板在4℃下孵育40min。链霉亲和素‑apc(1:1700)用于检测生物素标记的抗体。进行流式细胞术以测量结合。[0360]175d10在cho‑cldn18.2上的结合被282a12f3(t62a)、413h9f8‑vl‑s32v或364d1a7‑vl‑32v完全抑制(图12a‑图12d)。282a12(t62a)在cho‑cldn18.2上的结合被413h9f8‑vl‑s32v或364d1a7‑vl‑s32v完全抑制，被175d10部分抑制。413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v在cho‑cldn18.2上的结合被175d10或282a12f3(t62a)部分抑制。[0361]实施例10‑在小鼠和食蟹猴cldn18.2上的交叉结合活性[0362]物种交叉反应性使得能够在药理模型(小鼠)和毒性模型(食蟹猴)中评价临床候选物。通过基于细胞的结合测定法确定抗‑人cldn18.2抗体的物种交叉反应性。通过流式细胞术分析鉴定的单克隆抗体与鼠和食蟹猴cldn18.2的结合。用荧光标记和鼠cldn18.2和食蟹猴cldn18.2瞬时共转染hek293细胞。简而言之，将每个培养皿2.5×106个hek‑293细胞接种到两个10‑cm2培养皿中，每个培养皿含10mldmem培养基。种植后24h，用小鼠gfp‑cldn18.2和食蟹猴gfp‑cldn18.2质粒转染细胞。使用20μllipofectamine2000(lifetechnologies)转染每个培养皿中总质量为10μg的质粒。转染5h后更换培养基。转染后48h，将细胞解离并准备用于结合亲和力检测。表达人cldn18.2的稳定细胞系hek293‑gfp‑cldn18.2用于检测人gfp‑cldn18.2。[0363]在人、小鼠和食蟹猴cldn18.2过表达细胞上确定抗‑人cldn18.2抗体的结合亲和力。简而言之，将每个孔1x105个细胞接种到96孔板中，并用facs缓冲液(含2％fbs的d‑pbs)洗涤两次。用系列稀释的抗‑cldn18.2抗体将细胞孵育1h。对照组包括与人igg1一起孵育的癌细胞。一级抗体孵育后，将细胞用facs缓冲液洗涤两次。然后，在4℃下用alexafluor647标记的抗‑人igg二级抗体(jacksonimmunoresearchlaboratories)将细胞染色30min。通过bdfacscelesta检测染色细胞的alexafluor647和gfp信号，并确定几何平均荧光信号。利用flowjo软件进行分析。将数据绘制为抗体浓度与alexafluor647/gfp的平均荧光比率的关系图。通过graphpadprism6(graphpad软件)进行非线性回归分析。如图13a‑图13e所示，嵌合抗体413h9f8、364d1a7和357b8f8的变异体，人源化282a12(t62a)(hz282‑11)和参考抗体175d10与小鼠和食蟹猴cldn18.2交叉反应。同与食蟹猴和小鼠cldn18.2的结合相比，所有测试的抗体均显示出更强的与人cldn18.2的结合。[0364]实施例11‑嵌合抗体的抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)[0365]嵌合抗‑cldn18.2抗体在cho‑cldn18.2细胞上诱导了特异性adcc。[0366]在cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2细胞上测试了抗‑cldn18.2抗体诱导的adcc的特异性。用cfse(lifetechnology)在2.5μm的最终浓度下标记靶细胞cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2，持续30min。将标记的靶细胞浓度调整为2×105个细胞/ml，将效应细胞(fcr‑tank(cd16a‑15v)，其是由immuneonco开发的过表达cd16a的工程化nk92细胞系)调整为8×105个细胞/ml。然后，在每个孔中混合50μl靶细胞混悬液、100μl效应细胞混悬液和50μl系列稀释的抗体(效应细胞/靶细胞比率为8:1)。为每种浓度的抗体准备了重复的孔。对照组包括仅与效应细胞一起孵育的癌细胞。在37℃，5％co2下孵育4‑16h后，加入1μg/ml7‑aad(invitrogen)并通过流式细胞术(bdfacscelesta)对其进行分析。通过下式计算adcc：adcc％＝在存在抗体情况下的7‑aad阳性细胞％‑在不存在抗体情况下的7‑aad阳性细胞％。[0367]抗‑cldn18.2抗体和fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞在nci‑n87‑cldn18.2胃细胞系上诱导了adcc[0368]在nci‑n87癌细胞上测试了嵌合抗体和人源化抗体的adcc。用cfse(lifetechnology)在2.5μm的最终浓度下标记靶细胞30min。将标记的靶细胞浓度调整为2×105个细胞/ml，将效应细胞(fcr‑tank(cd16a‑15v)调整为8×105个细胞/ml。然后，在每个孔中混合50μl靶细胞混悬液、100μl效应细胞混悬液和50μl系列稀释的抗体(效应细胞/靶细胞比率为8:1)。为每种浓度的抗体准备了重复的孔。对照组包括仅与效应细胞一起孵育的癌细胞。在37℃，5％co2下孵育4‑16h后，加入1μg/ml7‑aad(invitrogen)并通过流式细胞术(bdfacscelesta)对其进行分析。通过下式计算adcc：adcc％＝在存在抗体情况下的7‑aad阳性细胞％‑在不存在抗体情况下的7‑aad阳性细胞％。[0369]人外周血单核细胞(pbmc)在nugc4‑cldn18.2胃癌细胞系上诱导了adcc[0370]在nugc4‑cldn18.2胃癌细胞上测试由pbmc诱导的嵌合抗体和人源化抗体的adcc。在测定前一天将健康受试者的冷冻保存的pbmc(allcells)解冻，并在含有200iuil‑2(r&d)的rpmi‑10％fbs培养基中在co2孵育箱中培养过夜。用cfse(lifetechnology)在2.5μm的最终浓度下标记靶细胞15min。染色后，将细胞浓度调节至6×104个细胞/ml，并与2倍体积的被调节至1×106个细胞/ml的pbmc混合(效应细胞/靶细胞比率为40:1)。然后，在每个孔中混合150μl混合的靶细胞和效应细胞混悬液以及50μl系列稀释的抗体。为每种浓度的抗体准备了重复的孔。单独的靶细胞是对照组。在37℃，5％co2下孵育5h后，加入1μg/mlpi(invitrogen)并通过流式细胞术(bdfacscelesta)对其进行分析。通过下式计算特异性细胞毒性：特异性细胞毒性＝在存在抗体情况下的％pi阳性细胞‑在不存在抗体情况下的％pi阳性细胞。[0371]肿瘤特异性mab可通过基于fc的机制发挥作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。在选定抗体的存在下，通过nk细胞系或pbmc诱导的adcc分析cldn18.2特异性嵌合抗体的adcc功能。如图14a‑图14b所示，分析了嵌合抗体与fcr‑tank(cd16a‑15v)一起诱导针对具有人cldn18.1(cho‑cldn18.1)或人cldn18.2(cho‑cldn18.2)的稳定表达的cho细胞的adcc的能力。cldn18.2特异性抗体282a12f3(t62a)、xi175d10、413h9f8和364d1a7诱导了cho‑cldn18.2而非cho‑cldn18.1的adcc介导的裂解。与cldn18.1和cldn18.2都结合的克隆101c6诱导了针对cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2细胞两者的adcc活性。282a12f3(t62a)、xi175d10、413h9f8和364d1a的特异性adcc活性与它们与cldn18.2的特异性结合谱一致。[0372]具有人cldn18.2的稳定表达的胃癌系nci‑n87(nci‑n87‑cldn18.2)用作靶细胞，以测试嵌合抗体的adcc活性。如图15和表14所示，282a12f3(t62a)，参考抗体175d10、413h9f8和364d1a7诱导了adcc介导的nci‑n87‑cldn18.2细胞裂解。克隆282a12f3、413h9f8和364d1a7显示出比参考抗体175d10更强的adcc活性，而357b8f8显示出更低的活性。s239d/i332efc变异体已被证明能介导抗体的增强的adcc活性(lazar，等人，“engineeredantibodyfcvariantswithenhancedeffectorfunciton,”pnasusa2006；103:4005‑4010)。引入位于175d10的fc中的s239d/i332e突变以增强adcc活性(175d10‑v2)。如图15和表14所示，具有位于fc中的s239d/i332e突变的175d10(xi175d10‑v2)比其亲本抗体175d10具有更强的adcc活性。[0373]为了进一步验证cldn18.2特异性抗体的功能，将来自健康人类供者的冷冻保存的pbmc用于测试它们对另一种稳定表达cldn18.2的胃癌系nugc4(nugc4‑cldn18.2)的adcc活性。如图16和表15所示，282a12f3(t62a)、xi175d10、413h9f8和364d1a7以浓度依赖性方式诱导了adcc介导的nugc4‑cldn18.2细胞裂解。282a12f3、357b8f8、413h9f8和364d1a7显示出比对照抗体175d10更强的adcc活性，而413h9f8显示出最高的最大比细胞毒性。[0374]表14.嵌合抗体对nci‑n87‑18.2细胞系的adcc活性[0375][0376][0377]*2个独立实验的平均值[0378]表15.嵌合抗体在nugc4‑cldn18.2细胞系上的adcc活性[0379][0380]*来自1名供者的数据。其余数据指示3名供者的平均值。[0381]实施例12‑嵌合抗体的补体依赖性细胞毒性(cdc)活性[0382]在一些例子中，肿瘤特异性mab也通过补体依赖性细胞毒性(cdc)发挥它们的效应。使用人血清和cho‑cldn18.2细胞系验证嵌合抗体的cdc功能。将50μl3x104个cho‑cldn18.2细胞与25μl系列稀释的嵌合抗‑人cldn18.2mab混合。在室温下孵育15～30min。加入25μl40％的人血清，使最终血清浓度达到10％。在37℃，5％co2下孵育30min后，加入1μg/mlpi(invitrogen)并通过流式细胞术(bdfacscelesta)对其进行分析。[0383]如图17所示，嵌合抗体282a12f3(t62a)、xi175d10、413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v诱导了cdc介导的cho‑cldn18.2裂解。与参考抗体175d10相比，抗体282a12f3(t62a)、413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v诱导了更强的cdc。[0384]实施例13–示例性抗‑cldn18.2抗体的人源化[0385]抗体282a12f3的人源化[0386]鼠抗体的人源化是通过将小鼠抗体的cdr残基移植到人种系框架上进行的。首先，将所选候选物的vh和vl区的序列与人种系序列进行比较，并基于同源性、规范结构(canonicalstructure)和物理特性选择最佳适配的种系受体。随后，使用同源性建模生成候选物的结构模型。对候选抗体的重链和轻链两者中的cdr区域进行了固定，并将鼠框架替换为选定的人种系框架。使潜在地影响cdr构象的小鼠和人框架之间的不同残基经受反向突变。合成编码设计的人源化变异体的dna片段，并将其亚克隆到igg表达载体中。通过测序确认dna序列。将人源化重链和轻链的不同组合共转染到cho‑k1中进行表达。例如通过在表达靶抗原的细胞上的facs，将人源化抗体与亲本抗体在抗原亲和力方面进行比较。[0387]vh序列中有一个糖基化位点，其从t突变为a。该序列也不含游离的半胱氨酸或asn/asp降解基序ng或dg。将282a12vh(seqidno:40)和282a12vl(seqidno:44)的原始序列输入到blast中进行分析；并且根据cdr移植的同源性分析，选择最佳突变位点的序列。[0388]seqidno:65‑68例示了4个变异282a12vh序列，而seqidno：69‑73例示了5个变异282a12vl序列。[0389]表6例示了282a12f3(t62a)的人源化重链和轻链组合。[0390]抗体413h9f8‑vl‑s32v的人源化[0391]413h9f8‑vl‑s32v的人源化设计采用了两种利用略有不同的cdr移植途径的策略。seqidno:74‑76例示了3个变异413h9f8vh序列，而seqidno:77‑80例示了利用第一策略的4个变异413h9f8vl序列。表7例示了413h9f8‑vl‑s32v衍生物的人源化重链和轻链组合。[0392]在第二策略下，seqidno:81‑84例示了4个变异413h9f8vh序列，而seqidno:85‑88例示了4个变异413h9f8vl序列。表8例示了413h9f8‑vl‑s32v衍生物的人源化重链和轻链组合。[0393]364d1a7‑vl‑s32v的人源化[0394]seqidno:89‑92例示了4个变异364d1a7vh序列，而seqidno:93‑97例示了5个变异364d1a7vl序列。表9例示了364d1a7‑vl‑s32v衍生物的人源化重链和轻链组合。[0395]实施例14‑人源化282a12f3(t62a)抗体的结合活性[0396]通过使用上述cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2细胞进行facs分析来将人源化抗体的结合亲和力和特异性与亲本抗体的结合亲和力和特异性进行比较。如图18a‑图18b所示，包括hz282‑3、hz282‑4、hz282‑8、hz282‑10、hz282‑11、hz282‑12、hz282‑15、hz282‑19和hz282‑10在内的人源化282a12f3(t62a)克隆显示出与282a12f3(t62a)相似的与cho‑cldn18.2的结合亲和力。这些人源化克隆都不结合至cho‑cldn18.1。数据表明，人源化282a12f3(t62a)抗体保留了与cldn18.2的结合特异性和亲和力。[0397]人源化282a12t62a克隆的结合亲和力在snu620胃癌细胞上得到进一步验证。如图19a‑图19b所示，大多数人源化282a12t62a克隆显示出与snu620癌细胞的高结合亲和力。包含282a2‑vhg0重链的抗体，例如hz282‑1、hz282‑5、hz282‑9、hz282‑13和hz282‑17，不结合至snu620，表明282a12(t62a)的vh区的fr3中至少有2个残基k和v参与与snu620的结合(表6)。[0398]结合亲和力和特异性数据总结在表16中。大多数人源化282a12(t62a)抗体保留了亲本抗体的特异性和亲和力。[0399]表16.人源化282a12(t62a)抗体在cho‑cldn18.2和snu620癌细胞系上的结合活性的概述.[0400][0401]‑，未测试或不适用。[0402]实施例15‑人源化413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体的结合活性[0403]通过使用cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2细胞进行facs分析来将人源化413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体的结合亲和力和特异性与亲本抗体的结合亲和力和特异性进行比较。如图20a‑图20d、图21a‑图21d、表17和表18中所示，所有测试的人源化413h9f8‑vl‑s32v抗体都在cho‑cldn18.2细胞上显示出相当的与413h9f8‑vl‑s32v的结合亲和力。如图22a‑图22e和表19中所示，所有测试的人源化364d1a7‑vl‑s32v抗体都在cho‑cldn18.2细胞上显示出相当的与364d1a7‑vl‑s32v的结合亲和力。人源化413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体的结合亲和力在snu620胃癌细胞上进一步验证。如图23a‑图23c所示，所有测试的人源化413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体与其亲本抗体相比都显示出相似的与snu620胃癌细胞的亲和力。数据表明人源化的413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体保留了结合特异性和亲和力。[0404]表17.人源化413h9f8‑vl‑s32v抗体(策略1)在cho‑cldn18.2细胞上的结合ec50.[0405]抗体ec50(nm)413h9f8‑cp12.60413h9f8‑cp21.99413h9f8‑cp32.09413h9f8‑cp42.28413h9f8‑cp52.54413h9f8‑cp62.32413h9f8‑cp72.47413h9f8‑cp82.72413h9f8‑cp92.21413h9f8‑cp103.69413h9f8‑cp112.61413h9f8‑cp123.01413h9f8‑vl‑32v1.84xi175d109.32hz282‑113.68282a12f3(t62a)4.45[0406]表18.人源化413h9f8‑vl‑s32v抗体(在策略2中)在cho‑cldn18.2上的结合ec50.[0407][0408]表19.人源化364d1a7抗体在cho‑cldn18.2上的结合ec50.[0409][0410][0411]实施例16‑示例性人源化抗体的adcc功能[0412]如上所述的那样在cho‑cldn18.1和cho‑cldn18.2细胞系上验证了人源化抗体的cldn18.2特异性adcc活性。如图14a‑图14b所示，人源化抗体413h9f8‑h1l1和364d1a7‑h1l1诱导了cho‑cldn18.2而不是cho‑cldn18.1的adcc介导的裂解。其表明人源化抗体保留了其亲本抗体的靶标特异性。[0413]分析了人源化抗体变异体和亲本抗体的adcc功效。简而言之，将效应fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞与cfse标记的靶细胞nci‑n87‑cldn18.2以8:1的效应细胞:靶细胞比率混合。将混合的细胞与人源化抗体一起培养4小时。如上所述的那样分析和计算adcc功效。如图24a‑图24c和表20所示，几乎所有测试的人源化413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体分别与它们的亲本抗体相比表现出相似的adcc活性。如上所述的那样进一步测试了人源化抗体与pbmc一起对nugc4‑cldn18.2胃癌细胞的adcc活性。如图25a‑图25c和表21所示，几乎所有测试的人源化413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v抗体分别与它们的亲本抗体相比表现出相当的adcc活性。[0414]表20.413h9f8和364d1a7抗体的人源化抗体与fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞一起对nci‑n87‑cldn18.2胃癌细胞的ec50和最大adcc活性.[0415][0416]表21.413h9f8和364d1a7抗体的人源化抗体与pbmc一起对nugc4‑cho18.2胃癌细胞的ec50和最大adcc活性.[0417][0418][0419]*来自1名供者的数据。其他数据是3名供者的平均值实施例17人源化抗‑cldn18.2抗体的fc变异体的adcc活性。[0420]人igg1有4种主要同种异型，包括g1m1(d356/l358)、g1m‑1(e356/m358)、g1m3(r214)和g1m17(k214)，它们的重链不同。同种异型以共显性孟德尔(mendelian)方式遗传，并且在非洲人、白人和蒙古人种群中发现了各种组合的集合(pmid:25368619,26685205)。研究中包括的抗‑cldn18.2抗体具有含有d356/l358或e356/m358的fc变异体。例如，参考抗体xi175d10具有含有d356/l358的fc变异体。值得注意的是，含有d356/l358和e356/m358的fc变异体的抗体具有相似的adcc活性(数据未显示)。添加“dl”名称后缀以指示fc中具有d356/l358的抗体，而对于e356/m358变异体的那些，未添加特定名称后缀。已经开发了包括s239d/i332e和f243l/r292p/y300l/v305i/p396l突变在内的各种fc工程化途经，以增强抗体的效应子功能(pmid:29070978)。[0421]产生了具有s239d/i332e或f243l/r292p/y300l/v305i/p396lfc变异体的抗‑cldn18.2抗体，以改善它们的效应子功能。对于具有s239d/i332efc变异体的抗体，添加了“v2”名称后缀，而对于具有f243l/r292p/y300l/v305i/p396lfc变异体的抗体，添加了“mg”名称后缀。[0422]如上所述的那样在cho‑cldn18.2细胞系上评估具有不同fc变异体的抗‑cldn18.2抗体的adcc效应。简而言之，将效应fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞与cfse标记的靶细胞cho‑cldn18.2以4:1的效应细胞:靶细胞比率混合。将混合的细胞与抗体一起培养4小时。如上所述的那样分析和计算adcc效应。如图31和表22所示，413h9f8‑cp2‑v2‑dl和413h9f8‑cp2‑mg‑dl与其亲本抗体413h9f8‑cp2相比，均显示出增强的adcc活性。[0423]表22.413h9f8‑cp2变异体与fcr‑tank(cd16a‑15v)细胞一起对cho‑cldn18.2细胞的adcc活性.[0424]抗体ec50,nm413h9f8‑cp20.0080413h9f8‑cp2‑v2‑dl0.0010413h9f8‑cp2‑mg‑dl0.0024higg1na.[0425]na.不适用[0426]如上所述的那样进一步测试了人源化抗体与pbmc一起对nugc4‑cldn18.2胃癌细胞的adcc活性。分析了具有不同fc变异体的人源化抗体413h9f8‑cp2和413h9f8‑h2l2与pbmc一起在40:1的效应细胞:靶细胞比率下诱导针对nugc4‑cldn18.2细胞的adcc的能力，将细胞培养5小时。数据是从源自一名健康供者的pbmc产生的。每个数据点代表重复项的平均值。如图32和表23所示，413h9f8‑h2l2和413h9f8‑cp2的“v2”和“mg”变异体两者分别与其亲本抗体相比，显示出增强的adcc活性。[0427]表23.413h9f8‑cp2和413h9f8‑h2l2变异体与人pbmc一起对nugc4‑cldn18.2胃癌细胞系的adcc活性.[0428]抗体ec50,nm413h9f8‑cp20.0492413h9f8‑cp2‑v2‑dl0.0146413h9f8‑cp2‑mg‑dl0.0175413h9f8‑h2l20.480413h9f8‑h2l2‑v2‑dl0.0148413h9f8‑h2l2‑mg‑dl0.0046higg1na.[0429]na.不适用[0430]实施例18‑选定的人源化抗体的cdc活性[0431]如上所述的那样分析人源化抗体变异体的cdc活性以将它们的cdc功能与亲本抗体进行比较。如图26a‑图26b和表24所示，几乎所有测试的人源化413h9f8‑vl‑s32v和364d1a7‑vl‑s32v克隆分别与它们的亲本抗体相比，表现出相似的cdc活性。[0432]表24.选定的人源化413h9f8和364d1a7克隆与人血清一起诱导的针对cho‑cho18.2细胞的cdc的ec50.[0433]抗体cdc，ec50，nm413h9f8‑vl‑s32v0.76413h9f8‑h1l10.78413h9f8‑h2l11.06413h9f8‑h2l20.84413h9f8‑h1l31.07413h9f8‑cp11.66413h9f8‑cp21.13364d1a7‑vl‑s32v1.49364d1a7‑h1l11.48364d1a7‑h3l11.28xi175d102.26xi‑282(t62a)10.43[0434]实施例19：肿瘤细胞对抗‑cldn18.2抗体的内化。[0435]通过在37℃下孵育以诱导抗体内化后检测抗体的细胞表面保留，间接确定了肿瘤细胞对抗体的内化。简而言之，收集nugc4‑cldn18.2和nci‑n87‑cldn18.2细胞，并用洗涤缓冲液(含1％fbs的pbs)洗涤，并将其调节至1x105个细胞/50μl。将抗体稀释至20μg/ml，将50μl稀释的抗体与细胞以1:1的体积比混合，然后在冰浴上孵育30min。将细胞用预冷却的洗涤缓冲液洗涤两次，并重悬于800μl预冷却的洗涤缓冲液中。在不同的时间点将100μl细胞混悬液添加到96孔板中，并在37℃下孵育。加入200μl预冷却的洗涤缓冲液以终止所有样品的内吞温度条件。将在冰浴上孵育的样品设置为无内化或极少内化的对照。洗涤一次后，添加100μl/孔的第二抗体(af647‑山羊抗人iggfcγ，jackson，#109‑606‑170，1:800稀释)，并在冰浴上孵育30min。将细胞用预冷却的洗涤缓冲液洗涤两次，并用200μl预冷却的洗涤缓冲液重悬，并通过流式细胞术(bdfacscelesta)进行分析。[0436]抗体内化的百分比＝[mfi(在冰浴上孵育)‑mfi(在37℃下孵育不同时间)]/mfi(在冰浴上孵育)x100％。[0437]如图33a所示，xi175d10‑v2和282a12f3(包括xi282a12f3(t62a)‑v2‑dl、hz282‑11‑v2和hz282‑15‑v2变异体)迅速被nugc4‑cldn18.2细胞内化，并且在37℃孵育2小时后，大于80％的所述抗体被内化。在37℃下孵育2小时后，约50％的xi350g12e1‑v2‑dl和xi325e8c80v2‑dl被nugc4‑cldn18.2细胞内化。值得注意的是，在37℃下孵育2小时后，小于15％的413h9f8‑vl‑s32v‑v2‑dl和xi408b9d4‑v2‑dl、xi417h3b1‑v2‑dl、xi328g2c4‑v2‑dl和xi325f12h3‑v2‑dl被nugc4‑cldn18.2细胞内化。也采用nci‑n87‑cldn18.2细胞进行内化测定(图33b)。具体而言，在37℃下孵育2小时后，大于50％的xi175d10‑v2、282a12f3(包括xi282a12f3(t62a)‑v2‑dl、hz282‑11‑v2和hz282‑15‑v2变异体)、xi350g12e1‑v2‑dl和xi325e8c80v2‑dl被nci‑n87‑cldn18.2细胞内化。在37℃下孵育2小时后，小于30％的413h9f8‑vl‑s32v‑v2‑dl、xi408b9d4‑v2‑dl、xi417h3b1‑v2‑dl、xi328g2c4‑v2‑dl和xi325f12h3‑v2‑dl被nci‑n87‑cldn18.2细胞内化。[0438]总之，282a12f3与胃癌细胞系上过表达的cldn18.2的接合导致高水平的抗体内化，而抗体413h9f8‑vl‑s32v‑v2‑dl、xi408b9d4‑v2‑dl、xi417h3b1‑v2‑dl、xi328g2c4‑v2‑dl和xi325f12h3‑v2‑dl仅触发最小至轻度的抗体内化，抗体xi175d10‑v2、xi325e8c80v2‑dl和xi350g12e1‑v2‑dl诱导中到高水平内化。[0439]实施例20‑抗体‑药物缀合[0440]将裸抗体175d10(xi175d10)、282a12f3(t62a)和同种型对照抗体人igg1缀合至mc‑vc‑pab‑mmae，mc‑vc‑pab‑mmae是一种包含可裂解的缬氨酸‑瓜氨酸(vc)接头的单甲基澳瑞他汀e(mmae)衍生物(图27)。简而言之，将抗体在4℃的冰箱中解冻超过4小时，并在4℃下针对缀合缓冲液(25mmna2b4o7，25mmnacl，1mmdtpa，ph7.4)透析过夜。通过加入新鲜制备的tcep工作溶液(5mm在半胱氨酸‑马来酰亚胺缀合缓冲液中的tcep，tcep‑hcl)并在25℃水浴中孵育2小时来减少抗体。将抗体与新鲜制备的mc‑vc‑pab‑mmae(xdcexplorer)工作溶液(10mm)在dmso中以6的比率在10％v/v有机溶剂(dmso)存在下缀合，将混合物在25℃水浴中孵育2小时。将抗体‑药物缀合物在4℃下针对l‑组氨酸透析缓冲液(20mml‑组氨酸，ph5.5)透析过夜，其中4小时后更换一次透析缓冲液。提取最终产物并用0.2m滤器过滤，并通过hic‑hplc分析其质量。hic‑hplc结果显示，所有缀合物的药物与抗体的比率(dar)值的范围为3.5至4.0(表25)。随着tcep摩尔比的增加，adc的dar值也增加。[0441]表25.adc的dar值.[0442][0443]实施例21‑adc对hek293‑cldn18.2细胞的细胞杀灭活性[0444]在具有cldn18.2的过表达的hek29(hk293‑cldn18.2)细胞系上测试了xi‑175d10‑vcmmae、282a12f3(t62a)‑vcmmae和huigg1‑vcmmae(具有3种不同的dar)以及相应的裸抗体的细胞毒性。简而言之，将hk293‑cldn18.2细胞接种在96孔板中，并在37℃，5％co2下生长过夜。将裸抗体和adc制备为4x(60μg/ml，400nm)浓度，并在细胞生长培养基中进行5倍系列稀释。将100μl一级稀释液与100μl培养基混合，使浓度达到2x。将50μl每种复合稀释液一式三份地添加到细胞中。将细胞在37℃，5％co2下孵育5天。通过celltiterglo发光细胞存活力测定试剂盒(promega)确定细胞毒性。加入100μl/孔的celltiterglo试剂用于细胞存活力读取。在室温下在振荡器上孵育10分钟，在envision上记录发光。[0445]如图28a‑图28b所示，细胞存活力不受裸抗体处理的影响，而细胞存活力在用adc282a12f3(t62a)‑vcmmae和xi175d10‑vcmmae处理时以浓度依赖性方式降低。此外，与xi175d10‑vcmmae相比，282a12f3(t62a)‑vcmmae更有效地诱导细胞死亡。adc282a12f3(t62a)‑vcmmae和xi175d10‑vcmmae不影响呈cldn18.2阴性的hek293细胞的存活力。这表明adc282a12f3(t62a)‑vcmmae和xi175d10‑vcmmae特异性地抑制cldn18.2阳性细胞的存活力。[0446]实施例22‑adc对nci‑n87‑cldn18.2细胞的细胞杀灭活性[0447]如上所述的那样使用两种过度表达cldn18.2的胃癌细胞系nci‑n87‑cldn18.2和nugc4‑cldn18.2细胞来测试adc的细胞杀灭活性。如图29a‑图29b所示，细胞存活力在用adc282a12f3(t62a)‑vcmmae和xi175d10‑vcmmae处理时以浓度依赖性方式降低。此外，与xi175d10‑vcmmae相比，282a12(t62a)‑vcmmaeadc诱导更高的细胞杀灭。与nci‑n87‑cldn18.2细胞相比，nugc4‑cldn18.2对adc诱导的细胞死亡更不敏感。[0448]实施例23‑adc在对adcc较不敏感的细胞上的细胞杀灭活性[0449]将用cldn18.2稳定转染并且已被证明对嵌合282a12f3(t62a)介导的adcc功效较不敏感的胰腺癌细胞系panc‑1‑cldn18.2(图30a)用于adc依赖性细胞杀灭测定中。如图30b所示，282a12f3(t62a)‑vcmmae和xi175d10‑vcmmae都以浓度依赖的方式抑制了panc‑1‑cldn18.2细胞的存活力，并且282a12f3(t62a)‑vcmmae比xi175d10‑vcmmae更强有力地诱导panc‑1‑cldn18.2细胞的细胞死亡。[0450]总之，抗‑cldn18.2‑adc杀灭了过表达cldn18.2的细胞系，包括hek293‑cldn18.2、nci‑n87‑cldn18.2和nugc4‑cldn18.2。282a12f3(t62a)‑vcmmae比xi175d10‑vcmmae更强有力抑制了所测试的细胞系的存活力。此外，未观察到在介于3.5与4.0之间的范围内的药物‑抗体‑比率调节adc的细胞杀灭活性(表26)。[0451]表26.cldn18.2特异性adc的细胞杀灭活性[0452][0453][0454]实施例24抗‑cldn18.2抗体在裸小鼠内的人胃癌ga0006患者来源的异种移植(pdx)模型中的功效。[0455]在裸小鼠内的患者来源的异种移植(pdx)模型中测试了抗‑cldn18.2抗体的体内功效。ga0006来源于一名亚洲胃癌患者的胃，该患者病理诊断为腺癌类型，具有多拷贝的erbb2。使用抗‑cldn18.2抗体通过ihc和facs分析证实了cldn18.2在ga0006上的高表达(数据未示出)。将约3mm×3mm×3mm大小的肿瘤皮下接种至balb/c裸小鼠的右脚踝中。当肿瘤的平均大小达到约100mm3时，将小鼠随机分为8组(每组8只小鼠)：pbs，higg1同种型(100mg/kg)，xi175d10‑v2，413h9f8‑h2l2‑v2‑dl和413h9f8‑cp2‑v2‑dl(50和100mg/kg)。肿瘤体积的变异系数小于40％，其通过公式：cv＝sd/mtv×100％来计算。随机分配当天被记录为第0天。在第0天启动小鼠的治疗。每周施用抗体3次，持续3周，静脉内和腹膜内注射交替进行。每周两次监测肿瘤大小。[0456]如图34所示，与同种型(100mg/kg)组相比，50mg/kg的xi175d10‑v2或413h9f8‑h2l2‑v2‑dl治疗延迟了肿瘤生长，但是没有达到显著性差异(p>0.05)。与用同种型(100mg/kg)治疗的那些相比，100mg/kg的xi175d10‑v2和413h9f8‑h2l2‑v2‑dl治疗显著抑制了肿瘤生长(p<0.05和p<0.01)。与用同种型(100mg/kg)治疗的那些相比，50和100mg/kg的413h9f8‑cp2‑v2‑dl治疗两者均显著抑制了肿瘤生长(p<0.0001)。与用xi175d10‑v2(50mg/kg)和413h9f8‑h2l2‑v2‑dl(50mg/kg)治疗的那些相比，50mg/kg的413h9f8‑cp2‑v2‑dl治疗显著抑制了肿瘤的生长(p<0.0001和p<0.01)。与用xi175d10‑v2(100mg/kg)和413h9f8‑h2l2‑v2‑dl(100mg/kg)治疗的那些相比，100mg/kg的413h9f8‑cp2‑v2‑dl治疗显著抑制了肿瘤生长(p<0.001和p<0.0001)。[0457]实施例25抗‑cldn18.2抗体在nu/nu小鼠内的小鼠胰腺癌异种移植模型中的功效[0458]在nu/nu小鼠内的皮下胰腺癌异种移植模型中测试了抗‑cldn18.2抗体的体内功效。将过表达cldn18.2的胰腺癌细胞系miapaca‑2(miapaca‑2‑cldn18.2)在体外作为单层培养物于37℃下和含5％co2的空气中维持在补充了10％胎牛血清、2.5％马血清、1％青霉素/链霉素、5μg/ml杀稻瘟素的dmem培养基中。通过胰蛋白酶‑edta处理，将miapaca‑2‑cldn18.2细胞每周常规继代培养两次。收获在指数生长期生长的miapaca‑2‑cldn18.2细胞，并对肿瘤接种量进行计数。在4‑6周的雌性nu/nu裸小鼠的右侧腹处皮下接种于0.2mlpbs(补充有matrigel,pbs:matrigel＝1:1)中的5×106个miapaca‑2‑cldn18.2细胞以用于肿瘤发育。肿瘤接种后3天启动荷有paca‑2‑cldn18.2肿瘤的nu/nu小鼠的治疗(每组10只小鼠)。每周施用抗‑cldn18.2抗体(10和40mg/kg)2次，持续5周，静脉内和腹膜内注射交替进行。将用pbs或同种型(higg1，40mg/kg)治疗的荷瘤nu/nu小鼠设为阴性对照。[0459]与用pbs或同种型(40mg/kg)治疗的小鼠相比，用10和40mg/kg的xi175d10‑v2、413h9f8‑h2l2‑v2‑dl治疗的小鼠显示出显著的肿瘤生长迟缓(p<0.01)(图35a‑d)。与用pbs或同种型(40mg/kg)治疗的小鼠相比，用40mg/kg的413h9f8‑cp2‑v2‑dl治疗的小鼠的肿瘤生长受到显著的抑制(p<0.01)(图35a和e)。与用pbs或同种型(40mg/kg)治疗的小鼠相比，用10mg/kg的413h9f8‑cp2‑v2‑dl治疗的小鼠的肿瘤生长受到了移植，但不具有显著性差异(图35a和e)。[0460]实施例26抗‑cld1n8.2抗体和化疗在人胃癌ga0006患者来源的异种移植(pdx)模型中的组合功效。[0461]如上所述的那样建立pdx小鼠模型。在第0天启动小鼠的治疗。将荷瘤小鼠用pbs、eof(1.25mg/kg表柔比星、3.25mg/kg奥沙利铂和56.25mg/kg5‑氟尿嘧啶)、xi175d10‑v2(40mg/kg)与eof的组合，或者413h9f8‑h2l2‑v2‑dl(40mg/kg)与eof的组合进行治疗。每周腹膜内施用eof一次。通过交替的静脉内注射和腹腔内注射每周施用抗体3次。每周两次监测肿瘤大小。总共进行了5次eof施用和14次抗体治疗。[0462]如图36所示，与用pbs治疗的那些相比，使用单独的eof或eof与xi175d10‑v2的组合，或413h9f8‑h2l2‑v2‑dl进行的治疗显著抑制了肿瘤生长(p<0.01)。413h9f8‑h2l2‑v2‑dl与eof的组合显示出比单独的eof疗法更优的效应(p<0.01)。然而，与单独的eof疗法相比，xi175d10‑v2与eof的组合并未显示出更好的效应(p＝0.147)。此外，413h9f8‑h2l2‑v2‑dl与eof的组合优于xi175d10‑v2与eof的组合(p<0.05)。[0463]实施例27[0464]表27例示了参考抗体175d10(xi175d10)的重链和轻链序列。[0465][0466][0467]虽然本文已经示出和描述本公开的优选实施方案，本领域的技术人员将显而易知此类实施方案仅以举例的方式提供。在不偏离本公开的情况下本领域技术人员将能想到许多变型、变化和替换。应当理解，可采用本文描述的本公开的实施方案的各种替代方案来实施本公开。意图所附权利要求书限定本公开的范围并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构因此被涵盖。当前第1页12当前第1页12
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