本发明属于以下领域：包含从哺乳动物消化道分离的细菌菌株的组合物以及所述组合物用于治疗疾病的用途。
发明背景
人类肠道被认为在子宫中是无菌的，但是在出生之后它立即暴露于各种各样的母体和环境微生物。此后，发生动态时间段的微生物定殖和演替，这受到例如以下因素的影响：分娩方式、环境、饮食和宿主基因型，全部这些都影响肠道微生物群的组成，在早期生命期间尤其如此。随后，微生物群稳定化并且变得类似成人[1]。人类肠道微生物群含有超过500-1000种不同的种系型，它们基本上属于两种主要的细菌分类：拟杆菌门(bacteroidetes)和厚壁菌门(firmicutes)[2]。由人类肠道的细菌定殖引起的成功的共生关系已产生各种各样的代谢、结构、保护性和其他有益的功能。所定殖肠道的增强的代谢活动确保以其他方式难以消化的膳食组分被降解并释放副产物，从而为宿主提供重要的营养物来源。类似地，肠道微生物群的免疫学重要性是公认的并且在无菌动物中示例，所述无菌动物具有在引入共生细菌后在功能上重构的受损免疫系统[3-5]。
微生物群组成的巨大变化在例如炎症性肠病(ibd)的胃肠病症中已有文献记载。举例来说，梭菌(clostridium)集群xiva细菌的水平在ibd患者中降低，而大肠杆菌(e.coli)的数量增加，这表明肠道内共生生物与病原生物的平衡的变化[6-9]。
在认识到某些细菌菌株对于动物肠道可能具有的潜在积极作用之后，已提出多种菌株用于治疗各种疾病(参见例如[10-13])。此外，已提出主要包括乳杆菌属(lactobacillus)和双歧杆菌属(bifidobacterium)菌株的某些菌株用于治疗与肠无直接关联的各种炎症性和自身免疫性疾病(关于综述，参见[14]和[15])。然而，不同疾病与不同细菌菌株之间的关系和特定细菌菌株对于肠道和在全身水平下以及对任何特定类型的疾病的确切作用并未被良好表征。
最近，已经研究了各种副拟杆菌属(parabacteroides)物种的抗炎特性和治疗特性。例如，狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)被证实在多种疾病模型如重度哮喘、类风湿性关节炎和多发性硬化中具有广泛的抗炎作用[16]。还已经在结直肠癌动物模型中以及在作为膜级分的此类体外细胞系上测试了狄氏副拟杆菌[17]。此外，已建议将狄氏副拟杆菌作为结直肠癌的预防剂[18]。已观察到其他副拟杆菌物种如古氏副拟杆菌(parabacteroidesgoldsteinii)的抗炎作用[19]。此外，还已经在体内癌症模型中测试了古氏副拟杆菌[20]、[21]。另外，在来自带有不同癌症类型的小鼠的汇总数据集中，已经提出了不同副拟杆菌属菌株的丰度同时具有促肿瘤作用和抗肿瘤作用的关联[22]。因此，副拟杆菌属菌株产生作用的机理尚未完全表征。此外，仍需鉴定对副拟杆菌属菌株有效的特定癌症亚型。
本领域中需要新的癌症疗法，以及需要待表征肠道细菌的潜在作用，以便可开发使用所述细菌的新疗法。
技术实现要素：
本发明人已经开发了使用肠道细菌来治疗和预防癌症的新疗法。
本发明人已经确定，来自副拟杆菌属的细菌菌株可有效治疗或预防包含致癌细胞外信号相关激酶(erk)信号传导的癌症。如实施例中所述，施用包含副拟杆菌属菌株的组合物可抑制癌细胞系中的erk信号传导；也就是说，相对于总erk蛋白，降低磷酸化erk的细胞水平。本发明人还已经确定，用副拟杆菌属菌株进行处理可降低包含致癌erk信号传导的癌细胞系的克隆源性存活，特别是在黑素瘤和结直肠癌细胞系中。本发明人还已经确定，用副拟杆菌属菌株进行处理可诱导微管相关蛋白2(map2)的基因表达，这表明其在治疗转移性癌症中的特定效用。此外，本发明人已经确定，用副拟杆菌属菌株进行处理可通过增强脾细胞增殖和增强脾细胞的免疫刺激性细胞因子的分泌来刺激免疫系统。因此，副拟杆菌属菌株在免疫受损或免疫抑制的受试者中可能具有特定效用。
在第一方面，本发明提供了一种包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防癌症的方法中，其中所述癌症包含致癌erk信号传导。
任何包含致癌erk信号传导的癌症都可通过包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物进行治疗或预防，并且优选是结直肠癌、黑素瘤、小肠癌如小肠腺癌、前列腺癌、肺腺癌如非小细胞肺腺癌、胰腺癌、膀胱癌、白血病如毛细胞白血病或急性髓系白血病、神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤、卵巢癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、精原细胞瘤、肝癌、骨髓增生异常综合征、肾癌或霍奇金病(hodgkin'sdisease)。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防包含braf中的致癌突变的癌症的方法中，任选地其中所述癌症还包含braf的过表达。本发明人已经确定，在包含致癌braf突变、特别是结直肠癌和黑素瘤细胞系中的致癌brafv600e突变的癌细胞系中，用副拟杆菌属菌株进行处理可抑制克隆源性存活，抑制erk信号传导并上调map2基因表达。因此，在优选的实施方案中，本发明还提供了一种包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防包含braf的第600位的致癌突变、优选brafv600e的癌症的方法中。在尤其优选的实施方案中，癌症是结直肠癌或黑素瘤。
除了或代替braf的第600位的致癌突变(例如v600e)，所述癌症可包含选自brafk601e、g469a、g469v、l597r、k601n、g464v、n581s、l597q、a598v、g464r、g466a或g469e的致癌突变；任选地其中所述癌症是结直肠癌。在另一种实施方案中，除了或代替v600e突变，所述癌症可包含选自brafv600k、v600r或v600d的致癌突变；任选地其中所述癌症是黑素瘤。
在本发明的优选实施方案中，组合物中的细菌菌株是狄氏副拟杆菌或古氏副拟杆菌，特别是狄氏副拟杆菌。也可使用密切相关的菌株，例如16srrna基因序列与狄氏副拟杆菌的细菌菌株的16srrna基因序列具(优先级递增)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的细菌菌株。细菌菌株可具有与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32具(优先级递增)至少90％、91％、92％、93％或94％同一性的16srrna基因序列。优选地，细菌菌株具有与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32具(优先级递增)至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列。优选地，序列同一性是与seqidno:9的序列同一性。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由seqidno:9表示的16srrna基因序列。最优选地，用于本发明的细菌菌株是以登录号ncimb42382保藏的狄氏副拟杆菌菌株。
在另一方面，本发明还提供了一种包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗结直肠癌如转移性结直肠癌的方法中。如实施例中所示，本发明人已经发现狄氏副拟杆菌菌株可抑制结直肠癌细胞系中的克隆源性存活和erk信号传导。
在另一方面，本发明还提供了一种包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗黑素瘤如转移性黑素瘤的方法中。如实施例中所示，本发明人已经发现狄氏副拟杆菌菌株可抑制黑素瘤细胞系中的克隆源性存活和erk信号传导。此外，狄氏副拟杆菌菌株在黑素瘤细胞系中诱导map2基因表达的能力表明针对转移性黑素瘤的特定功效。
在优选的实施方案中，相对于包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物的施用，同时、分别或依次施用braf抑制剂。优选地，所述braf抑制剂是brafv600e的选择性抑制剂，其优选地选自维罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafinib)或恩考芬尼(encorafenib)。更优选地，所述braf抑制剂是维罗非尼。
在另一方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含副拟杆菌属的细菌菌株和braf抑制剂，优选以上定义的那些，其用于同时、分别或依次使用以治疗或预防癌症。
在其他优选的实施方案中，相对于包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物的施用，同时、分别或依次施用胞苷类似物。优选地，所述胞苷类似物选自氮杂胞苷-c(azacytidine-c)、地西他滨(decitabine)或泽布拉林(zebularine)。更优选地，所述胞苷类似物是氮杂胞苷-c。
在另一方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含副拟杆菌属的细菌菌株和胞苷类似物，优选以上定义的那些，其用于同时、分别或依次使用以治疗或预防癌症。
在其他优选的实施方案中，相对于包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物的施用，同时、分别或依次施用微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂。优选地，所述微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂选自太平洋紫杉醇(paclitaxel)、阿伯沙星(abraxane)、多西紫杉醇(docetaxel)、埃博霉素(epothilone)、( )-海绵多羟基内酯(( )-discodermolide)、秋水仙碱、康普瑞汀(combretastatin)、2-甲氧基雌二醇、e7010、长春新碱、长春碱、长春瑞滨(vinorelbine)或长春氟宁(vinflunine)；更优选太平洋紫杉醇。
在另一方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含副拟杆菌属的细菌菌株和微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂，优选以上定义的那些，其用于同时、分别或依次使用以治疗或预防癌症。在另一方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含副拟杆菌属的细菌菌株，其用于通过增加癌症对微管蛋白聚合或解聚抑制剂(优选以上定义的那些)的敏感性而进行的癌症疗法中。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含已经冻干的细菌菌株。冻干是用于制备允许细菌递送的稳定组合物的有效且方便的技术。
在某些实施方案中，本发明提供了包含如上所述的组合物的食品。
在某些实施方案中，本发明提供了包含如上所述的组合物的疫苗组合物。
在另一方面，本发明还提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中抑制erk1和/或erk2信号传导的方法中。
在另一方面，本发明还提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中抑制erk1和/或erk2磷酸化的方法中。
在另一方面，本发明还提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导map2基因表达的方法中。
在另一方面，本发明还提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导gpr109a基因表达的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导tnf-α细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-1β细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-2细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导gm-csf细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导ifn-γ细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-27细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导ip-10细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导rantes细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-1α细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-1β细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-2细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-10细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-22细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-5细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-18细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-23细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导cxcl1细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-6细胞因子产生的方法中。
在另一方面，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防免疫受损或免疫抑制的受试者中的癌症。
在其他方面，本发明还提供了副拟杆菌属的各种细菌菌株(如下文在细菌菌株部分中所述)；优选地其中所述细菌菌株用于疗法中。
另外，本发明提供了一种治疗或预防癌症的方法，其中所述癌症包含致癌erk信号传导，所述方法包括施用包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物。
在某些实施方案中，本发明提供：
1.一种包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防受试者的癌症的方法中；其中所述癌症包含致癌erk信号传导。
2.根据实施方案1使用的组合物，其中所述癌症包括braf、nras、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、kras如kras4a或kras4b、mek1、mek2、erk1或erk2中的致癌突变或其过表达。
3.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述癌症包括rsk、dusp1、dusp5、dusp6或spry中的致癌突变或其表达下调。
4.根据实施方案2使用的组合物，其中所述癌症包括braf、kras、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、mek1、mek2、erk1或erk2中的致癌突变或其过表达。
5.根据实施方案2使用的组合物，其中所述癌症包括braf、nras、kras、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、mek1、mek2、erk1或erk2中的致癌突变。
6.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述癌症包括braf或nras中的致癌突变，任选地其中所述癌症还包含braf或nras的过表达。
7.根据实施方案6使用的组合物，其中所述癌症包含braf中的致癌突变，任选地其中所述癌症还包含braf的过表达。
8.根据实施方案7使用的组合物，其中所述癌症包含braf的第600位的致癌突变。
9.根据实施方案6-8中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含选自brafv600e、k601e、g469a、g469v、l597r、k601n、g464v、n581s、l597q、a598v、g464r、g466a或g469e的致癌突变；任选地其中所述癌症是结直肠癌。
10.根据实施方案6-8中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含选自brafv600e、v600k、v600r或v600d的致癌突变；任选地其中所述癌症是黑素瘤。
11.根据实施方案6-10中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含突变brafv600e。
12.根据实施方案6-11中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含致癌突变nrasq61r，任选地其中所述癌症是黑素瘤。
13.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含kras中、优选地kras的第13位的致癌突变，更优选地其中所述致癌突变是krasg13d。
14.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述癌症选自结直肠癌、黑素瘤、小肠癌如小肠腺癌、前列腺癌、肺腺癌如非小细胞肺腺癌、胰腺癌、膀胱癌、白血病如毛细胞白血病或急性髓系白血病、神经胶质瘤、毛细胞星形细胞瘤、卵巢癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、精原细胞瘤、肝癌、骨髓增生异常综合征、肾癌或霍奇金病。
15.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述癌症是结直肠癌。
16.根据实施方案1-14中任一项使用的组合物，其中所述癌症是黑素瘤。
17.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株是狄氏副拟杆菌、古氏副拟杆菌或粪副拟杆菌(parabacteroidesmerdae)物种。
18.根据实施方案17使用的组合物，其中所述细菌菌株是狄氏副拟杆菌或古氏副拟杆菌物种。
19.根据实施方案18使用的组合物，其中所述细菌菌株是狄氏副拟杆菌物种。
20.根据实施方案18使用的组合物，其中所述细菌菌株是古氏副拟杆菌物种。
21.一种包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗结直肠癌的方法中。
22.一种包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗黑素瘤的方法中。
23.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述癌症是转移性的。
24.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32具至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列。
25.根据实施方案24使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:9具至少90％、91％、92％、93％或94％，优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，更优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:9表示的16srrna基因序列。
26.根据实施方案25使用的组合物，其中所述细菌菌株是以登录号ncimb42382保藏的狄氏副拟杆菌菌株。
27.根据实施方案1-19或21-24中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:9、19、20、23、24、26或27具至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由seqidno:9、19、20、23、24或27表示的16srrna基因序列。
28.如实施方案1-18、20、23或24中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:17或18具至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由seqidno:17或18表示的16srrna基因序列。
29.如实施方案28所述的组合物，其中所述细菌菌株是以登录号dsmz19448或dsmz29187保藏的菌株。
30.如实施方案1-17、23或24中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:25具至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列或者其中所述细菌菌株具有由seqidno:25表示的16srrna基因序列。
31.如实施方案1-6或21-23中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:22或28具至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由seqidno:22或28表示的16srrna基因序列。
32.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中抑制erk1和/或erk2信号传导的方法中。
33.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中抑制erk1和/或erk2磷酸化的方法中。
34.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导map2基因表达的方法中。
35.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导gpr109a基因表达的方法中。
36.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导tnf-α细胞因子产生的方法中。
37.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-1β细胞因子产生的方法中。
38.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-2细胞因子产生的方法中。
39.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导gm-csf细胞因子产生的方法中。
40.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导ifn-γ细胞因子产生的方法中。
41.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-27细胞因子产生的方法中。
42.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导ip-10细胞因子产生的方法中。
43.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导rantes细胞因子产生的方法中。
44.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-1α细胞因子产生的方法中。
45.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-1β细胞因子产生的方法中。
46.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-2细胞因子产生的方法中。
47.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-10细胞因子产生的方法中。
48.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-22细胞因子产生的方法中。
49.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-5细胞因子产生的方法中。
50.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-18细胞因子产生的方法中。
51.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-23细胞因子产生的方法中。
52.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导cxcl1细胞因子产生的方法中。
53.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-6细胞因子产生的方法中。
54.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症的治疗或预防中减小肿瘤大小、肿瘤生长，预防或抑制转移，或预防血管生成的方法中。
55.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，所述组合物用于在癌症治疗中抑制转移的方法中。
56.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中相对于所述组合物的施用，所述方法包括同时、分别或依次施用braf抑制剂。
57.根据实施方案56使用的组合物，其中所述braf选择性地抑制brafv600e，优选地其中所述braf抑制剂选自维罗非尼、达拉非尼或恩考芬尼。
58.根据实施方案57使用的组合物，其中所述braf抑制剂是维罗非尼。
59.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中相对于所述组合物的施用，所述方法包括同时、分别或依次施用胞苷类似物。
60.根据实施方案59使用的组合物，其中所述胞苷类似物选自氮杂胞苷-c、地西他滨或泽布拉林。
61.根据实施方案60使用的组合物，其中所述胞苷类似物是氮杂胞苷-c。
62.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中相对于所述组合物的施用，所述方法包括同时、分别或依次施用微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂。
63.根据实施方案62使用的组合物，其中所述微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂选自太平洋紫杉醇、阿伯沙星、多西紫杉醇、埃博霉素、( )-海绵多羟基内酯、秋水仙碱、康普瑞汀、2-甲氧基雌二醇、e7010、长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春氟宁。
64.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述组合物用于经口施用，任选地其中所述组合物是经口施用的。
65.根据实施方案1-63使用的组合物，其中所述组合物用于肿瘤内施用，任选地其中所述组合物是经肿瘤内施用的。
66.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
67.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。
68.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中在施用所述组合物之前已经确定了所述癌症的突变状态，优选地其中在施用所述组合物之前所述癌症已经被确定为包含如实施方案2-13中任一项所述的致癌突变。
69.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述受试者是免疫受损的。
70.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述受试者是免疫抑制的。
71.根据实施方案69或70使用的组合物，其中与无癌症受试者的淋巴结相比，所述受试者在淋巴结如转移性淋巴结内具有升高数量的调节性t细胞(treg)。
72.根据实施方案63-71中任一项使用的组合物，其中与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的外周血单核细胞(pbmc)内具有升高数量的treg。
73.根据实施方案63-72中任一项使用的组合物，其中与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的pbmc内具有升高数量的髓样树突状细胞(mdc)。
74.根据实施方案63-73中任一项使用的组合物，其中与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的pbmc内具有升高数量的浆细胞样树突状细胞(pdc)。
75.一种食品，所述食品包含任何前述实施方案的组合物，所述食品用于任何前述实施方案。
76.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含任何前述实施方案的组合物，所述疫苗组合物用于任何前述实施方案。
77.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中当施用于所述受试者时所述细菌菌株是活的。
78.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株被施用于人类受试者。
79.根据前述实施方案中任一项使用的组合物，其中所述组合物不含任何其他细菌菌株或物种，或者其中所述组合物仅包含极少量或生物学上不相关量的其他细菌菌株或物种。
附图说明
图1：相对于gapdh，在各种处理后skmel2细胞系中map2的基因表达(“ycfa”＝ycfa )。
图2：在各种处理后skmel2细胞系的克隆源性存活(“ycfa”＝ycfa )。
图3：在各种处理后skmel2细胞系的软琼脂生长(“ycfa”＝ycfa )。
图4：在各种处理后skmel2细胞系中的erk信号传导(磷酸化的erk1和erk2(p44和p42)/总erk)(“ycfa”＝ycfa )。
图5：相对于gapdh，在各种处理后skmel28细胞系中map2的基因表达(“ycfa”＝ycfa )
图6：在各种处理后skmel28细胞系的克隆源性存活(“ycfa”＝ycfa )。
图7：在各种处理后skmel28细胞系的软琼脂生长(“ycfa”＝ycfa )。
图8：在各种处理后skmel28细胞系中的erk信号传导(磷酸化的erk1和erk2(p44和p42)/总erk)(“ycfa”＝ycfa )。
图9：相对于gapdh，在各种处理后skmel31细胞系中map2的基因表达(“ycfa”＝ycfa )。
图10：在各种处理后skmel31细胞系的克隆源性存活(“ycfa”＝ycfa )。
图11：在各种处理后skmel31细胞系的软琼脂生长(“ycfa”＝ycfa )。
图12：在各种处理后skmel31细胞系中的erk信号传导(磷酸化的erk1和erk2(p44和p42)/总erk)(“ycfa”＝ycfa )。
图13：相对于gapdh，在各种处理后451lu细胞系中map2的基因表达(“ycfa”＝ycfa )。
图14：在各种处理后451lu细胞系的克隆源性存活(“ycfa”＝ycfa )。
图15：在各种处理后451lu细胞系的软琼脂生长(“ycfa”＝ycfa )。
图16：在各种处理后451lu细胞系中的erk信号传导(磷酸化的erk1和erk2(p44和p42)/总erk)(“ycfa”＝ycfa )。
图17：相对于gapdh，在各种处理后ht-29细胞系中map2的基因表达(“ycfa”＝ycfa )。
图18：在各种处理后ht-29细胞系的克隆源性存活(“ycfa”＝ycfa )。
图19a：在各种处理后ht-29细胞系的软琼脂生长(“ycfa”＝ycfa )。
图19b：在各种处理后ht-29细胞系的软琼脂生长(琼脂板照片)(“ycfa”＝ycfa )。
图20：在各种处理后ht29细胞系中的erk信号传导(磷酸化的erk1和erk2(p44和p42)/总erk)(“ycfa”＝ycfa )。
图21：除ncimb42382外，(a)具有佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯处理和(b)不具有佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯处理的甲氨蝶呤处理的ht29细胞中的gpr109arna表达(“ycfa”＝ycfa )。
图22：(a)具有条件培养基的ncimb42382和(b)单独的ncimb42382对ht29细胞的tnf-α分泌的诱导。
图23：使用(a)rapidid32a和(b)api50chl系统获得的ncimb42382的发酵概况。
图24：mapk途径概述(来自[26])。
图25：用副拟杆菌属菌株处理后的脾细胞增殖(“ycfa”＝ycfa )。
图26：用各种副拟杆菌属菌株处理后的脾细胞的细胞因子分泌—(a)tnf-α，(b)il-1β，(c)il-2，(d)gm-csf，(e)ifn-γ，(f)il-27，(g)il-10，(h)il-6，(i)mip-2，(j)mip-1α，(k)mip-1β，(l)il-22，(m)rantes，(n)ip-10，(o)il-4，(p)il-5，(q)il-18，(r)il-23，(s)il-9，(t)cxcl1，(u)mcp-3，(v)mcp-1和(w)il-17a(“ycfa”＝ycfa )。
图27：在各种处理后，skmel2黑素瘤细胞系中的磷酸化erk(perk)染色强度(“vem”＝维罗非尼，“azac”＝氮杂胞苷c)。
图28：在各种处理后，skmel28黑素瘤细胞系中的磷酸化erk(perk)染色强度(“vem”＝维罗非尼，“azac”＝氮杂胞苷c，bu＝2mm丁酸钠)。
图29：在各种处理后，skmel31黑素瘤细胞系中的磷酸化erk(perk)染色强度(“vem”＝维罗非尼，“azac”＝氮杂胞苷c)。
图30：在各种处理后，451lu黑素瘤细胞系中的磷酸化erk(perk)染色强度(“vem”＝维罗非尼，“azac”＝氮杂胞苷c)。
图31：在各种处理后，ht29结直肠癌细胞系中的磷酸化erk(perk)染色强度(“vem”＝维罗非尼，“azac”＝氮杂胞苷c)。
图32：在各种处理后，hct116结直肠癌细胞系中的磷酸化erk(perk)染色强度(“vem”＝维罗非尼，“azac”＝氮杂胞苷c)。
图33：用各种副拟杆菌属菌株处理后的脾细胞的细胞因子分泌—(a)菌株参考9(狄氏副拟杆菌)，(b)菌株参考10(约氏副拟杆菌(p.johnsonii))，(c)菌株参考7(粪副拟杆菌)，(d)菌株参考11(副拟杆菌属种)，(e)菌株参考2(狄氏副拟杆菌)，(f)菌株参考12(副拟杆菌属种)，(g)菌株参考13(副拟杆菌属种)，(h)菌株参考14(副拟杆菌属种)和(i)菌株参考15(副拟杆菌属种)。
具体实施方式
细菌菌株
本发明的组合物包含副拟杆菌属的细菌菌株。实施例表明该属细菌可用于治疗或预防癌症，其中所述癌症包含致癌erk信号传导。
用于本发明的副拟杆菌属物种的实例包括狄氏副拟杆菌、古氏副拟杆菌、粪副拟杆菌和约氏副拟杆菌。戈氏副拟杆菌(parabacteroidesgordonii)是用于本发明的另一示例性物种。优选的细菌菌株是狄氏副拟杆菌、古氏副拟杆菌和粪副拟杆菌物种，其中狄氏副拟杆菌是尤其优选的。
副拟杆菌属类似于拟杆菌属，并且是革兰氏阴性，专性厌氧，无孢子形成，不活动且呈杆状，并且大小为0.8-1.6×1.2-12μm。狄氏副拟杆菌是人类粪便中最常见的物种之一。狄氏副拟杆菌的典型菌株是jcm5825t(＝ccug4941t＝dsm20701t＝atcc8503t)。狄氏副拟杆菌菌株jcm5825t、jcm13400、jcm13401、jcm13402、jcm13403和jcm13404以及粪副拟杆菌菌株jcm9497t和jcm13405的16srrna基因序列的genbank/embl/ddbj登录号分别为ab238922-ab238929(本文公开为seqidno:1-8)。古氏副拟杆菌的典型菌株是jcm13446t/wal12034(＝ccug48944t)。古氏副拟杆菌菌株jcm13446的16srrna部分基因序列的genbank/embl/ddbj登录号是ay974070(本文公开为seqidno:10)。示例性菌株也在[23]中描述。戈氏副拟杆菌的典型菌株是ms-1t(＝jcm15724t＝ccug57478t)。菌株ms-1t的16srrna基因序列的genbank/embl/ddbj登录号是ab470343(本文公开为seqidno:33)。
在实施例中测试了以登录号ncimb42382保藏的狄氏副拟杆菌细菌，并在本文中也称为菌株755。所测试的755菌株的16srrna基因序列以seqidno:9提供。菌株755在2015年3月12日以“副拟杆菌属755种”由gtbiologics有限公司(lifesciencesinnovationbuilding,aberdeen,ab252zs,苏格兰)保藏于国际保藏机构ncimb有限公司(fergusonbuilding,aberdeen,ab219ya,苏格兰)并指定登录号ncimb42382。gtbiologics有限公司随后更名为4dpharmaresearch有限公司。
wo2016/203220描述了向小鼠施用菌株755，并显示其可影响肠道外的疾病过程(例如哮喘和关节炎)。wo2016/203220的seqidno:10提供了菌株755的基因组序列。该序列是使用pacbiorsii平台生成的。
在实施例中测试了以登录号dsmz19448和dsmz29187保藏的古氏副拟杆菌菌株。菌株dsmz19448的16srrna基因序列以seqidno:17提供。菌株dsmz19448的16srrna基因序列以seqidno:18提供。菌株已保藏在dsmz-德国微生物和细胞培养保藏公司(inhoffenstr.7b38124，德国不伦瑞克)并且是公开可用的。
在实施例中还测试了以下所测试的副拟杆菌属菌株：菌株参考1(狄氏副拟杆菌)、菌株参考2(狄氏副拟杆菌)、菌株参考3(副拟杆菌属种)、菌株参考4(约氏副拟杆菌)、菌株参考5(狄氏副拟杆菌)、菌株参考6(狄氏副拟杆菌)、菌株参考7(粪副拟杆菌)、菌株参考8(狄氏副拟杆菌)、菌株参考9(狄氏副拟杆菌)、菌株参考10(约氏副拟杆菌)、菌株参考11(副拟杆菌属种)、菌株参考12(副拟杆菌属种)、菌株参考13(副拟杆菌属种)、菌株参考14(副拟杆菌属种)、菌株参考15(副拟杆菌属种)。菌株参考1(狄氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:19提供。菌株参考2(狄氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:20提供。菌株参考3(副拟杆菌属种)的16srrna基因序列以seqidno:21提供。菌株参考4(约氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:22提供。菌株参考5(狄氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:23提供。菌株参考6(狄氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:24提供。菌株参考7(粪副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:25提供。菌株参考8(狄氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:26提供。菌株参考9(狄氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:27提供。菌株参考10(约氏副拟杆菌)的16srrna基因序列以seqidno:28提供。菌株参考11(副拟杆菌属种)的16srrna基因序列以seqidno:29提供。菌株参考12(副拟杆菌属种)的16srrna基因序列以seqidno:30提供。菌株参考14(副拟杆菌属种)的16srrna基因序列以seqidno:31提供。菌株参考15(副拟杆菌属种)的16srrna基因序列以seqidno:32提供。
本发明还提供了狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:19具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:19表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:20具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:20表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:21具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:21表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了约氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:22具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:22表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:23具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:23表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:24具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:24表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了粪副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:25具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:25表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:26具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:26表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:27具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:27表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了约氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:28具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:28表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:29具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:29表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:30具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:30表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:31具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:31表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
本发明还提供了副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与seqidno:32具(优先级递增)至少98％、99％或99.5％同一性的16srrna基因序列，优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:32表示的16srrna基因序列。优选地，所述细菌菌株用于疗法中。
与实施例中测试的菌株密切相关的细菌菌株也预期可有效治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株的16srrna基因序列与狄氏副拟杆菌的细菌菌株的16srrna基因序列具有(优先级递增)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。用于本发明的细菌菌株的16srrna基因序列可与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32，优选地与seqidno:9具有(优先级递增)至少90％、91％、92％、93％或94％同一性。优选地，用于本发明的细菌菌株的16srrna基因序列与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32具有(优先级递增)至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。优选地，序列同一性是与seqidno:9的序列同一性。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由seqidno:9表示的16srrna基因序列。最优选地，用于本发明的细菌菌株是以登录号ncimb42382保藏的狄氏副拟杆菌菌株。
在本发明的组合物中使用的细菌菌株是狄氏副拟杆菌物种的实施方案中，优选的菌株具有与seqidno:9、19、20、23、24、26或27，优选地与seqidno:9具(优先级递增)至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列。更优选地，这些优选菌株具有由seqidno:9、19、20、23、24、26或27，特别是seqidno:9表示的16srrna基因序列。最优选地，所述细菌菌株是以登录号ncimb43382保藏的狄氏副拟杆菌菌株。
在本发明的组合物中使用的细菌菌株是古氏副拟杆菌物种的实施方案中，优选的菌株具有与seqidno:17或18具(优先级递增)至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，或者更优选具有由seqidno:17或18表示的16srrna基因序列，或者最优选是以登录号dsmz19448和dsmz29187保藏的古氏副拟杆菌菌株。
在本发明的组合物中使用的细菌菌株是粪副拟杆菌物种的实施方案中，优选的菌株具有与seqidno:25具(优先级递增)至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，或者更优选具有由seqidno:25表示的16srrna基因序列。
在本发明的组合物中使用的细菌菌株是约氏副拟杆菌物种的实施方案中，优选的菌株具有与seqidno:22或28具(优先级递增)至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，或者更优选具有由seqidno:22或28表示的16srrna基因序列。
在本发明的组合物中使用的细菌菌株是戈氏副拟杆菌物种的实施方案中，优选的菌株具有与seqidno:33具(优先级递增)至少98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，或者更优选具有由seqidno:33表示的16srrna基因序列。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包含活细菌。在优选的实施方案中，本发明的组合物包含活性状态的活细菌，优选冻干的活细菌。
在优选的实施方案中，本发明组合物中的副拟杆菌属细菌菌株具有抑制erk信号传导的作用。可通过将细菌菌株或其上清液与包含致癌erk信号传导的癌细胞系(例如实施例中使用的451lu或ht29)一起培养，并例如通过量化磷酸化erk相对于总erk的细胞水平以测量对erk信号传导的抑制作用来鉴定这种作用。这可通过蛋白质印迹分析，使用对磷酸化erk具有特异性的一级抗体和对erk具有特异性而与磷酸化状态无关的一级抗体来进行，如实施例中所进行。然后可将连接到能够催化发色反应的剂(例如辣根过氧化物酶)的对一级抗体具有特异性的二级抗体用于可视化和量化磷酸化erk相对于总erk的水平，如实施例中所进行。“抑制”erk信号传导是指与不存在所述施用相比，将副拟杆菌属细菌菌株施用于癌细胞系降低了磷酸化erk的细胞水平(相对于总erk)。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含以登录号ncimb42382保藏的细菌的生物型。作为以登录号42382保藏的细菌的生物型的细菌菌株也预期可有效治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。生物型是具有相同或非常相似的生理和生化特性的密切相关的菌株。
可通过对以登录号ncimb42382保藏的细菌的其他核苷酸序列进行测序，来鉴定作为以登录号ncimb42382保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株。例如，可对基本上整个基因组进行测序，并且用于本发明的生物型菌株可在其整个基因组的至少80％上(例如在至少85％、90％、95％或99％上，或在其整个基因组上)具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。用于鉴定生物型菌株的其他合适的序列可包括hsp60或重复序列，例如box、eric、(gtg)5或rep或[24]。生物型菌株可具有与以登录号ncimb42382保藏的细菌的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与wo2016/203220的seqidno:10具序列同一性的基因组。在优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有在wo2016/203220的seqidno:10的至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)上与wo2016/203220的seqidno:10具至少90％序列同一性(例如至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的基因组。例如，用于本发明的细菌菌株可具有在seqidno:10的70％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少90％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的80％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少90％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的90％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少90％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的100％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少90％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的70％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少95％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的80％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少95％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的90％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少95％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的100％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少95％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的70％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少98％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的80％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少98％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的90％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少98％序列同一性，或在wo2016/203220的seqidno:10的100％上与wo2016/203220的seqidno:10具至少98％序列同一性的基因组。
或者，可通过使用登录号ncimb42382保藏物和限制性片段分析和/或pcr分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(faflp)和重复dna元件(rep)-pcr指纹图谱或蛋白质谱分析或部分16s或23srdna测序，来鉴定作为以登录号ncimb42382保藏的细菌的生物型并适用于本发明的菌株。在优选的实施方案中，这样的技术可用于鉴定其他狄氏副拟杆菌菌株。
在某些实施方案中，作为以登录号ncimb42382保藏的细菌的生物型并适用于本发明的菌株是当通过扩增核糖体dna限制性分析(ardra)，例如当使用sau3ai限制性酶分析时(关于示例性方法和指导，参见例如[25])，提供与以登录号ncimb42382保藏的细菌相同模式的菌株。
或者，将生物型菌株鉴定为具有与以登录号ncimb42382保藏的细菌相同的碳水化合物发酵模式的菌株(参见实施例8和图23)。或者，将生物型菌株鉴定为具有与以登录号ncimb42382保藏的细菌相同的氨基酸发酵模式的菌株(参见实施例8和图23)。
在优选的实施方案中，本发明中使用的生物型细菌菌株(特别是狄氏副拟杆菌细菌菌株)，例如当在适当的悬浮培养基(例如api悬浮培养基)中于37℃培养4小时时，表现出针对以下中的一种或多种，例如以下中的(优先级递增)2、3、4或全部5种的酶活性：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和碱性磷酸酶。本发明中使用的生物型细菌菌株(特别是狄氏副拟杆菌细菌菌株)，例如当在适当的悬浮培养基(例如api悬浮培养基)中于37℃培养4小时时，优选能够使以下中的一种或多种，例如以下中的(优先级递增)2、3、4、5或全部6种发酵：精氨酸、亮氨酰-甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸、组氨酸和谷氨酰谷氨酸。本发明中使用的生物型细菌菌株(特别是狄氏副拟杆菌细菌菌株)，例如当在适当的悬浮培养基(例如api悬浮培养基)中于37℃培养4小时时，更优选能够使以下中的一种或多种，例如以下中的(优先级递增)2、3、4、5或全部6种发酵：精氨酸、亮氨酰-甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸、组氨酸和谷氨酰谷氨酸，并且表现出针对以下中的一种或多种，例如以下中的(优先级递增)2、3、4或全部5种的酶活性：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和碱性磷酸酶。本领域已知的任何合适的测定法可用于评估细菌使碳水化合物源或氨基酸发酵的能力。优选地，使用rapidid32a分析(优选使用来自biomérieux的rapidid32a系统)。
在替代的优选实施方案中，本发明中使用的生物型细菌菌株(特别是狄氏副拟杆菌细菌菌株)能够使以下中的一种或多种，例如以下中的(优先级递增)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或全部15种发酵：果糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、熊果苷、七叶苷、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、淀粉、糖原、松二糖和岩藻糖。优选地，本发明中使用的生物型细菌菌株(特别是狄氏副拟杆菌细菌菌株)此外表现出以下中的一种或多种，例如以下中的(优先级递增)2、3、4、5、6、7或全部8种的中间发酵：木糖、n-乙酰氨基葡萄糖、苦杏仁苷、水杨苷、纤维二糖、海藻糖、松三糖和龙胆二糖。在这样的实施方案中，本领域已知的任何合适的测定法可用于评估细菌使碳水化合物源发酵的能力。优选地，使用api50ch分析(优选使用来自biomérieux的api50ch系统)。
本发明中使用的尤其优选的生物型细菌菌株(特别是狄氏副拟杆菌细菌菌株)(i)表现出对α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和碱性磷酸酶的酶活性；(ii)能够使精氨酸、亮氨酰-甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸、组氨酸和谷氨酰谷氨酸发酵；以及(iii)能够使果糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、熊果苷、七叶苷、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、淀粉、糖原、松二糖和岩藻糖发酵。此外，生物型细菌菌株优选地(iv)表现出木糖、n-乙酰氨基葡萄糖、苦杏仁苷、水杨苷、纤维二糖、海藻糖、松三糖和龙胆二糖的中间发酵。(i)和(ii)优选在将细菌菌株在适当的悬浮培养基(例如api悬浮培养基)中于37℃培养4小时时进行评估，并通过rapidid32a分析(优选使用来自biomérieux的rapidid32a系统)进行评估。(iii)和(iv)优选通过api50ch分析(优选使用来自biomérieux的api50ch系统)进行评估。
另外或可替代地，菌株ncimb42382的生物型将增加脾细胞的增殖，例如与未处理的脾细胞或用对照培养基(例如ycfa 培养基)处理的脾细胞相比增加至更大程度，这可使用测量3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(mtt)转化为mtt-甲臜的测定法，例如通过比色检测mtt-甲臜(例如如实施例10中)来确定。另外或可替代地，菌株ncimb42382的生物型将增加脾细胞的细胞因子tnf-α、il-1β、il-27、il-10、mip-2、mip-1α、mip-1β、il-22、il-5、il-18、il-23、cxcl1、il-2、gm-csf、ifn-γ、il-6、ip-10和/或rantes中的一种或多种、优选全部的产生，例如与未处理的脾细胞或用对照培养基(例如ycfa 培养基)处理的脾细胞相比增加至更大程度，这可通过细胞因子免疫测定法(例如，如实施例11和12中使用的来自thermofischerscientific的26重小鼠procartaplextm多重免疫测定法)来确定。
可使用任何适当的方法或策略，包括实施例中所述的测定法，来鉴定可用于本发明的组合物和方法中的其他副拟杆菌属菌株，例如以登录号ncimb42382保藏的细菌的生物型。优选地，生物型将具有抑制erk信号传导的作用，这可如上文和实施例中所述来确定。与以登录号ncimb42382保藏的细菌具有相似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株也可用于本发明。有用的菌株可能对癌细胞系如451lu或ht29中的erk信号传导具有与ncimb42382菌株相当的抑制活性。有用的菌株还可对癌细胞系如451lu或ht29的克隆源性存活引起与ncimb42382菌株相当的作用。有用的菌株还可对癌细胞系如skmel2中的map2基因表达引起与ncimb42382菌株相当的上调。
另外或可替代地，菌株ncimb42382的衍生物将增加脾细胞的增殖，例如与未处理的脾细胞或用对照培养基(例如ycfa 培养基)处理的脾细胞相比增加至更大程度，这可使用测量3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(mtt)转化为mtt-甲臜的测定法，例如通过比色检测mtt-甲臜(例如如实施例10中)来确定。另外或可替代地，菌株ncimb42382的衍生物将增加脾细胞的细胞因子tnf-α、il-1β、il-27、il-10、mip-2、mip-1α、mip-1β、il-22、il-5、il-18、il-23、cxcl1、il-2、gm-csf、ifn-γ、il-6、ip-10和/或rantes中的一种或多种、优选全部的产生，例如与未处理的脾细胞或用对照培养基(例如ycfa 培养基)处理的脾细胞相比增加至更大程度，这可通过细胞因子免疫测定法(例如，如实施例11和12中使用的来自thermofischerscientific的26重小鼠procartaplextm多重免疫测定法)来确定。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含以登录号ncimb42382保藏的细菌的衍生物。以登录号ncimb42382保藏的菌株的衍生物可以是子代菌株(后代)或从原始菌株培养(亚克隆)的菌株。本发明的菌株的衍生物可例如在遗传水平上被修饰而不破坏生物活性。特别地，本发明的衍生菌株具有治疗活性。衍生菌株将具有与原始ncimb42382菌株相当的免疫调节活性。特别地，衍生菌株将对癌细胞系的致癌erk信号传导和克隆源性存活引起与ncimb42382菌株所显示的作用相当的作用，其可通过使用实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。ncimb42382菌株的衍生物通常将是ncimb42382菌株的生物型。
对以登录号ncimb42382保藏的狄氏副拟杆菌菌株的细胞的提及涵盖任何具有与以登录号ncimb42382保藏的菌株相同的安全性和治疗功效特性的细胞，并且本发明涵盖此类细胞。
对以登录号ncimb42382保藏的副拟杆菌属菌株的细胞的提及涵盖任何具有与以登录号ncimb42382保藏的菌株相同的安全性和治疗功效特性的细胞，并且本发明涵盖此类细胞。因此，所述组合物可包含副拟杆菌属菌株，其不是以登录号ncimb42382保藏的菌株，但是具有与以登录号ncimb42382保藏的菌株相同的安全性和治疗功效特性。可例如通过测试菌株对抗生素的抗性，例如区分对抗生素的固有抗性和可传播抗性，来建立菌株的安全特性。也可通过在体外评估菌株的致病特性，例如毒素产生水平来建立菌株的安全特性。其他安全性测试包括在大鼠和小鼠模型中测试细菌菌株的急性或慢性毒性。菌株的治疗功效可通过使用相关模型在体外和体内对细菌菌株进行功能表征来建立。
在优选的实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是活的菌株，并且能够部分或全部定殖于肠。
在某些优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株能够增加脾细胞的增殖。这可使用测量3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(mtt)转化为mtt-甲臜的测定法，例如通过比色检测mtt-甲臜(例如如实施例10中)来确定。
在某些优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株能够增加来自脾细胞的tnf-α、il-1β、il-27、il-10、mip-2、mip-1α、mip-1β、il-22、il-5、il-18、il-23、cxcl1、il-2、gm-csf、ifn-γ、il-6、ip-10和/或rantes细胞因子中的一种或多种，优选全部的产生。这可通过细胞因子免疫测定法(例如，如实施例11和12中使用的来自thermofischerscientific的26重小鼠procartaplextm多重免疫测定法)来确定。
在某些优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株产生乙酸。在某些优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株产生丙酸。在某些优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株产生乙酸和丙酸。乙酸和/或丙酸的产生可使用气相色谱法/质谱法(例如，如实施例13和14中)来确定。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以登录号ncimb42382保藏的菌株。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以登录号ncimb42382保藏的菌株。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是粪副拟杆菌物种。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是古氏副拟杆菌物种。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是副拟杆菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株既不是粪副拟杆菌物种，也不是古氏副拟杆菌物种。
治疗用途
癌症及其特征
在一个方面，本发明的组合物用于治疗或预防癌症，其中所述癌症包含致癌erk信号传导。细胞外信号相关激酶(erk)是丝裂原激活蛋白(map)激酶(mapk)途径中的下游效应子，所述途径是在所有真核生物中都高度保守的信号转导途径[26]。mapk途径调节例如细胞增殖、分化、存活和凋亡的过程，并且所述途径的异常激活与癌症发病机理密切相关。
如本文所用，“致癌erk信号传导”是指癌症包含失调的细胞信号传导，例如经由mapk途径的刺激非依赖性信号传导，其结果是erk的过度活跃的信号传导(erk1或erk2同工型，或两者)，这会驱动增加的癌细胞增殖和/或存活。当在位置thr202和tyr204处磷酸化时，erk1是有活性的(即信号传导)。当在位置thr173和tyr185处磷酸化时，erk2是有活性的(即信号传导)。因此，“致癌erk信号传导”可能是由于存在(功能突变获得)中的致癌突变或mapk途径的正调控因子的过表达，或(功能突变丧失)中的致癌突变或mapk途径的负调控因子的表达下调引起的。
包含致癌erk信号传导的癌症可替代地定义为“带有”、“表现”或“特征为”致癌erk信号传导的癌症。包含致癌erk信号传导的癌症可替代地定义为其中通过erk信号传导“刺激”、“诱导”或“上调”恶性细胞的增殖和/或存活的癌症。包含致癌erk的癌症可替代地定义为带有、包含、表现或特征为“刺激非依赖性”erk信号传导的癌症。
相对于野生型蛋白质，“致癌突变”涵盖蛋白质中任何可促进癌细胞增殖和/或存活的氨基酸变异，包括但不限于取代(包括单个氨基酸取代)、插入和/或缺失。如上所述，致癌突变可能是功能丧失或功能获得突变，这取决于mapk途径中的蛋白质及其功能。“过表达”或“下调的表达”分别是指相对于非肿瘤细胞，在肿瘤细胞中蛋白质的表达增加或减少。
因此，包含致癌erk信号传导的癌症包括那些包含以下各者中的致癌突变或其过表达的癌症：braf、nras、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、kras如kras4a或kras4b、mek1、mek2、erk1或erk2；例如braf、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、mek1、mek2、erk1或erk2。这些蛋白质是mapk途径的正调控因子(即致癌蛋白)[26]。例如，癌症可包含braf、nras、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、mek1、mek2、erk1或erk2中的致癌突变。
包含致癌erk信号传导的癌症还包括那些包含rsk、dusp1、dusp5、dusp6或spry中的致癌突变或表达下调(上述致癌突变/过表达的替代或补充)的癌症。这些蛋白质是mapk途径的负调控因子(即肿瘤抑制蛋白)[26]。
可使用本发明的组合物治疗或预防任何包含致癌erk信号传导的癌症，例如实体瘤或血液系统恶性肿瘤。此类癌症包括但不限于结直肠癌、黑素瘤、小肠癌如小肠腺癌、急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma)、类癌肿瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、慢性骨髓增生性病症、皮肤t细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma)、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞瘤、儿童期视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤(kaposisarcoma)、肾细胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、咽癌、垂体腺瘤、浆细胞赘瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。
优选地，可使用本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)治疗或预防的包含致癌erk信号传导的癌症包括但不限于结直肠癌、黑素瘤、小肠癌如小肠腺癌、前列腺癌、肺腺癌如非小细胞性肺腺癌、胰腺癌、膀胱癌、白血病如毛细胞白血病或急性髓系白血病、神经胶质瘤、毛细胞星形细胞瘤、卵巢癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、精原细胞瘤、肝癌、骨髓增生异常综合征、肾癌和霍奇金病。已报道，此类癌症包含过度活跃的mapk途径(即致癌erk信号传导)[26]。
如实施例中所示，众多副拟杆菌属菌株引起免疫刺激作用，例如脾细胞增殖和细胞因子分泌。因此，本发明的组合物在免疫受损或免疫抑制的受试者中可能特别有效。受试者可由于任何原因而免疫受损或免疫抑制，包括但不限于器官接受，医源性免疫抑制，免疫抑制感染(例如hiv感染)的存在和/或肿瘤引起的免疫抑制。优选地，由于肿瘤引起的免疫抑制(即，由于癌症，例如包含致癌erk信号传导的癌症)，使受试者免疫受损或免疫抑制。
与无癌症受试者相比，免疫受损或免疫抑制(特别是由于肿瘤引起的免疫抑制)的受试者可能在淋巴结(特别是转移性淋巴结)内和/或一定体积的外周血单核细胞(pbmc)内表现出升高数量的调节性t细胞(treg)(参见例如[27]、[28])。因此，与无癌症受试者的淋巴结相比，本发明的组合物优选用于在淋巴结(例如转移性淋巴结)内具有升高数量的调节性t细胞(treg)的受试者。例如，本发明的组合物优选用于在从淋巴结(例如转移性淋巴结)获得的cd4 t细胞群内表现出(优先级递增)至少7％、至少8％、至少9％或至少10％(例如介于7％与12％之间)treg(例如cd25 cd4 t细胞)的频率的受试者中(参见例如[28])。除上述之外或作为上述的替代，优选地，与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的pbmc中具有升高数量的treg。在这些实施方案中，treg可替代地定义为cd4 cd25 细胞、foxp3 细胞、或cd4 cd25 和foxp3 细胞(参见[34])。除上述之外或作为上述的替代，与无癌症受试者相比，免疫受损或免疫抑制的受试者可表现出更高数量的髓样树突状细胞(mdc)和/或浆细胞样树突状细胞(pdc)(参见例如[29])。因此，除上述之外或作为上述的替代，优选地，与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的pbmc内具有升高数量的mdc。除上述之外或作为上述的替代，优选地，与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的pbmc内具有升高数量的pdc。在这些实施方案中，pdc可替代地定义为cd11c 细胞，和/或mdc可替代地定义为cd123 细胞(参见[35])。可使用本领域可用的标准方法，例如流式细胞术来确定细胞数量和细胞表面标志物的表达(参见例如[28])。
在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防包含braf或nras中的致癌突变的癌症，任选地其中所述癌症还包含braf或nras的过表达。优选地，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防包含braf中的致癌突变和任选的braf过表达的癌症。
如[30]中所报道，braf中的致癌突变包括i、ii和iii类突变。在一些实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防包含braf中的ii类突变例如突变r462i、i463s、g464e/v/r、g469a/v/s、e586k、f595l、l597q/r/s/v、a598v、t599i、k601e/n/t和/或a727v和/或braf融合蛋白的癌症。在其他实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防包含braf中的iii类突变例如突变g466a/e/v/r、s467a/e/l、g469e、k483m、n581i/s、d594a/e/g/h/n/v、g596a/c/d/r的癌症。在其他实施方案(其是优选的)中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防包含braf中的i类突变例如突变v600e/k/d/r的癌症。
braf中的致癌突变包括已在结直肠癌中鉴定的v600e、k601e、g469a、g469v、l597r、k601n、g464v、n581s、l597q、a598v、g464r、g466a或g469e[31]，并且本发明组合物的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)可用于治疗或预防此类癌症。braf中的其他致癌突变包括已在黑素瘤中鉴定的v600e、v600k、v600r或v600d[32]，并且本发明组合物的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)可用于治疗或预防此类癌症。braf中的氨基酸根据uniprot条目p15056[33]进行编号(野生型braf)。
在一个尤其优选的实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防包含突变brafv600e的癌症。癌细胞系skmel28、451lu和ht29包含braf中的这种突变，并且在实施例中发现了一种副拟杆菌属菌株，其在此类细胞系中抑制克隆源性存活，抑制erk信号传导并诱导map2基因表达。癌症还可包含致癌突变nrasq61r。癌细胞系skmel2包含nras中的这种突变，并且在实施例中发现了一种副拟杆菌属菌株，其在该细胞系中诱导map2基因表达。
实施例中使用的ht29细胞系是结直肠癌细胞系，并且发现副拟杆菌属菌株在该细胞系中抑制克隆源性存活并抑制erk信号传导。还发现了一种副拟杆菌属菌株在另一种结直肠癌细胞系(hct116)中抑制erk信号传导。因此，在尤其优选的实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防结直肠癌，例如包含突变brafv600e的结直肠癌。在其他实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防包含突变krasg13d的结直肠癌。
实施例中使用的skmel2和skmel28以及451lu细胞系是黑素瘤细胞系，并且发现一种副拟杆菌属菌株在此类细胞系中抑制克隆源性存活，抑制erk信号传导并诱导map2基因表达。此外，白介素2(il-2)是一种批准用于黑素瘤的疗法[64]，并且在实施例中显示了众多副拟杆菌属菌株可刺激鼠类脾细胞分泌il-2，这进一步表明了副拟杆菌属菌株在治疗黑素瘤中的效用。因此，在尤其优选的实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防黑素瘤，例如包含突变brafv600e的黑素瘤。黑素瘤，特别是转移性黑素瘤，已报道为诱导免疫抑制[27]。如实施例中所示，副拟杆菌属菌株引起免疫刺激作用，例如脾细胞增殖和细胞因子分泌。因此，在涉及治疗或预防黑素瘤(特别是转移性黑素瘤)的实施方案中，本发明的组合物在免疫受损或免疫抑制的受试者(如上文所定义)中可能尤其有效。
实施例6中使用的甲氨蝶呤处理的ht29细胞系具有类似于小肠上皮细胞的表型。发现一种副拟杆菌属菌株在该细胞系中诱导gpr109a表达。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于治疗或预防小肠癌，优选用于治疗转移性小肠癌；优选地其中所述小肠癌是小肠腺癌。在一些实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于在小肠癌的治疗或预防中促进细胞凋亡。在一些实施方案中，本发明的组合物(特别是那些包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于在小肠癌的治疗或预防中诱导gpr109a基因表达。
在另一方面，本发明的组合物包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其用于治疗结直肠癌的方法中。在另一方面，本发明的组合物包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株，其用于治疗黑素瘤的方法中。
在以上详述的任何方面和实施方案中，本发明的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)优选用于治疗转移性癌症。如实施例中所报道，发现一种副拟杆菌属菌株上调map2基因表达。已发现map2在原发性皮肤黑素瘤中高表达，但在转移性黑素瘤中表达降低[34]。已经提出增加微管稳定蛋白的表达或用微管稳定蛋白如map2处理可能会干扰细胞分裂期间所需的微管的动态不稳定性。因此，据认为map2的上调阻碍了癌症中的细胞分裂并延缓了肿瘤生长[34]，表明本发明的组合物在治疗转移性癌症中可具有特定用途。
副拟杆菌属菌株在癌症疗法中的作用
如实施例中所示，包含副拟杆菌属菌株的本发明组合物具有在黑素瘤和结直肠癌细胞系中诱导map2基因表达和抑制erk信号传导的作用。因此，本发明的组合物可用于抑制erk信号传导例如erk1和/或erk2信号传导的方法，用于治疗或预防如上文所定义的包含致癌erk信号传导的癌症。本发明的组合物还可用于抑制erk磷酸化例如erk1和/或erk2磷酸化的方法，用于治疗或预防此类癌症。本发明的组合物还可用于诱导map2基因表达的方法，用于治疗或预防此类癌症。map2基因表达与对微管靶向化合物如太平洋紫杉醇的癌症敏感性提高相关[35]。因此，本发明的组合物可用于增加此类癌症对微管蛋白聚合或解聚抑制剂、特别是太平洋紫杉醇的敏感性。本发明的组合物还可用于在包含致癌erk信号传导的癌症的治疗或预防中减小肿瘤大小，减少肿瘤生长，预防或抑制转移或预防血管生成的方法。由于实施例中所示的对map2基因表达的影响，本发明的组合物优选用于在此类癌症的治疗中抑制转移的方法中。
如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导tnf-α细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-1β细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-2细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导gm-csf细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导ifn-γ细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-27细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导ip-10细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导rantes细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导mip-1α细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导mip-1β细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导mip-2细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-10细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-22细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-5细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-18细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-23细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导cxcl1细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。如上文所定义，本发明的组合物还可用于诱导il-6细胞因子产生的方法，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症。
在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于在癌症的治疗或预防中抑制erk1和/或erk2信号传导的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于在癌症的治疗或预防中抑制erk1和/或erk2磷酸化的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于在癌症的治疗或预防中诱导map2基因表达的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于在癌症的治疗或预防中诱导gpr109a基因表达的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导tnf-α细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-1β细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-2细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导gm-csf细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导ifn-γ细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-27细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导ip-10细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导rantes细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-1α细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-1β细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导mip-2细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-10细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-22细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-5细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-18细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-23细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导cxcl1细胞因子产生的方法中。在另一方面，包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物用于在癌症的治疗或预防中诱导il-6细胞因子产生的方法中。在所述其他方面，优选地，癌症的特征如上所述(“癌症及其特征”)。
组合疗法
当与其他治疗剂如直接抗癌剂组合使用时，包含副拟杆菌属细菌菌株的本发明组合物可能是特别有效的。因此，在某些实施方案中，本发明提供了本发明的组合物和抗癌剂，用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症，例如结直肠癌或黑素瘤。在某些实施方案中，本发明的组合物用于激发包含致癌erk信号传导的癌症，例如结直肠癌或黑素瘤，以增强其对第二抗癌剂治疗的敏感性。在某些实施方案中，本发明的组合物用于通过增强其对第二抗癌剂治疗的敏感性来治疗包含致癌erk信号传导的癌症，例如结直肠癌或黑素瘤。第二抗癌剂可同时施用，或者可在本发明组合物之后，例如至少一天、一周或一个月之后施用。
抗癌剂可以是免疫检查点抑制剂，靶向抗体免疫疗法，car-t细胞疗法，溶瘤病毒或抑制细胞生长的药物。抗癌剂包括但不限于选自由以下组成的组的那些：yervoy(伊匹单抗(ipilimumab)，bms)；keytruda(派姆单抗(pembrolizumab)，merck)；opdivo(尼武单抗(nivolumab)，bms)；medi4736(az/medimmune)；mpdl3280a(roche/genentech)；曲美单抗(tremelimumab)(az/medimmune)；ct-011(匹地珠单抗(pidilizumab)，curetech)；bms-986015(丽利单抗(lirilumab)，bms)；medi0680(az/medimmune)；msb-0010718c(merck)；pf-05082566(pfizer)；medi6469(az/medimmune)；bms-986016(bms)；bms-663513(乌瑞鲁单抗(urelumab)，bms)；imp321(primabiomed)；lag525(novartis)；argx-110(argen-x)；pf-05082466(pfizer)；cdx-1127(瓦利鲁单抗(varlilumab)；celldextherapeutics)；trx-518(gitrinc.)；mk-4166(merck)；jtx-2011(jouncetherapeutics)；argx-115(argen-x)；nlg-9189(吲哚莫德(indoximod)，newlinkgenetics)；incb024360(incyte)；iph2201(innateimmotherapeutics/az)；nlg-919(newlinkgenetics)；抗vista(jnj)；依帕卡司他(epacadostat)(incb24360，incyte)；f001287(flexus/bms)；cp870893(宾夕法尼亚大学)；mga271(macrogenix)；艾马妥珠单抗(emactuzumab)(roche/genentech)；加尼西替尼(galunisertib)(elililly)；乌洛鲁单抗(ulocuplumab)(bms)；bkt140/bl8040(biokinetherapeutics)；巴维昔单抗(bavituximab)(peregrinepharmaceuticals)；cc90002(celgene)；852a(pfizer)；vtx-2337(ventirxpharmaceuticals)；imo-2055(hybridon,iderapharmaceuticals)；ly2157299(elililly)；ew-7197(韩国梨花女子大学(ewhawomen'suniversity,korea))；bms-777607(bms)；blz945(纪念斯隆-凯特琳癌症中心(memorialsloan-ketteringcancercentre))；unituxin(地那昔单抗(dinutuximab)，unitedtherapeuticscorporation)；blincyto(博纳吐单抗(blinatumomab)，amgen)；cyramza(雷莫芦单抗(ramucirumab)，elililly)；gazyva(奥比妥单抗(obinutuzumab)，roche/biogen)；kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumabemtansine)，roche/genentech)；perjeta(帕妥珠单抗(pertuzumab)，roche/genentech)；adcetris(维布妥昔单抗(brentuximabvedotin)，takeda/millennium)；arzerra(奥法木单抗(ofatumumab)，gsk)；vectibix(帕尼单抗(panitumumab)，amgen)；avastin(贝伐珠单抗(bevacizumab)，roche/genentech)；erbitux(西妥昔单抗(cetuximab)，bms/merck)；bexxar(托西莫单抗(tositumomab)-i131，gsk)；zevalin(替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)，biogen)；campath(阿仑单抗(alemtuzumab)，bayer)；mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumabozogamicin)，pfizer)；herceptin(曲妥珠单抗(trastuzumab)，roche/genentech)；rituxan(利妥昔单抗(rituximab)，genentech/biogen)；伏洛昔单抗(volociximab)(abbvie)；依那妥单抗(enavatuzumab)(abbvie)；abt-414(abbvie)；依洛珠单抗(elotuzumab)(abbvie/bms)；alx-0141(ablynx)；奥扎利珠单抗(ozaralizumab)(ablynx)；actimab-c(actinium)；actimab-p(actinium)；米拉珠单抗(milatuzumab)-dox(actinium)；emab-sn-38(actinium)；他那莫单抗(naptumonmabestafenatox)(activebiotech)；afm13(affimed)；afm11(affimed)；ags-16c3f(agensys)；ags-16m8f(agensys)；ags-22me(agensys)；ags-15me(agensys)；gs-67e(agensys)；alxn6000(萨马珠单抗(samalizumab)，alexion)；alt-836(altorbioscience)；alt-801(altorbioscience)；alt-803(altorbioscience)；amg780(amgen)；amg228(amgen)；amg820(amgen)；amg172(amgen)；amg595(amgen)；amg110(amgen)；amg232(阿德木单抗(adecatumumab)，amgen)；amg211(amgen/medimmune)；bay20-10112(amgen/bayer)；利洛木单抗(rilotumumab)(amgen)；地诺单抗(denosumab)(amgen)；amp-514(amgen)；medi575(az/medimmune)；medi3617(az/medimmune)；medi6383(az/medimmune)；medi551(az/medimmune)；莫妥昔单抗假单胞菌外毒素(moxetumomabpasudotox)(az/medimmune)；medi565(az/medimmune)；medi0639(az/medimmune)；medi0680(az/medimmune)；medi562(az/medimmune)；av-380(aveo)；av203(aveo)；av299(aveo)；bay79-4620(bayer)；安替单抗瑞伐坦(anetumabravtansine)(bayer)；万替妥单抗(vantictumab)(bayer)；bay94-9343(bayer)；西罗珠单抗(sibrotuzumab)(boehringeringleheim)；bi-836845(boehringeringleheim)；b-701(bioclin)；biib015(biogen)；阿托珠单抗(obinutuzumab)(biogen/genentech)；bi-505(bioinvent)；bi-1206(bioinvent)；tb-403(bioinvent)；bt-062(biotest)bil-010t(biosceptre)；mdx-1203(bms)；mdx-1204(bms)；耐昔妥珠单抗(necitumumab)(bms)；can-4(cantargiaab)；cdx-011(celldex)；cdx1401(celldex)；cdx301(celldex)；u3-1565(daiichisankyo)；帕曲图单抗(patritumab)(daiichisankyo)；替加珠单抗(tigatuzumab)(daiichisankyo)；尼妥珠单抗(nimotuzumab)(daiichisankyo)；ds-8895(daiichisankyo)；ds-8873(daiichisankyo)；ds-5573(daiichisankyo)；morab-004(eisai)；morab-009(eisai)；morab-003(eisai)；morab-066(eisai)；ly3012207(elililly)；ly2875358(elililly)；ly2812176(elililly)；ly3012217(elililly)；ly2495655(elililly)；ly3012212(elililly)；ly3012211(elililly)；ly3009806(elililly)；西妥木单抗(cixutumumab)(elililly)；弗拉伏妥单抗(flanvotumab)(elililly)；imc-tr1(elililly)；雷莫卢单抗(ramucirumab)(elililly)；塔巴单抗(tabalumab)(elililly)；扎诺莫单抗(zanolimumab)(emergentbiosolution)；fg-3019(fibrogen)；fpa008(fiveprimetherapeutics)；fp-1039(fiveprimetherapeutics)；fpa144(fiveprimetherapeutics)；卡妥索单抗(catumaxomab)(freseniusbiotech)；imab362(ganymed)；imab027(ganymed)；humax-cd74(genmab)；humax-tfadc(genmab)；gs-5745(gilead)；gs-6624(gilead)；omp-21m18(地昔单抗(demcizumab)，gsk)；马帕木单抗(mapatumumab)(gsk)；imgn289(immunogen)；imgn901(immunogen)；imgn853(immunogen)；imgn529(immunogen)；immu-130(immunomedics)；米拉珠单抗(milatuzumab)-dox(immunomedics)；immu-115(immunomedics)；immu-132(immunomedics)；immu-106(immunomedics)；immu-102(immunomedics)；依帕珠单抗(epratuzumab)(immunomedics)；克里托珠单抗(clivatuzumab)(immunomedics)；iph41(innateimmunotherapeutics)；达雷木单抗(daratumumab)(janssen/genmab)；cnto-95(因特木单抗(intetumumab)，janssen)；cnto-328(司妥昔单抗(siltuximab)，janssen)；kb004(kalobios)；莫加珠单抗(mogamulizumab)(kyowahakkokirrin)；kw-2871(依克罗希单抗(ecromeximab)，lifescience)；索耐珠单抗(sonepcizumab)(lpath)；马格妥昔单抗(margetuximab)(macrogenics)；恩诺珠单抗(enoblituzumab)(macrogenics)；mgd006(macrogenics)；mgf007(macrogenics)；mk-0646(达妥珠单抗(dalotuzumab)，merck)；mk-3475(merck)；sym004(symphogen/merckserono)；di17e6(merckserono)；mor208(morphosys)；mor202(morphosys)；xmab5574(morphosys)；bpc-1c(恩司昔单抗(ensituximab)，precisionbiologics)；tas266(novartis)；lfa102(novartis)；bhq880(novartis/morphosys)；qge031(novartis)；hcd122(鲁卡木单抗(lucatumumab)，novartis)；ljm716(novartis)；at355(novartis)；omp-21m18(登西珠单抗(demcizumab)，oncomed)；omp52m51(oncomed/gsk)；omp-59r5(oncomed/gsk)；凡替图单抗(vantictumab)(oncomed/bayer)；cmc-544(奥英妥珠单抗(inotuzumabozogamicin)，pfizer)；pf-03446962(pfizer)；pf-04856884(pfizer)；psma-adc(progenics)；regn1400(regeneron)；regn910(奈伐单抗(nesvacumab)，regeneron/sanofi)；regn421(恩诺替单抗(enoticumab)，regeneron/sanofi)；rg7221，rg7356，rg7155，rg7444，rg7116，rg7458，rg7598，rg7599，rg7600，rg7636，rg7450，rg7593，rg7596，dcds3410a，rg7414(帕萨妥珠单抗(parsatuzumab))，rg7160(英加妥珠单抗(imgatuzumab))，rg7159(奥比妥珠单抗(obintuzumab))，rg7686，rg3638(奥纳妥珠单抗(onartuzumab))，rg7597(roche/genentech)；sar307746(sanofi)；sar566658(sanofi)；sar650984(sanofi)；sar153192(sanofi)；sar3419(sanofi)；sar256212(sanofi)，sgn-liv1a(林妥珠单抗(lintuzumab)，seattlegenetics)；sgn-cd33a(seattlegenetics)；sgn-75(伐妥珠单抗马弗多星(vorsetuzumabmafodotin)，seattlegenetics)；sgn-19a(seattlegenetics)sgn-cd70a(seattlegenetics)；sea-cd40(seattlegenetics)；替伊莫单抗(spectrum)；mln0264(takeda)；盖尼塔单抗(ganitumab)(takeda/amgen)；cep-37250(teva)；tb-403(thrombogenic)；vb4-845(viventia)；xmab2512(xencor)；xmab5574(xencor)；尼妥珠单抗(nimotuzumab)(ymbiosciences)；卡鲁单抗(carlumab)(janssen)；ny-esotcr(adaptimmune)；mage-a-10tcr(adaptimmune)；ctl019(novartis)；jcar015(junotherapeutics)；kte-c19car(kitepharma)；ucart19(cellectis)；bpx-401(bellicumpharmaceuticals)；bpx-601(bellicumpharmaceuticals)；attck20(unumtherapeutics)；car-nkg2d(celyad)；onyx-015(onyxpharmaceuticals)；h101(shanghaisunwaybio)；dnx-2401(dnatrix)；vcn-01(vcnbiosciences)；colo-ad1(psioxustherapeutics)；prostatak(advantagene)；oncos-102(oncostherapeutics)；cg0070(coldgenesys)；pexa-vac(jx-594，jennerexbiotherapeutics)；gl-onc1(genelux)；t-vec(amgen)；g207(medigene)；hf10(takarabio)；seprehvir(hsv1716，virttubiologics)；orienx010(oriengenebiotechnology)；reolysin(oncolyticsbiotech)；svv-001(neotropix)；cacatak(cva21，viralytics)；alimta(elililly)，顺铂，奥沙利铂(oxaliplatin)，伊立替康(irinotecan)，亚叶酸，甲氨蝶呤，环磷酰胺，5-氟尿嘧啶，zykadia(novartis)，tafinlar(gsk)，xalkori(pfizer)，iressa(az)，gilotrif(boehringeringelheim)，tarceva(astellaspharma)，halaven(eisaipharma)，维利帕尼(veliparib)(abbvie)，azd9291(az)，阿来替尼(alectinib)(chugai)，ldk378(novartis)，genetespib(syntapharma)，tergenpumatucel-l(newlinkgenetics)，gv1001(kael-gemvax)，替万替尼(tivantinib)(arqule)；癌得星(cytoxan)(bms)；oncovin(elililly)；阿霉素(adriamycin)(pfizer)；gemzar(elililly)；xeloda(roche)；ixempra(bms)；trelstar(debiopharm)；泰素帝(taxotere)(sanofi)；nexavar(bayer)；immu-132(immunomedics)；e7449(eisai)；thermodox(celsion)；cometriq(exellxis)；lonsurf(taihopharmaceuticals)；camptosar(pfizer)；uft(taihopharmaceuticals)；和ts-1(taihopharmaceuticals)。
在优选的实施方案中，相对于包含副拟杆菌属细菌菌株的本发明的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)的施用，同时、分别或依次施用braf抑制剂。优选地，braf抑制剂选自维罗非尼、达拉非尼或恩考芬尼，其作为brafv600e的选择性抑制剂并且其优选用于治疗或预防包含brafv600e突变的癌症。更优选地，braf抑制剂是维罗非尼(其给药和施用指导可见于[36])。如实施例中所示，维罗非尼可增强副拟杆菌属菌株抑制黑素瘤细胞系的克隆源性存活、软琼脂生长和erk信号传导的作用。因此，在一个优选的实施方案中，维罗非尼和包含副拟杆菌属菌株的组合物被同时、分别或依次用于治疗或预防黑素瘤，优选地包含brafv600e突变的黑素瘤。如实施例中所示，维罗非尼还可增强结直肠癌细胞系中由副拟杆菌属菌株引起的map2基因表达。因此，在一个优选的实施方案中，维罗非尼和包含副拟杆菌属菌株的组合物被同时、分别或依次用于治疗或预防结直肠癌，优选转移性结直肠癌。建议经口施用braf抑制剂如维罗非尼(参见[36])。因此，有利地，可将副拟杆菌属的细菌菌株(特别是狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株)和braf抑制剂(特别是维罗非尼)配制成用于经口施用的单一组合物(例如片剂、胶囊剂或散剂)，以提高患者依从性。
可将braf抑制剂(优选维罗非尼)进一步与其他组合伴侣如胞苷类似物；优选地氮杂胞苷-c、地西他滨或泽布拉林；更优选地氮杂胞苷-c组合(其给药和施用指导可见于[37])。如实施例中所示，维罗非尼与氮杂胞苷-c组合可增强副拟杆菌属菌株抑制黑素瘤细胞系的克隆源性存活和软琼脂生长的作用。因此，在一个优选的实施方案中，维罗非尼、氮杂胞苷-c和包含副拟杆菌属菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)被同时、分别或依次用于治疗或预防黑素瘤，优选包含brafv600e突变的黑素瘤。如实施例中所示，维罗非尼和氮杂胞苷-c还可增强由副拟杆菌属菌株在结直肠癌细胞系中引起的map2基因表达。因此，在一个优选的实施方案中，维罗非尼、氮杂胞苷-c和包含副拟杆菌属菌株的组合物被同时、分别或依次用于治疗或预防结直肠癌，优选转移性结直肠癌。
在其他优选的实施方案中，相对于包含副拟杆菌属细菌菌株的本发明组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)的施用，同时、分别或依次施用胞苷类似物。优选地，胞苷类似物选自氮杂胞苷-c、地西他滨或泽布拉林。更优选地，胞苷类似物是氮杂胞苷-c。如实施例中所示，氮杂胞苷-c可增强副拟杆菌属菌株在抑制黑素瘤细胞系的克隆源性存活和软琼脂生长中的作用。因此，在一个优选的实施方案中，氮杂胞苷-c和包含副拟杆菌属菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)被同时、分别或依次用于治疗或预防黑素瘤。如实施例中所示，在结直肠癌细胞系中，氮杂胞苷-c还可增强由副拟杆菌属菌株引起的map2基因表达，并增强副拟杆菌属菌株在抑制克隆源性存活中的作用。因此，在一个优选的实施方案中，氮杂胞苷-c和包含副拟杆菌属菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)被同时、分别或依次用于治疗或预防结直肠癌，优选转移性结直肠癌。
在其他优选的实施方案中，相对于包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)的施用，同时、分别或依次施用微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂。优选地，微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂选自太平洋紫杉醇、阿伯沙星、多西紫杉醇、埃博霉素、( )-海绵多羟基内酯、秋水仙碱、康普瑞汀、2-甲氧基雌二醇、e7010、长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春氟宁；更优选地，微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂是太平洋紫杉醇(其给药和施用指导可见于[38])。如上所述，map2基因表达与黑素瘤对微管靶向化合物如太平洋紫杉醇的敏感性增加相关[35]。此外，副拟杆菌属菌株诱导map2基因表达的能力表明其在治疗转移性癌症中的特定效用。因此，在一个优选的实施方案中，微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂(特别是太平洋紫杉醇)和包含副拟杆菌属菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)被同时、分别或依次用于治疗或预防转移性癌症，优选转移性黑素瘤或结直肠癌。在另一个优选的实施方案中，包含副拟杆菌属菌株的组合物(特别是包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物)用于通过增强其对微管蛋白聚合抑制剂或微管蛋白解聚抑制剂(特别是太平洋紫杉醇)治疗的敏感性来治疗包含致癌erk信号传导的癌症，优选黑素瘤或结直肠癌，更优选转移性黑素瘤或结直肠癌。
如上所述，副拟杆菌属菌株与其他治疗剂如braf抑制剂、胞苷类似物和微管蛋白聚合或解聚抑制剂的组合，对于增强所述副拟杆菌属菌株的抗肿瘤作用并增强所述菌株诱导的map2基因表达可能特别有用。此外，治疗剂的组合可减少癌细胞中通过新的体细胞突变引起的获得性治疗抗性的出现，这是braf抑制剂遇到的问题[39]。
本发明组合物的施用
优选地，将本发明的组合物施用于胃肠道，以便能够用本发明的细菌菌株递送至肠和/或部分或全部定殖于肠。通常，本发明的组合物是经口施用的，但是它们可经直肠、鼻内、肿瘤内或经颊或舌下途径施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以泡沫、喷雾剂或凝胶剂的形式施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可作为栓剂如直肠栓剂，例如呈可可油(可可脂)、合成硬脂(例如suppocire、witepsol)、甘油-明胶、聚乙二醇或皂甘油组合物的形式施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物经由管(例如鼻胃管、口胃管、胃管、空肠造瘘管(j管)、经皮内窥镜胃造口术(peg))或端口(例如提供到胃的路径的胸壁端口、空肠或其他合适的路径端口)来施用到胃肠道。
本发明的组合物可以一次施用，或者它们可作为治疗方案的一部分依次施用。在某些实施方案中，本发明的组合物有待每天施用。
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随着对患者肠道微生物群的评估。如果未能实现本发明菌株的递送和/或部分或全部定殖而使得未观察到功效，则可重复治疗；或者如果递送和/或部分或全部定殖成功并且观察到功效，则可停止治疗。
可将本发明的组合物施用于已被诊断患有包含致癌erk信号传导的癌症的受试者。在一种实施方案中，在将组合物施用于受试者之前，已经确定了受试者中癌症的突变状态。例如，肿瘤活检可取自受试者，并且核苷酸测序用于确定癌症包含braf、nras、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、kras如kras4a或kras4b、mek1、mek2、erk1或erk2中的致癌突变，和/或rsk、dusp1、dusp5、dusp6或spry中的致癌突变。特别地，癌症可确定为包含braf或nras中的致癌突变，braf中的致癌突变，或者优选在braf蛋白的第600位的致癌突变。当癌症是结直肠癌时，所述癌症可确定为包含选自brafv600e、k601e、g469a、g469v、l597r、k601n、g464v、n581s、l597q、a598v、g464r、g466a或g469e的致癌突变。当癌症是黑素瘤时，所述癌症可确定为包含选自brafv600e、v600k、v600r或v600d的致癌突变。在尤其优选的实施方案中，所述癌症如结直肠癌或黑素瘤已确定为包含突变brafv600e。可通过检测braf基因的核苷酸1799中的t至a突变，例如使用
可将本发明的组合物施用于已经被鉴定为具有异常肠道微生物群的患者。例如，患者的副拟杆菌属并且特别是狄氏副拟杆菌的定殖减少或不存在。
本发明的组合物可作为食品例如营养补充剂施用。
通常，本发明的组合物用于治疗人类，但它们可用于治疗动物，包括单胃哺乳动物如家禽、猪、猫、狗、马或兔子。如果施用于动物，则可使用管饲法。
组合物
本发明的组合物包含细菌。如上所述，本发明提供了包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防如上文所定义的癌症的方法。
在本发明的优选实施方案中，将组合物配制成冷冻干燥形式。例如，本发明的组合物可包含颗粒或明胶胶囊，例如硬明胶胶囊，其包含本发明的细菌菌株。
优选地，本发明的组合物包含冻干细菌。细菌的冻干是一种公认程序，并且相关指导可在例如参考文献[40,,42]中获得。
或者，本发明的组合物可包含活的活性细菌培养物。
在优选的实施方案中，将本发明的组合物封装以使细菌菌株能够递送至肠。封装可保护组合物免于降解，直至例如通过用化学或物理刺激(例如压力、酶活性或可通过ph变化触发的物理崩解)而破裂来递送在目标位置。可使用任何适当的封装方法。示例性的封装技术包括捕集在多孔基质内，附着或吸附在固体载体表面上，通过絮凝自聚集或与交联剂聚集，以及在微孔膜或微胶囊后的机械容纳。关于可用于制备本发明组合物的封装的指导可在例如参考文献[43]和[44]中获得。
所述组合物可经口施用，并且可以是片剂、胶囊剂或散剂的形式。封装产品是优选的。可包括其他成分(例如维生素c)作为除氧剂和益生元底物，以改善体内的递送和/或部分或全部定殖和存活。或者，本发明的益生菌组合物可作为食品或营养产品例如基于乳或乳清的发酵乳制品或作为药物产品经口施用。
所述组合物可配制成益生菌。
本发明的组合物包含治疗有效量的本发明的细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者发挥有益作用。治疗有效量的细菌菌株可能足以导致向患者肠道的递送和/或部分或全部定殖。
例如，对于成年人，细菌的合适的日剂量可为约1×103至约1×1011个菌落形成单位(cfu)；例如，约1×107至约1×1010个cfu；在另一个实例中约1×106至约1×1010个cfu；在另一个实例中约1×107至约1×1011个cfu；在另一个实例中约1×108至约1×1010个cfu；在另一个实例中约1×108至约1×1011个cfu。
在某些实施方案中，细菌的剂量为每天至少109个细胞，例如每天至少1010个、至少1011个或至少1012个细胞。
在某些实施方案中，相对于组合物的重量，所述组合物包含的细菌菌株的量为约1×106至约1×1011cfu/g；例如，约1×108至约1×1010cfu/g。剂量可以是例如1g、3g、5g和10g。
在某些实施方案中，本发明提供了上述组合物，其中细菌菌株的量相对于组合物的重量为每克约1×103至约1×1011个菌落形成单位。
在某些实施方案中，药物组合物包含16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少的不同细菌物种。在某些实施方案中，药物组合物包含4个或更少的不同细菌物种。在某些实施方案中，药物组合物包含3个或更少的不同细菌物种。在某些实施方案中，药物组合物包含2个或更少的不同细菌物种。在某些实施方案中，药物组合物包含狄氏副拟杆菌、粪副拟杆菌、约氏副拟杆菌或古氏副拟杆菌(特别是狄氏副拟杆菌)并且不包含其他细菌物种。在优选的实施方案中，本发明的组合物包含单个狄氏副拟杆菌、粪副拟杆菌、约氏副拟杆菌或古氏副拟杆菌(特别是狄氏副拟杆菌)的菌株并且不包含其他细菌菌株或物种。这样的组合物可仅包含极少量或生物学上不相关量的其他细菌菌株或物种。令人惊讶的是，实施例表明，仅包含单一本发明菌株的组合物可具有有效的作用，而不依赖于与其他菌株或物种的共同施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可包含一种以上的细菌菌株(例如不同细菌菌株的聚生体)。在这样的实施方案中，本发明的组合物可包含(优先级递增)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少11个不同的细菌菌株。在这样的实施方案中，聚生体可包含至少三个不同的副拟杆菌属菌株，例如狄氏副拟杆菌菌株、约氏副拟杆菌菌株和戈氏副拟杆菌菌株。在这样的实施方案中，本发明的组合物优选包含至少11个不同的细菌菌株，其中所述至少11个不同的细菌菌株包含狄氏副拟杆菌菌株、约氏副拟杆菌菌株和戈氏副拟杆菌菌株。
在某些实施方案中，本发明提供上述组合物，其中所述组合物以1g、3g、5g或10g的剂量施用。
在某些实施方案中，本发明提供上述组合物，其中所述组合物以500mg至1000mg、600mg至900mg、700mg至800mg、500mg至750mg或750mg至1000mg的剂量施用。在某些实施方案中，本发明提供上述组合物，其中所述药物组合物中的冻干细菌以500mg至1000mg、600mg至900mg、700mg至800mg、500mg至750mg或750mg至1000mg的剂量施用。
通常，益生菌，例如本发明的组合物，任选地与至少一种合适的益生元化合物组合。益生元化合物通常是不可消化的碳水化合物，例如寡糖或多糖或糖醇，其在上消化道中不会降解或吸收。已知的益生元包括商业产品，例如菊粉和反式半乳糖寡糖。
在某些实施方案中，本发明的益生菌组合物包含益生元化合物，其量相对于组合物总重量为约1至约30重量％(例如5至20重量％)。碳水化合物可选自由以下组成的组：低聚果糖(或fos)，短链低聚果糖，菊粉，异麦芽寡糖，果胶，木寡糖(或xos)，壳聚糖寡糖(或cos)，β-葡聚糖，阿拉伯树胶改性和抗性淀粉，聚右旋糖，d-塔格糖，阿拉伯胶纤维，角豆，燕麦和柑桔纤维。在一个方面，益生元是短链果糖寡糖(为简单起见，在下文中显示为foss-c.c.)；所述foss-c.c.是不可消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化而获得，并且包括与三个葡萄糖分子结合的蔗糖分子。
本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂或载体。此类合适的赋形剂的实例可见于参考文献[45]中。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且例如描述于参考文献[46]中。合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。可关于预期的施用途径和标准药学实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂。药物组合物可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂作为载体、赋形剂或稀释剂，或除载体、赋形剂或稀释剂外还包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖，玉米甜味剂，天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸钠，羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。
本发明的组合物可配制成食品。例如，除了本发明的治疗效果外，食品还可提供营养益处，例如呈营养补充剂的形式。类似地，可配制食品来增强本发明组合物的味道或通过与普通食物而不是药物组合物更相似来使组合物更具消费吸引力。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制成乳基产品。术语“乳基产品”是指具有变化的脂肪含量的任何基于液体或半固体的乳或乳清基产品。乳基产品可以是例如牛奶，山羊奶，绵羊奶，脱脂奶，全脂奶，由奶粉和乳清复合而成的未经任何加工的奶，或经过加工的产品，例如酸乳酪、凝固乳、凝乳、酸奶、酸味全脂奶、酪乳和其他酸奶产品。另一重要组包括乳饮料，例如乳清饮料、发酵乳、炼乳、婴儿或幼儿乳；调味乳，冰淇淋；含乳食物，例如糖果。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含单个细菌菌株或物种，并且不包含任何其他细菌菌株或物种。这样的组合物可仅包含极少量或生物学上不相关量的其他细菌菌株或物种。这样的组合物可以是基本上不含其他生物物种的培养物。在一些实施方案中，副拟杆菌属的细菌菌株是本发明组合物中的唯一治疗活性剂。
根据本发明使用的组合物可能需要或可能不需要市场批准。
在一些情况下，在施用前将冻干的细菌菌株重构。在一些情况下，通过使用本文所述的稀释剂进行重构。
本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在某些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株是当施用于有需要的受试者时足以治疗病症的量；并且其中所述病症是包含致癌erk信号传导的癌症，例如结直肠癌、黑素瘤、小肠癌如小肠腺癌、前列腺癌、肺腺癌如非小细胞肺腺癌、胰腺癌、膀胱癌、白血病如毛细胞白血病或急性髓系白血病、神经胶质瘤、毛细胞星形细胞瘤、卵巢癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、精原细胞瘤、肝癌、骨髓增生异常综合征、肾癌或霍奇金病。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述组合物是通过选自由经口、经直肠、皮下、经鼻、经颊和舌下组成的组的方法施用。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇和山梨糖醇组成的组的载体。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由乙醇、甘油和水组成的组的稀释剂。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下组成的组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，所述药物组合物还包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一种。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯组成的组的防腐剂。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中当将所述组合物在约4℃或约25℃下储存在密封容器中并且将所述容器放置在具有50％相对湿度的气氛中时，至少80％的细菌菌株(如以菌落形成单位计量)在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年的时期后仍然存在。
培养方法
用于本发明的细菌菌株可使用例如参考文献[47-49]中详述的标准微生物学技术来培养。
用于培养的固体或液体培养基可以是ycfa琼脂、ycfa培养基或ycfa 培养基。ycfa培养基可包含(每100ml，近似值)：酪胨(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、nahco3(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、k2hpo4(0.045g)、kh2po4(0.045g)、nacl(0.09g)、(nh4)2so4(0.09g)、mgso4·7h2o(0.009g)、cacl2(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)和吡哆胺(15μg)。ycfa 培养基具有以下组成：
d.h2o至总体积为：100m
矿物质溶液1：k2hpo4-3.0g；d.h2o至总体积为1l
矿物质溶液2：kh2po4-3.0g；(nh4)2so4-6.0g；nacl-6.0g；mgso4-0.6g；cacl2-0.6g；d.h2o至总体积为1l
刃天青溶液：于100ml蒸馏水中的0.1％粉末状刃天青。
短链脂肪酸溶液：乙酸-17ml；丙酸-6ml；正戊酸-1ml；异戊酸-1ml；异丁酸-1ml
氯高铁血红素溶液：koh-0.28g乙醇95％-25ml；氯高铁血红素-100mg；d.h2o至总体积为100ml
维生素溶液1：生物素-1mg；钴胺素-1mg；对氨基苯甲酸-3mg；叶酸-5mg；吡哆胺-15mg；d.h2o至总体积为100ml
维生素溶液2：硫胺素-5mg；核黄素-5mg；d.h2o至总体积为100ml
通则
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法。文献中对这些技术进行了充分的解释。参见例如参考文献[50]和[51-57]等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“组成”，例如“包含”x的组合物可仅由x组成或者可包括额外的事物，例如x y。
关于数值x的术语“约”是任选的并且是指例如x±10％。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可完全不含y。必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
对两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比的提及是指当比对时，所述百分比的核苷酸在比较两个序列时是相同的。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域中已知的软件程序，例如参考文献[58]的章节7.7.18中所述的那些来确定。优选的比对是通过smith-waterman同源性搜寻算法使用空位开放罚分12和空位扩展罚分2、blosum矩阵62进行仿射空位搜寻来确定。smith-waterman同源性搜寻算法在参考文献[59]中公开。
除非另有规定，否则包括众多步骤的工艺或方法可在方法开始或结束时包括额外步骤，或者可包括额外中间步骤。此外，适当时，步骤可组合、省略或以替代性次序进行。
本文描述本发明的各种实施方案。应了解，每个实施方案中指定的特征可与其他指定特征组合，以提供另外的实施方案。特别是，本文中突出强调为合适、典型或优选的实施方案可彼此组合(除非它们相互排斥)。
本发明的实施方式
材料和方法
rna提取和map2qpcr分析
将细胞以2×105个细胞/孔的密度铺在12孔板中。24h后，在10％细菌上清液存在或不存在(ycfa )的情况下，细胞用dmso或维罗非尼(662005；emdmillipore；vemu；skmel28、skmel31、451lu、ht29(1μm)skmel2(10μm)或氮杂胞苷-c(a3656；sigmaaldrich；azac；5μg/ml)或两种药物(vemu aza)一起处理。使用rneasy微型试剂盒(qiagen，英国曼彻斯特)根据制造商的说明提取总rna，并且通过分光光度计在260/280nm下(nanodropnd-1000；thermofisherscientific，拉夫堡)测定rna浓度。对于mrna表达分析，使用高容量cdna逆转录试剂盒(thermofisher，拉夫堡)根据制造商的说明从2000ng总rna中制备cdna。在热循环仪(biometra，德国)中进行逆转录反应，在25℃下持续10min，在37℃下持续120min并且在85℃下持续5min。通过sybr-greenpcr测定法一式两份地扩增所得cdna，并在quantstudio6flex实时pcr机器(appliedbiosystems，英国)上使用标准化配置文件(95℃初始变性10分钟，接着是在95℃变性10秒和在65℃退火/延伸30秒的40个循环)检测产物。在40个循环后添加解离阶段以生成熔解曲线。使用appliedbiosystemsquantstudio实时pcr软件v1.2进行分析。gapdh和map2的引物序列如下所示。
蛋白质印迹分析
在10％细菌上清液存在或不存在(ycfa )的情况下，用适当的药物处理24h后，通过在补充有蛋白酶抑制剂(complete蛋白酶抑制剂混合液片剂；roche，瑞士)和1mm/l原钒酸钠、0.5mm/lpmsf的ripa缓冲液(r0278；sigmaaldrich)中裂解细胞来获得蛋白质提取物。通过bca蛋白质测定法进行蛋白质定量。然后在4-15％的梯度凝胶(biorad)上通过sds-page分离等量的总蛋白(20μg/泳道)，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(thermofisherscientific，拉夫堡)上。在tbst(10mmtris，ph7.5，150mmnacl，0.5％tween20)中用5％bsa或脱脂奶粉封闭60min后，用抗磷酸化erk的一级抗体(9101s，1:1000，cellsignalling；newenglandbiolabs(英国))或抗总erk的一级抗体(4696s，1:1000，cellsignalling；newenglandbiolabs(英国))检测膜。
目标蛋白用适当的hrp偶联二级抗体(1:10,000，thermofisherscientific，拉夫堡)检测，用eclwesternblottingsupersignalpicoplus底物(34577；thermofisherscientific，拉夫堡)显影，并在chemidocxrs成像仪(biorad)中可视化。
96孔板中不依赖于锚定的生长(软琼脂生长测定)
将含有20％fbs、4mml-谷氨酰胺、2×neaa、0.6％碳酸氢钠、200u/ml青霉素/链霉素(invitrogen)的25μl预热(37℃)2×适当生长培养基(用于黑素瘤细胞系的emem；用于ht29的dmem高葡萄糖)的混合物和25μl预热(47℃)的1.2％noble琼脂(a5431；sigmaaldrich)铺在96孔微板的每个孔上，作为测定的前层。在96孔圆底聚丙烯微板中，将10微升含有0-2×103个细胞的细胞悬液与25μl2×生长培养基和35μl0.8％noble琼脂混合，并转移至含有固化前层的96孔微板。使细胞生长2天，然后每三天在存在10％细菌上清液或ycfa 的情况下馈入含有药物的培养基。使它们在含5％co2的加湿的37℃温育箱中生长1-2周，然后使用cytoselect96孔细胞转化测定法(cba-130；cellbiolabs)根据制造商的方案对软琼脂生长进行评分。使用tecaninfinitef200pro系列多孔板读数器(tecanbiosystems)测量细胞生长，其中在485nm激发并在530nm发射。
在32mm板中不依赖于锚定的生长(软琼脂生长测定)
将每板1ml预热(37℃)2×适当生长培养基(用于黑素瘤细胞系的emem；用于ht29的dmem高葡萄糖)和1ml预热(47℃)的0.8％noble琼脂(0.4％最终琼脂)的混合物与1ml细胞悬液混合，并接种在6孔板中的0.6％琼脂/细胞生长前层(2ml)上。使细胞在具有5％co2的加湿的37℃温育箱中生长21-28天。每三天向它们饲喂不存在(ycfa )或存在10％细菌上清液的药物。使用evosxl核心显微镜(thermofisherscientific，拉夫堡)拍摄菌落。
克隆源性测定
用胰蛋白酶消化细胞，并将200个细胞/孔接种在12孔板中。48h后，在不存在(ycfa )或存在10％细菌上清液的情况下用适当的药物处理细胞，并且每三天再饲喂一次。接种后第21天，将细胞固定在冰冷的甲醇中并用结晶紫蓝色染色。对菌落(.50个细胞)计数，并以菌落数除以经处理的接种细胞数(接种效率)除以对照的接种效率来计算存活分数。
gpr109arna表达测定
ht29mtx细胞接种在12孔板上并分化10天；然后将其血清饥饿12小时并且随后暴露于源自固定相细菌的10％上清液持续24h。收集细胞，并根据rneasy微型试剂盒方案(qiagen)分离总rna。使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)制备cdna。通过qpcr测量基因表达。β肌动蛋白用作内部对照。根据2(-δδct)方法[60]计算倍数变化。所使用的正向和反向引物的序列分别以seqidno:15和16提供。
tnf-α分泌测定
将分化的ht29细胞以200,000个细胞/孔的密度铺在12孔板中。使细胞分化10天(每2天更换培养基)。实验当天将细胞置于厌氧罩中并用厌氧平衡的hanks溶液洗涤。然后将900μl生长培养基(不含fbs和抗生素)添加到细胞中。将细菌细胞重悬于生长培养基(不含fbs和抗生素)中并且然后以100μl中总共107的量添加。在厌氧罩中将细胞与细菌共温育2小时。其后，在不含fbs但含有抗生素的生长培养基中洗涤细胞。将细胞在1mlthp1条件培养基中静置24h。温育24h后，收集上清液并在4℃下以10,000g快速离心3分钟。将样品在-80℃下冷冻直至进一步使用。
thp1条件培养基：thp1以4×106个/烧瓶的密度接种在t25烧瓶中。在含有1ug/mllps或lps 5mmatp(lps后3小时添加atp)的rpmi培养基(含有2mml-谷氨酰胺，不含fbs)中处理细胞。使细胞静置24小时。其后，通过在室温下以250g快速离心细胞5min来收集条件培养基(cm)。不同的cm用于处理ht29细胞。将一小份等分试样在80℃下冷冻用于elisa。
收集不同样品的上清液，并使用来自peprotech的人tnf-aelisa试剂盒根据制造商的说明进行细胞因子分析。graphpadprism7用于绘制和分析数据。
ncimb42382的发酵概况
按照制造商的说明，对ncimb42382菌落进行rapidid32a测试。使用来自2015年6月26日生成的ncimb42382珠粒储备液的单个珠粒来接种ycfa琼脂板(e&olabs)，将其在厌氧工作站中于37℃温育24小时。从板上移出菌落并重悬于2ml安瓿瓶的
按照制造商的说明进行
脾细胞增殖和细胞因子分泌
从解剖自6至8周龄的雌性c57bl/6小鼠的脾脏新鲜制备脾细胞。简而言之，将脾细胞以900,000个细胞/孔接种在96孔板中的含10％fbs、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和55μmβ-巯基乙醇的rpmi1640中。细胞未经处理(静置)或用来自各种菌株固定培养物的10％细菌培养基ycfa (空白培养基)或10％无细胞细菌上清液处理，并在37℃的co2温育箱中温育72h。之后，将细胞在4℃以500g快速离心5分钟，并收集无细胞上清液，并储存在-80℃以进行细胞因子分析。培养每个副拟杆菌属菌株并如下制备上清液：使用100μl的researchcellbank小瓶接种10ml的ycfa 肉汤。将培养物在厌氧工作站中于37℃温育过夜。每种过夜培养物用于接种五个含有10ml具10％继代培养物的新鲜生长培养基的hungate管。温育培养管直至它们达到早期固定相，然后如下收集无细胞上清液(cfs)。合并各个培养管并记录细菌密度(o.d.600nm)。通过离心(5000xg，15分钟)获得副拟杆菌属菌株的无细胞上清液，并通过0.45μm过滤，接着通过0.22μm过滤器过滤。
mtt测定试剂盒购自merckmillipore(目录号ct01)。温育72h后，将10μlmtt溶液添加到每个孔中，将细胞在co2温育箱中温育4h。然后，向每个孔中加入100μl异丙醇/0.04mhcl溶液，并在560nm波长下测量吸光度(参考波长为655nm)。
根据制造商的建议(thermofischerscientific)，使用26重小鼠procartaplex多重免疫测定法进行细胞因子定量。简而言之，使用带有xponent软件(luminex，austin,tx,usa)的
短/中链脂肪酸定量
狄氏副拟杆菌菌株dsm20701的纯培养物在ycfa 肉汤[每升：酪蛋白水解物10.0g，酵母提取物2.5g，碳酸氢钠4.0g，葡萄糖2.0g，纤维二糖2.0g，可溶性淀粉2.0g，磷酸氢二钾0.45g，磷酸二氢钾0.45g，刃天青0.001g，l-半胱氨酸hcl1.0g，硫酸铵0.9g，氯化钠0.9g，硫酸镁0.09g，氯化钙0.09g，氯高铁血红素0.01g，scfa3.1ml(乙酸2.026ml/l、丙酸0.715ml/l、正戊酸0.119ml/l、异戊酸0.119ml/l、异丁酸0.119ml/l)，维生素混合物1：1ml(生物素1mg/100ml、氰钴胺1mg/100ml、对氨基苯甲酸3mg/100ml、吡哆醇15mg/100ml)，维生素混合物2：1ml(硫胺素5mg/100ml、核黄素5mg/100ml)，维生素混合物3：1ml(叶酸5mg/100ml)]中厌氧生长，直至它们达到其固定生长期。将培养物以5000xg离心10分钟，并且将无细胞上清液(cfs)使用0.45μm过滤，接着使用0.2μm过滤器(millipore,uk)过滤，然后将1mlcfs等分试样储存在-80℃直到使用。
来自细菌上清液的短链脂肪酸(scfa)和中链脂肪酸(mcfa)由丹麦的msomicsaps分析和定量。使用盐酸将样品酸化，并添加氘标记的内标。所有样品均按随机顺序进行分析。使用安装在气相色谱仪(7890b,agilent)中的高极性柱(zebrontmzb-ffap，gccap.柱30m×0.25mm×0.25μm)与四极杆检测器(5977b,agilent)耦合进行分析。所述系统由chemstation(agilent)控制。使用chemstation(agilent)将原始数据转换为netcdf格式，然后使用paradise软件在matlabr2014b(mathworks,inc.)中导入数据并进行处理。
磷酸化erk染色强度测定(间接免疫荧光)
将细胞(ht29和hct116)以10,000个细胞/孔的密度接种在黑色96孔板中过夜，并用10％细菌上清液处理24h。然后，在室温(rt)下将细胞用含4％多聚甲醛的pbs(ph7.3)固定20min。固定的细胞用pbs洗涤，并用含0.5％tritonx-100的pbs渗透10min。用pbs洗涤后，将板与封闭缓冲液(4％bsa/pbs)在室温下温育1h，然后在4℃加入一级抗体持续12h(抗p44/42mapk小鼠抗体(4696s，cellsignalling)抗磷酸化p44/42(t202/y204)mapk兔抗体(9101s，cellsignalling)，均为1:100，用1％bsa/pbs稀释)。然后用pbs洗涤两次，接着与二级抗体alexaflour488偶联的抗兔(molecularprobesinc)和偶联的alexaflour594((molecularprobesinc)在室温下一起温育1h。用pbs洗涤3次后，添加dapi持续10分钟，接着用pbs洗涤3次。然后使用配有20倍物镜和适合检测所用荧光染料的滤光片组的imageexpresspico显微镜(moleculardevices)观察板。绘制了由pico分析模块生成的原始分析数据，并使用graphpadprism7软件进行分析。
实施例1–skmel2黑素瘤细胞系
评估以下处理对skmel2黑素瘤细胞系(wtbraf；nras中的n61r致癌突变)的作用：(1)以登录号ncimb42382保藏的菌株(“ncimb42382”)；(2)在ycfa培养基中的维罗非尼(vemu)；(3)vemu和ncimb42382；(4)在ycfa培养基中的氮杂胞苷-c(aza-c)；(5)aza-c和ncimb42382；(6)vemu、aza-c和ncimb42382。
使用材料和方法中的方案评估了skmel2细胞系中的map2基因表达，并且结果示于图1中。相对于两个阴性对照(仅细胞系，和ycfa )，所有ncimb42382处理(单独或与vemu和/或aza-c组合)均可提高map2基因表达。使用材料和方法中的方案评估了skmel2细胞系的克隆源性存活，并且结果示于图2中。使用材料和方法中的方案评估了skmel2细胞系的软琼脂生长，并且结果示于图3中。vemu aza-c改善了ncimb42382对软琼脂生长的抑制作用。使用材料和方法中的方案评估了skmel2细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图4中(未评估vemu、aza-c和ncimb42382)。使用材料和方法中的方案，通过另一种测定(磷酸化erk染色强度)进一步评估skmel2细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图27中。单独或与vemu或aza-c组合的ncimb42382与仅细胞和ycfa 对照相比，降低了磷酸化erk染色强度。
这些结果表明，单独或与维罗非尼和/或氮杂胞苷-c组合的ncimb42382可能具有诱导黑素瘤细胞系(skmel2)中map2基因表达的作用。此外，维罗非尼 氮杂胞苷-c增强了ncimb42382对软琼脂生长的抑制作用。此外，单独或与维罗非尼或氮杂胞苷-c组合的ncimb42382可能具有抑制该细胞系中erk信号传导的作用。在此基础上，预期本发明的组合物可用于治疗或预防各种转移性癌症，特别是转移性黑素瘤。本发明的组合物还可用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症，例如包含nras中的致癌突变、尤其是突变nrasn61r的癌症。
实施例2–skmel28黑素瘤细胞系
评估以下处理对skmel28黑素瘤细胞系(braf中的v600e致癌突变)的作用：(1)ncimb42382；(2)在ycfa培养基中的维罗非尼(vemu)；(3)vemu和ncimb42382；(4)在ycfa培养基中的氮杂胞苷-c(aza-c)；(5)aza-c和ncimb42382；(6)vemu、aza-c和ncimb42382。
使用材料和方法中的方案评估了skmel28细胞系中的map2基因表达，并且结果示于图5中。使用材料和方法中的方案评估了skmel28细胞系的克隆源性存活，并且结果示于图6中。相对于两个阴性对照(ycfa和仅细胞系)，ncimb42382与vemu和/或aza-c组合降低了克隆源性存活。使用材料和方法中的方案评估了skmel28细胞系的软琼脂生长，并且结果示于图7中。使用材料和方法中的方案评估了skmel28细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图8中(未评估vemu、aza-c和ncimb42382)。相对于阴性对照(ycfa)，所有ncimb42382处理(单独或与vemu或aza-c组合)均减少了erk信号传导。使用材料和方法中的方案，通过另一种测定(磷酸化erk染色强度)进一步评估了skmel28细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图28中。单独或与vemu或aza-c组合的ncimb42382与仅细胞和ycfa 对照相比，降低了磷酸化erk染色强度。
这些结果表明，单独或与维罗非尼和/或氮杂胞苷-c组合的ncimb42382可能具有抑制erk信号传导和降低包含brafv600e突变的黑素瘤细胞系(skmel28)的克隆源性存活的作用。在此基础上，预期本发明的组合物可用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症，尤其是黑素瘤。特别地，预期本发明的组合物可用于治疗或预防此类包含braf中的致癌突变，特别是在第600位并且尤其是突变brafv600e的癌症。
实施例3–skmel31黑素瘤细胞系
评估以下处理对skmel31黑素瘤细胞系(对于brafv600e是杂合的)的作用：(1)ncimb42382；(2)在ycfa培养基中的维罗非尼(vemu)；(3)vemu和ncimb42382；(4)在ycfa培养基中的氮杂胞苷-c(aza-c)；(5)aza-c和ncimb42382；(6)vemu、aza-c和ncimb42382。
使用材料和方法中的方案评估了skmel31细胞系中的map2基因表达，并且结果示于图9中。使用材料和方法中的方案评估了skmel31细胞系的克隆源性存活，并且结果示于图10中。使用材料和方法中的方案评估了skmel31细胞系的软琼脂生长，并且结果示于图11中。vemu、aza-c和vemu aza-c改善了软琼脂生长和ncimb42382对克隆源性存活的抑制作用。使用材料和方法中的方案评估了skmel31细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图12中(未评估vemu、aza-c和ncimb42382的组合)。相对于阴性对照(ycfa)，所有ncimb42382处理(单独或与vemu或aza-c组合)均减少了erk信号传导。使用材料和方法中的方案，通过另一种测定(磷酸化erk染色强度)进一步评估skmel31细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图29中。
实施例4–451lu黑素瘤细胞系
评估以下处理对451lu黑素瘤细胞系(braf中的v600e致癌突变)的作用：(1)ncimb42382；(2)在ycfa培养基中的维罗非尼(vemu)；(3)vemu和ncimb42382；(4)在ycfa培养基中的氮杂胞苷-c(aza-c)；(5)aza-c和ncimb42382；(6)vemu、aza-c和ncimb42382。
使用材料和方法中的方案评估了451lu细胞系中的map2基因表达，并且结果示于图13中。相对于仅细胞系的阴性对照，所有ncimb42382处理(单独或与vemu和/或aza-c组合)均提高了map2基因表达。使用材料和方法中的方案评估了451lu细胞系的克隆源性存活，并且结果示于图14中。相对于两个阴性对照(仅细胞系，和ycfa dmso)，所有ncimb42382处理(单独或与vemu和/或aza-c组合)均降低了克隆源性存活。使用材料和方法中的方案评估了451lu细胞系的软琼脂生长，并且结果示于图15中。氮杂胞苷c增强了ncimb42382对软琼脂生长的抑制作用。使用材料和方法中的方案评估了451lu细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图16中(未评估vemu、aza-c和ncimb42382的组合)。相对于阴性对照(ycfa dmso)，ncimb42382与vemu或aza-c组合减少了erk信号传导。使用材料和方法中的方案，通过另一种测定(磷酸化erk染色强度)进一步评估了451lu细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图30中。与未处理的(仅细胞)、ycfa 和具有dmso对照的ycfa 相比，单独或与vemu或aza-c组合的ncimb42382降低了磷酸化erk染色强度，当ncimb42382与vemu或aza-c组合时，观察到更大的作用。
这些结果表明，单独或与维罗非尼和/或氮杂胞苷-c组合的ncimb42382具有诱导map2基因表达以及降低带有brafv600e致癌突变的黑素瘤细胞系(451lu)的克隆源性存活和生长的作用。单独或与维罗非尼和/或氮杂胞苷-c组合的ncimb42382也具有抑制该细胞系中的erk信号传导的作用。在此基础上，预期本发明的组合物可用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症，尤其是黑素瘤，例如转移性黑素瘤。特别地，预期本发明的组合物可用于治疗或预防此类包含braf中的致癌突变，特别是在第600位并且尤其是突变brafv600e的癌症。
实施例5–ht29结直肠癌细胞系
评估以下处理对ht29结直肠癌细胞系(braf中的v600e致癌突变)的作用：(1)ncimb42382；(2)在ycfa培养基中的维罗非尼(vemu)；(3)vemu和ncimb42382；(4)在ycfa培养基中的氮杂胞苷-c(aza-c)；(5)aza-c和ncimb42382；(6)vemu、aza-c和ncimb42382。
使用材料和方法中的方案评估了ht29细胞系中的map2基因表达，并且结果示于图17中。相对于两个阴性对照(仅细胞系和ycfa )，ncimb42382与vemu和/或aza-c组合均可提高map2基因表达。使用材料和方法中的方案评估了ht29细胞系的克隆源性存活，并且结果示于图18中。相对于两个阴性对照(仅细胞系，和ycfa dmso)，所有ncimb42382处理(单独或与vemu和/或aza-c组合)均降低了克隆源性存活。aza-c改善了ncimb42382在抑制克隆源性存活中的作用。使用材料和方法中的方案评估了ht29细胞系的软琼脂生长，并且结果示于图19a和图19b中。使用材料和方法中的方案评估了ht29细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图20中(未评估vemu、aza-c和ncimb42382的组合)。相对于阴性对照(ycfa dmso)，仅ncimb42382erk信号传导。使用材料和方法中的方案，通过另一种测定(磷酸化erk染色强度)进一步评估ht29细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图31中。与ycfa 和ycfa dmso对照相比，单独或与vemu或aza-c组合的ncimb42382降低了磷酸化erk染色强度，当ncimb42382与aza-c结合时观察到更大的作用。
这些结果表明，单独或与维罗非尼和/或氮杂胞苷-c组合的ncimb42382在带有v600e致癌突变的细胞系(ht29)中具有诱导map2基因表达，降低克隆源性存活和抑制erk信号传导的作用。在此基础上，预期本发明的组合物可用于治疗或预防包含致癌erk信号传导的癌症，尤其是结直肠癌，例如转移性结直肠癌。特别地，预期本发明的组合物可用于治疗或预防此类包含braf中的致癌突变，特别是在第600位并且尤其是突变brafv600e的癌症。
实施例6–hct116细胞系
评估以下处理对hct116结直肠癌细胞系(对于kras中的g13d突变是杂合的)的作用：(1)ncimb42382；(2)维罗非尼(vemu)；(3)vemu和ncimb42382；(4)氮杂胞苷-c(aza-c)；(5)aza-c和ncimb42382；(6)vemu、aza-c和ncimb42382。
使用材料和方法中的方案，通过磷酸化erk染色强度测定评估了hct116细胞系中的erk信号传导，并且结果示于图32中。与未处理的、ycfa 和具有dmso对照的ycfa 相比，仅ncimb42382降低了磷酸化erk染色强度。
实施例7–gpr109arna在分化ht29(ht29mtx)细胞中的表达
gpr109a是在结肠和肠上皮细胞的面向腔的顶膜中表达的g蛋白偶联受体。在结肠癌细胞系中发现了gpr109a表达沉默，并且已报道在细菌发酵产物如丁酸盐存在下诱导其表达可诱导肿瘤细胞凋亡[61]。
甲氨蝶呤处理产生的分化ht29细胞(ht29mtx细胞)形成了不可渗透的极化顶膜/粘膜和基底外侧/浆膜，并且其在结构上和功能上类似于小肠的上皮细胞。与用单独的pma(或ycfa 培养基中的pma)处理相比，用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(pma)和ncimb42382上清液处理的ht-29mtx细胞表现出更高的gpr109arna表达，参见图21a。pma处理ht29细胞会诱导转移表型，包括增加的迁移和侵袭能力[62]。因此，这些数据表明，本发明的组合物可用于治疗转移性癌症，特别是转移性结直肠癌或小肠癌如小肠腺癌，并且特别是包含致癌erk信号传导的那些。这些数据还表明，作为gpr109a表达的结果，本发明的组合物可通过诱导细胞凋亡的机制来实现这种治疗。
实施例8–ncimb42382对ht29细胞系分泌tnf-α的影响
ncimb42382上清液单独或与thp1条件培养基(cm)一起诱导从ht29癌细胞系(结直肠癌)分泌tnf-α，分别参见图22b和图22a。
实施例9–ncimb42382的发酵概况
使用rapidid32a分析，ncimb42382对α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶的发酵以及精氨酸、亮氨酰-甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸、组氨酸和谷氨酰谷氨酸的利用测试呈阳性(图23a)。使用
实施例10–副拟杆菌属菌株对脾细胞增殖的影响
所测试的副拟杆菌属菌株是ncimb42382(狄氏副拟杆菌)、菌株参考1(狄氏副拟杆菌)、菌株参考2(狄氏副拟杆菌)、菌株参考3(副拟杆菌属种)、菌株参考4(约氏副拟杆菌)、菌株参考5(狄氏副拟杆菌)、菌株参考6(狄氏副拟杆菌)、菌株参考7(粪副拟杆菌)、菌株参考8(狄氏副拟杆菌)、以登录号dsmz19448保藏的菌株(古氏副拟杆菌)和以登录号dsmz29187保藏的菌株(古氏副拟杆菌)。与ycfa 或未处理的细胞相比，培养72h后，所有菌株均诱导脾细胞增殖(图25)。脾细胞包括t细胞、b细胞和巨噬细胞的各种子集[63]，负责细胞介导的免疫和体液免疫。因此，这些数据表明用副拟杆菌属菌株进行处理可增强细胞介导的免疫和体液免疫，例如响应于肿瘤抗原。此外，副拟杆菌属菌株可特别用于例如由黑素瘤引起的免疫受损或免疫抑制的癌症受试者中(参见例如[27])。
实施例11–副拟杆菌属菌株对脾细胞分泌细胞因子的影响
所测试的副拟杆菌属菌株是ncimb42382(狄氏副拟杆菌)、菌株参考1(狄氏副拟杆菌)、菌株参考2(狄氏副拟杆菌)、菌株参考3(副拟杆菌属种)、菌株参考4(约氏副拟杆菌)、菌株参考5(狄氏副拟杆菌)、菌株参考6(狄氏副拟杆菌)、菌株参考7(粪副拟杆菌)、菌株参考8(狄氏副拟杆菌)、dsmz19448(古氏副拟杆菌)、dsmz29187(古氏副拟杆菌)，并且结果示于图26中。所有测试的副拟杆菌属菌株相比于ycfa 培养基和未处理的对照均引起tnf-α、il-1β、il-27、il-10、mip-2、mip-1α、mip-1β、il-22、il-5和cxcl1的更多分泌。此外，所有测试的副拟杆菌属菌株相比于ycfa 培养基对照均引起il-2、gm-csf、ifn-γ、il-6、ip-10、il-18、il-23和rantes的更多分泌。因此，这些数据进一步表明用副拟杆菌属菌株进行处理可增强细胞介导的免疫和体液免疫，例如响应于肿瘤抗原，并且可特别用于免疫受损或免疫抑制的癌症受试者。此外，已报道尤其对于il-2[64]、gm-csf[65]、ifn-γ[66]和il-27[67]的抗癌作用，进一步表明副拟杆菌属菌株在治疗以致癌erk信号传导为特征的癌症中的效用。
实施例12–额外副拟杆菌属菌株对脾细胞分泌细胞因子的影响
所测试的副拟杆菌属菌株是：菌株参考2(狄氏副拟杆菌)、菌株参考7(粪副拟杆菌)、菌株参考9(狄氏副拟杆菌)、菌株参考10(约氏副拟杆菌)、菌株参考11(副拟杆菌属种)、菌株参考12(副拟杆菌属种)、菌株参考13(副拟杆菌属种)、菌株参考14(副拟杆菌属种)和菌株参考15(副拟杆菌属种)。结果示于图33中。用来自大多数测试的副拟杆菌属菌株的上清液处理小鼠脾细胞相比于ycfa 培养基和未处理的对照引起促炎细胞因子/趋化因子ip-10、rantes、tnf-α、mip-1α、mip-1β和mip2的更多分泌。总的来说，这些结果表明用副拟杆菌属菌株进行处理引起免疫刺激作用，表明它们可增强细胞介导的免疫和体液免疫，例如响应于肿瘤抗原，并且在免疫受损或免疫抑制的癌症受试者中特别有用。值得注意的是，若干上调的细胞因子/趋化因子(rantes、mip-1α、tnf-α、mip-2、mip-1β)是由自然杀手t细胞(nk细胞)产生的[68]，并且所测试的副拟杆菌属菌株可能会刺激脾细胞群体内这些细胞的活化。nk细胞可直接检测并消除癌细胞，以及协调更广泛的免疫反应。因此，它们是癌症免疫疗法中有吸引力的靶标[69]。另外，增强nk细胞的活化也是希望的，因为在许多癌症受试者中其功能均降低[69]，表明了治疗干预的范围。副拟杆菌属菌株引起这种作用的潜在能力进一步表明它们在癌症治疗(例如包含致癌erk信号传导的癌症治疗)中，特别是在免疫受损或免疫抑制的癌症受试者中的效用。
实施例13–狄氏副拟杆菌菌株dsm20701的短/中链脂肪酸产生概况
狄氏副拟杆菌菌株dsm20701给出了以下短/中链脂肪酸的概况：
实施例14–额外副拟杆菌属菌株的短/中链脂肪酸产生概况
方法
根据实施例13测量下文详述的菌株的短/中链脂肪酸产生概况。
结果
可看出，所测试的不同副拟杆菌属菌株一致地同时产生乙酸和丙酸。
序列
seqidno:1(狄氏副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm5825-ab238922)
seqidno:2(狄氏副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm13400-ab238923)
seqidno:3(狄氏副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm13401-ab238924)
seqidno:4(狄氏副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm13402-ab238925)
seqidno:5(狄氏副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm13403-ab238926)
seqidno:6(狄氏副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm13404-ab238927)
seqidno:7(粪副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm9497-ab238928)
seqidno:8(粪副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm13405-ab238929)
seqidno:9(狄氏副拟杆菌菌株755/ncimb42382的共同16srrna基因序列)
seqidno:10(古氏副拟杆菌菌株wal1203416s核糖体rna基因，部分序列-genbank:ay974070.1)
用于qpcr的引物
seqidno:17(古氏副拟杆菌菌株dsmz19448/jcm13446，16s核糖体rna基因，部分序列-genbank:eu136697.1):
seqidno:18(古氏副拟杆菌菌株dsmz29187/bs-c3-216s，核糖体rna基因，部分序列-genbankgq456205.2):
seqidno:19：菌株参考1(狄氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:20：菌株参考2(狄氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:21：菌株参考3(副拟杆菌属种)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:22：菌株参考4(狄氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:23：菌株参考5(狄氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:24：菌株参考6(狄氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:25：菌株参考7(粪副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:26菌株参考8(狄氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:27菌株参考9(狄氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:28菌株参考10(约氏副拟杆菌)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:29菌株参考11(副拟杆菌属种)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:30菌株参考12(副拟杆菌属种)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:31菌株参考14(副拟杆菌属种)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:32菌株参考15(副拟杆菌属种)16s核糖体rna基因，使用geneious组装：
seqidno:33戈氏副拟杆菌基因，16s核糖体rna，部分序列，菌株：jcm15724：
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<400>9
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<212>dna
<213>古氏副拟杆菌(parabacteroidesgoldsteinii)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<210>17
<211>2002
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<213>古氏副拟杆菌菌株dsmz19448/jcm13446(parabacteroidesgoldsteiniistraindsmz19448/jcm13446)
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<213>古氏副拟杆菌菌株dsmz29187/bs-c3-2(parabacteroidesgoldsteiniistraindsmz29187/bs-c3-2)
<400>18
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<210>19
<211>1397
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<213>狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)
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ctgccgcctcgactgca1397
<210>20
<211>1403
<212>dna
<213>狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)
<400>20
aggccgatccttgtcggttacggacttcaggtacccccggctcccatggcttgacgggcg60
gtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgccatggctgatgcgcgattactagcga120
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<213>副拟杆菌属种(parabacteroidessp.)
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<213>狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)
<400>22
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ttccgcctacctcaaatatactcaagtcatccagtttcaacggcaattttatggttgagc840
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<211>1405
<212>dna
<213>狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)
<400>23
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attccgcctgcctcaaacatactcaagccccccagtttcaacggcaattctatggttgag840
ccacagactttcaccgctgacttaaaaggccgcctacgcaccctttaaacccaataaatc900
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cgcgctgcccctcgacttgcatggt1405
<210>24
<211>1365
<212>dna
<213>狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)
<400>24
gatcctcgcggttacggacttcaggtacccccggctcccatggcttgacgggcggtgtgt60
acaaggcccgggaacgtattcaccgcgccatggctgatgcgcgattactagcgaatccag120
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accagagtcctcagcatcacctgttagtaactagtggcaagggttgcgctcgttatggca360
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attgctagaaaaggtgtttccacctcggtccgaatgcgttcaaacccgggtaaggttcct480
cgcgtatcatcgaattaaaccacatgttcctccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctt540
tgagtttcaccgttgccggcgtactccccaggtggatcacttaacgctttcgctgtgccg600
cttacagtgtatcgcaaacagctagtgatcatcgtttactgcgtggactaccagggtatc660
taatcctgtttgatccccacgctttcgtgcatcagcgtcagtcatggcttggcaggctgc720
cttcgcaatcggggttctgcgtgatatctatgcatttcaccgctacaccacgcattccgc780
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<211>1415
<212>dna
<213>粪副拟杆菌(parabacteroidesmerdae)
<400>25
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<210>26
<211>1375
<212>dna
<213>狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)
<400>26
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tcatcgaattaaaccacatgttcctccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtt540
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gtgtatcgcaaacagctagtgatcatcgtttactgcgtggactaccagggtatctaatcc660
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aatcggggttctgcgtgatatctatgcatttcaccgctacaccacgcattccgcctgcct780
caaacatactcaagccccccagtttcaacggcaattctatggttgagccacagactttca840
ccgctgacttaaaaggccgcctacgcaccctttaaacccaataaatccggataacgctcg900
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<211>1390
<212>dna
<213>狄氏副拟杆菌(parabacteroidesdistasonis)
<400>27
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cttaagccgacacctcacggcacgagctgacgacaaccatgcagcacctcgcaaacggct420
attgctagaaaaggtgtttccacctcggtccgaatgcgttcaaacccgggtaaggttcct480
cgcgtatcatcgaattaaaccacatgttcctccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctt540
tgagtttcaccgttgccggcgtactccccaggtggatcacttaacgctttcgctgtgccg600
cttacagtgtatcgcaaacagctagtgatcatcgtttactgcgtggactaccagggtatc660
taatcctgtttgatccccacgctttcgtgcatcagcgtcagtcatggcttggcaggctgc720
cttcgcaatcggggttctgcgtgatatctatgcatttcaccgctacaccacgcattccgc780
ctgcctcaaacatactcaagccccccagtttcaacggcaattctatggttgagccacaga840
ctttcaccgctgacttaaaaggccgcctacgcaccctttaaacccaataaatccggataa900
cgctcggatcctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccgatccttattcata960
aggtacatacaaaacgggacacgtcccgcactttattcccttataaaagaggtttacgat1020
ccatagaaccttcatccctcacgcgacttggctggttcagcctttcggccattgaccaat1080
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cttcctctcagaacccctatccatcgtcggtttggtgggccgttaccccgccaactgcct1200
aatggaacgcatgcctatctatcagcgatgaatctttagcaaatatccccatgcggggcc1260
cctgcttcatgcggtattagtccgactttcgccgggttatccccctctgataggtaagtt1320
gcatacgcgttactcacccgtgcgccggtcgccacccggtattgctacctggtgctgccc1380
cctcgactgc1390
<210>28
<211>1421
<212>dna
<213>约氏副拟杆菌(parabacteroidesjohnsonii)
<400>28
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tagagattagcatcctgtcgccaggtagctgccctttgtccatgccattgtaacacgtgt240
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ctcgtaatcagctattgctagaagacctctttcaaggtcggtctgactacgttcaaaccc480
gggtaaggttcctcgcgtatcatcgaattaaaccacatgttcctccgcttgtgcgggccc540
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ctaccagggtatctaatcctgtttgatacccacgctttcgtgcttcagtgtcagttatgg720
tttagtaagctgccttcgcaattggagttctgcgtgatatctatgcatttcaccgctaca780
ccacgcattccgcctacctcaaacacactcaagtaacccagtttcaacggcaattttatg840
gttgagccacaaactttcaccgctgacttaaattaccacctacgcaccctttaaacccaa900
taaatccggataacgctcgcatcctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccg960
atgcttattcatagggtacatacaaaatgggacacgtcccacactttattcccctataaa1020
agaagtttacaaaccatagatccttcatccttcacgcgacttggctggttcagcctctcg1080
gccattgaccaatattcctcactgctgcctcccgtaggagtttggtccgtgtctcagtac1140
caatgtgggggaccttcctctcagaacccctatccatcgtcggtttggtgggccgttacc1200
ccgccaactgcctaatggaacgcatgcctatctatcagcgatgaatctttaacaaatakt1260
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<212>dna
<213>副拟杆菌属种(parabacteroidessp.)
<400>29
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cacttaagccgacacctcacggcacgagctgacgacaaccatgcagcacctcgcaaatcg420
ctatcgctagagactctgtttccagagctgtcgaaatgcgttcaaacccgggtaaggttc480
ctcgcgtatcatcgaattaaaccacatgttcctccgcttgtgcgggcccccgtcaattcc540
tttgagtttcaccgttgccggcgtactccccaggtggatcacttaacgctttcgctgtgc600
cgcttacagtgtatcgcaaacagctagtgatcatcgtttactgcgtggactaccagggta660
tctaatcctgtttgatccccacgctttcgtgcatcagcgtcagtaatggcttggcaggct720
gccttcgcaatcggggttctgcgtgatatctatgcatttcaccgctacaccacgcattcy780
gcctgcctcaaacatactcaagccccccagtttcaacggcaattctatggttgagccaca840
gactttcaccgctgacttaaaaggccgcctacgcaccctttaaacccaataaatccggat900
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taaggtacatacmaaacgggacacgtcccgcactttattcccttataaaagaggtttacg1020
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<212>dna
<213>副拟杆菌属种(parabacteroidessp.)
<400>30
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taatggcttggcaggctgccttcgcaatcggggttctgcgtgatatctatgcatttcacc780
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tctatggttgagccacagactttcaccgctgacttaaaaggccgcctacgcaccctttaa900
acccaataaatccggataacgctcggatcctccgtattaccgcggctgctggcacggagt960
tagccgatccttattcataaggtacatacaaaacgggacacgtcccgcactttattccct1020
tataaaagaggtttacgatccatagaaccttcatccctcacgcgacttggctggttcagc1080
ctttcggccattgaccaatattcctcactgctgcctcccgtaggagtttggtccgtgtct1140
cagtaccaatgtgggggaccttcctctcagaacccctatccattgtcggtttggtgggcc1200
gttaccccgccaactgcctaatggaacgcatgcctatctatcagcgatgaatctttagca1260
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gtattgctaccctcgtgctgcccctcgacttgcatggttagcctccatccc1431
<210>31
<211>1399
<212>dna
<213>副拟杆菌属种(parabacteroidessp.)
<400>31
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cggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgccatggctgatgcgcgattactagc120
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cattccgcctgcctcaaacatactcaagccccccagtttcaacggcaattctatggttga840
gccacagactttcaccgctgacttaaaaggccgcctacgcaccctttaaacccaataaat900
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tattcataaggtacatacaaaacgggacacgtcccgcactttattcccttataaaagagg1020
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tgctgcccctcgactgcat1399
<210>32
<211>1371
<212>dna
<213>副拟杆菌属种(parabacteroidessp.)
<400>32
gcgaggtatcgagactactaggtacccccggctcccatggcttgacgggcggtgtgtaca60
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agagtcctcagctttacctgttagtaactagtggcaagggttgcgctcgttatggcactt360
aagccgacacctcacggcacgagctgacgacaaccatgcagcacctcgcaaatcgctatt420
gctagaggctctgtttccacatcggtccaaatgcgttcaaacccgggtaaggttcctcgc480
gtatcatcgaattaaaccacatgttcctccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttga540
gtttcaccgttgccggcgtactccccaggtggatcacttaacgctttcgctgtgccgctt600
accgtgtatcgcaaacagctagtgatcatcgtttactgcgtggactaccagggtatctaa660
tcctgtttgatccccacgctttcgtgcatcagcgtcagtcatggcttggcaggctgcctt720
cgcaatcgaggttctgcgtgatatctaagcatttcaccgctacaccacgcattccgcctg780
cctcaaacatactcaagccccccagtttcaacggcaattctatggttgagccacagactt840
tcaccgctgacttaaaaggccgcctacgcaccctttaaacccaataaatccggataacgc900
tcggatcctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccgatccttattcataagg960
tacatacaaaacrggacacgtcccgcactttattcccttataaaagaggtttacgatcca1020
tagaaccttcatccctcacgcgacttggctggttcaggcttacgcccattgaccaatatt1080
cctcactgctgcctcccgttggagtttggtccgtgtctcagtaccaatgtgggggacctt1140
cctctcagaacccctatccatcgtcggtttggtgggccgttaccccgccaactgcataat1200
ggaacgcatgcctatctatcagcgatgaatctttagcaaatatccccatgcgggacccct1260
gcttcatgcggtattagtccgactttcgccgggttatccccctctgataggtaagttgca1320
tacgcgttactcacccgtgcgccggtcgccacccggtattgctacgggtga1371
<210>33
<211>1485
<212>dna
<213>戈氏副拟杆菌(parabacteroidesgordonii)
<400>33
agagtttgatcctggctcaggatgaacgctagcgacaggcttaacacatgcaagtcgagg60
ggcagcaggaagtagcaatactttgctggcgaccggcgcacgggtgagtaacgcgtatgc120
aacctacctatcagagggggataacccggcgaaagtcggactaataccgcataaaacagg180
ggtcccgcatgggaatatttgttaaagattaattgctgatagatgggcatgcgttccatt240
agatagttggtaaggtaacggcttaccaagtctgcgatggataggggttctgagaggaag300
gtcccccacactggtactgagacacggaccagactcctacgggaggcagcagtgaggaat360
attggtcaatgggcgagagcctgaaccagccaagtcgcgtgaaggatgaaggatctatgg420
ttcgtaaacttcttttataagggaataaagtgcggacgtgtcctgttttgtatgtacctt480
atgaataaggatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatccgagcgt540
tatccggatttattgggtttaaagggtgcgtaggtggtttattaagtcagcggtgaaagt600
ttgtggctcaaccataaaattgccgttgaaactggttaacttgagtatatttgaggtagg660
cggaatgcgtggtgtagcggtgaaatgcatagatatcacgcagaactccaattgcgaagg720
cagcttactaaactataactgacactgaagcacgaaagcgtggggatcaaacaggattag780
ataccctggtagtccacgcagtaaacgatgattactaggagtttgcgatacacagtaagc840
tctacagcgaaagcgttaagtaatccacctggggagtacgccggcaacggtgaaactcaa900
aggaattgacgggggcccgcacaagcggaggaacatgtggtttaattcgatgatacgcga960
ggaaccttacccgggtttgaacgcattggacagtccttgaaagaggatctctagcaatag1020
ccatttgcgaggtgctgcatggttgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgtcggcttaagtg1080
ccataacgagcgcaacccttatctttagttactaacaggtctgctgaggactctaaagag1140
actgccagcgtaagctgtgaggaaggtggggatgacgtcaaatcagcacggcccttacat1200
ccggggcgacacacgtgttacaatggtggggacaaagggcagctacacagcgatgtgatg1260
ctaatctccaaaccccatctcagttcggatcgaagtctgcaacccgacttcgtgaagctg1320
gattcgctagtaatcgcgcatcagccatggcgcggtgaatacgttcccgggccttgtaca1380
caccgcccgtcaagccatgggagttgggggtacctaaagtccgtaaccgcaaggatcggc1440
ctaggtaaaaccgatgactggggctaagtcgtaaccaaggtaacc1485
1.一种包含副拟杆菌属细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防受试者的癌症的方法中；其中所述癌症包含致癌erk信号传导。
2.根据权利要求1使用的组合物，其中所述癌症包含braf、nras、araf、craf、egfr、grb2、sos、hras、kras如kras4a或kras4b、mek1、mek2、erk1或erk2中的致癌突变或其过表达。
3.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含rsk、dusp1、dusp5、dusp6或spry中的致癌突变或其表达下调。
4.根据权利要求2使用的组合物，其中所述癌症包含(i)braf和/或(ii)nras中的致癌突变；其中根据(i)，优选地，所述致癌突变在braf的第600位，任选地其中所述癌症还包含braf的过表达；其中根据(ii)，优选地，所述致癌突变是nrasq61r，任选地其中所述癌症还包含nras的过表达。
5.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含kras中的致癌突变，优选地其中所述致癌突变在kras的第13位，更优选地其中所述致癌突变是krasg13d。
6.根据权利要求2-5中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含选自brafv600e、k601e、g469a、g469v、l597r、k601n、g464v、n581s、l597q、a598v、g464r、g466a或g469e的致癌突变；任选地其中所述癌症是结直肠癌。
7.根据权利要求2-5中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含选自brafv600e、v600k、v600r或v600d的致癌突变；任选地其中所述癌症是黑素瘤。
8.根据权利要求4-7中任一项使用的组合物，其中所述癌症包含所述突变brafv600e。
9.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述癌症是结直肠癌或黑素瘤。
10.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株是狄氏副拟杆菌、粪副拟杆菌或古氏副拟杆菌物种。
11.根据权利要求10使用的组合物，其中所述细菌菌株是所述狄氏副拟杆菌物种。
12.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述方法包括相对于所述组合物的施用同时、分别或依次施用braf抑制剂；优选地其中所述braf抑制剂选自维罗非尼、达拉非尼或恩考芬尼；更优选地其中所述braf抑制剂是维罗非尼。
13.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述方法包括相对于所述组合物的施用同时、分别或依次施用胞苷类似物；优选地其中所述胞苷类似物选自氮杂胞苷-c、地西他滨或泽布拉林；更优选地其中所述胞苷类似物是氮杂胞苷-c。
14.一种包含狄氏副拟杆菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗结直肠癌或黑素瘤的方法中。
15.根据权利要求9-14中任一项使用的组合物，其中所述癌症是结直肠癌。
16.根据权利要求9-14中任一项使用的组合物，其中所述癌症是黑素瘤。
17.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述癌症是转移性的。
18.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:9、1、2、3、4、5、6、7、8、10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列。
19.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与seqidno:9具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16srrna基因序列，更优选地其中所述细菌菌株具有由seqidno:9表示的16srrna基因序列。
20.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株是以登录号ncimb42382保藏的狄氏副拟杆菌菌株。
21.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，所述组合物用于在所述癌症的治疗或预防中抑制erk1和/或erk2信号传导的方法中。
22.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述受试者是免疫受损的。
23.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述受试者是免疫抑制的。
24.根据权利要求22或23使用的组合物，其中与无癌症受试者的淋巴结相比，所述受试者在淋巴结如转移性淋巴结内具有升高数量的调节性t细胞(treg)。
25.根据权利要求22-24中任一项使用的组合物，其中与来自无癌症受试者的一定体积的外周血单核细胞(pbmc)相比，所述受试者在相同体积的pbmc内具有升高数量的treg。
26.根据权利要求22-25中任一项使用的组合物，其中与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的pbmc内具有升高数量的髓样树突状细胞(mdc)。
27.根据权利要求22-26中任一项使用的组合物，其中与来自无癌症受试者的一定体积的pbmc相比，所述受试者在相同体积的pbmc内具有升高数量的浆细胞样树突状细胞(pdc)。
技术总结