本发明涉及实验动物模型技术领域，尤其是涉及一种前列腺癌pdx模型构建方法。
背景技术：
肿瘤是危害人类健康最严重的一类疾病，是导致人类死亡的最主要死因之一。根据世界卫生组织的数据统计显示，2008年全球肿瘤新发病例约为1270万，肿瘤死亡例数为760万。目前全球每年新增肿瘤患者约为900万人，预计到2025年全世界肿瘤发病率将比现在增加约60％，全球每年新增肿瘤患者人数将达到1500万人。我国肿瘤的发病率和死亡率居世界之首，每年死于肿瘤的人数超过160万，肿瘤发病率约为200/10万人，每年新发病例高达220万人，中国每4个死亡者中就有一个死于肿瘤，居死亡原因之首。前列腺癌是男性发病率较高的恶性肿瘤。在我国前列腺癌的发病率也位列于男性恶性肿瘤发病率的前列，而且近年来，发病率也有逐年上升的趋势。
pdx模型(patient-derivedxenografting,pdx)是一种通过将手术切除的病人肿瘤组织接种于免疫缺陷鼠体内而建立的新一代人源肿瘤异种移植模型。这种模型保留了原代肿瘤的组织学、遗传学特征并维持了病人肿瘤的异质性，其药效学结果与临床具有极高的相关性。pdx模型可以广泛的应用于新药开发，尤其是靶点药物的临床试验病人筛选和预测性生物标志物的研究中。相对于传统的细胞系移植模型，pdx模型未经过体外培养，较好地保持了原发肿瘤的遗传特性和异质性，实验结果临床预见性更好，更能够反应临床病人的实际情况。pdx模型的优势在于可以完整再现了肿瘤病理学、肿瘤遗传学等特征。此外，pdx模型也可以用于准确筛选靶向和化疗药物制定最佳用药方案。用于药物治疗效果的实时监测，以及肿瘤耐药机制的研究等。
目前实体肿瘤动物模型的种类有限，还无法满足临床前的研究的需求，阻碍了临床疗效的预测和临床前的研究，因此有必要建立高效稳定的肿瘤pdx模型。为了克服前列腺癌临床研究和治疗中动物模型有限的困难，本发明构建了前列腺癌人源肿瘤异种移植模型。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种前列腺癌pdx模型构建方法，采用本发明的构建方法获得的前列腺癌pdx模型与临床的前列腺癌具有较高的相似性，并且肿瘤细胞溶液移植后成瘤率高，保留了肿瘤组织原有的微环境，操作方法简单，成本较低，可以广泛应用于前列腺癌的个体化精准诊疗、抗癌新药临床前药物筛选和前列腺癌的研究。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种前列腺癌pdx模型构建方法，包括以下步骤：
将剪碎后的动物组织块与细胞比例为2×106-5×106个/ml的精囊腺细胞悬液混匀获得混合液，然后将混合液与基质胶混合移植至动物体内，再将肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，所述精囊腺细胞悬液中的精囊腺细胞比例为2×106个/ml。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，所述剪碎后的动物组织块的大小为10-30mm3。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，所述剪碎后的动物组织块与精囊腺细胞悬液的体积为1:1。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，所述将肿瘤细胞移植至动物体内进行传代的具体步骤为：获取肿瘤组织，冲洗切块，获得肿瘤组织块，在肿瘤组织块中加入组织冻存液获得肿瘤细胞溶液，颠倒混匀，冷藏及冷冻放置，然后将冷冻的肿瘤细胞溶液按照玻璃化复苏流程复苏及培养，最后将复苏后的肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，肿瘤细胞溶液按照玻璃化复苏流程复苏后于35-38℃条件下震荡培养，震荡培养的转速为20-40r/min，震荡时间为20-40min。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，所述颠倒混匀的时间为1-10min。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，所述肿瘤细胞溶液颠倒混匀后，放置温度为2-8℃条件下冷藏10-30min。
作为本发明所述前列腺癌pdx模型构建方法的优选实施方式，所述冷冻放置的时间为10-30min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种前列腺癌pdx模型构建方法，本发明构建了高效稳定的前列腺癌pdx模型，克服了前列腺癌临床研究和治疗中动物模型有限的困难，并且本发明依附小鼠生殖系统生长，与临床的前列腺癌具有较高的相似性；采用本发明的构建方法，肿瘤细胞移植后成瘤率高，保留了肿瘤组织原有的微环境，构建方法简单，成本较低，可以广泛应用于前列腺癌的个体化精准诊疗、抗癌新药临床前药物筛选和前列腺癌的研究。
附图说明
图1为前列腺癌pdx模型的肿瘤体积增殖趋势图；
图2为病人原代p0组织he染色图；
图3为小鼠p1肿瘤组织he染色图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种前列腺癌pdx模型构建方法
一种前列腺癌pdx模型构建方法，包括以下步骤：
1)细胞提取：取健康b-nod小鼠一只，下腹做t字切口，摘取精囊腺，剥离表面筋膜，置于200目筛网上轻柔研磨，收集精囊腺细胞，使用少量dmem混匀得精囊腺细胞悬液，调整精囊腺细胞在精囊腺细胞悬液中的比例为2×106个/ml浓度；
2)将动物组织块复苏后剪碎至大小为10-30mm3，将剪碎后的动物组织块和精囊腺细胞悬液按体积比为1:1混匀获得含有精囊腺细胞的组织块；
3)将含有精囊腺细胞的组织块移至装有eps的培养皿内培养获得混合液，密封，置于冰面上转移至动物房。在生物安全柜内，将混合液与基质胶按体积比为1:1混合移植至小鼠皮下；
4)将瘤块生长良好的荷瘤鼠，麻醉处死，无菌条件下剥去肿瘤组织，在30min内，使用heps溶液冲洗肿瘤组织，并将肿瘤组织切块至2-3mm3大小，获得肿瘤组织块，选取粉红色新鲜具有活力的肿瘤组织块置于dmem培养液中保存，48h内无法移植至宿主动物时，可直接进行组织冻存操作。在每2-3小块肿瘤组织块中加入2ml组织冻存液置于2ml灭菌冻存管获得肿瘤细胞溶液，颠倒混匀3分钟，放入2-8℃冰箱内静置20min，然后轻柔颠倒混匀4-5次，移入-20℃冰箱内冷冻20min，然后移至-80℃冰箱过夜，最后移入液氮环境长期冻存，然后从液氮罐取出冻存管，按照玻璃化复苏流程复苏后，于37℃条件下30r/min振荡培养30min，最后将复苏后的肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代，获得前列腺癌pdx模型。
实验动物的前处理：取检疫合格的spf级b-nod小鼠，给予40mg/kg的睾酮灌胃，灌胃次日接种，接种后每周给药1次。
实施例2、一种前列腺癌pdx模型构建方法
一种前列腺癌pdx模型构建方法，包括以下步骤：
1)细胞提取：取健康b-nod小鼠一只，下腹做t字切口，摘取精囊腺，剥离表面筋膜，置于200目筛网上轻柔研磨，收集精囊腺细胞，使用少量dmem混匀得精囊腺细胞悬液，调整精囊腺细胞在精囊腺细胞悬液中的比例为3×106个/ml浓度；
2)将动物组织块复苏后剪碎至大小为10-30mm3，将剪碎后的动物组织块和精囊腺细胞悬液按体积比为1:1混匀获得含有精囊腺细胞的组织块；
3)将含有精囊腺细胞的组织块移至装有eps的培养皿内培养获得混合液，密封，置于冰面上转移至动物房。在生物安全柜内，将混合液与基质胶按体积比为1:1混合移植至小鼠皮下；
4)将瘤块生长良好的荷瘤鼠，麻醉处死，无菌条件下剥去肿瘤组织，在30min内，使用heps溶液冲洗肿瘤组织，并将肿瘤组织切块至2-3mm3大小，获得肿瘤组织块，选取粉红色新鲜具有活力的肿瘤组织块置于dmem培养液中保存，48h内无法移植至宿主动物时，可直接进行组织冻存操作。在每2-3小块肿瘤组织块中加入2ml组织冻存液置于2ml灭菌冻存管获得肿瘤细胞溶液，颠倒混匀3分钟，放入2-8℃冰箱内静置20min，然后轻柔颠倒混匀4-5次，移入-20℃冰箱内冷冻20min，然后移至-80℃冰箱过夜，最后移入液氮环境长期冻存，然后从液氮罐取出冻存管，按照玻璃化复苏流程复苏后，于37℃条件下30r/min振荡培养30min，最后将复苏后的肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代，获得前列腺癌pdx模型。
实验动物的前处理：取检疫合格的spf级b-nod小鼠，给予40mg/kg的睾酮灌胃，灌胃次日接种，接种后每周给药1次。
实施例3、一种前列腺癌pdx模型构建方法
一种前列腺癌pdx模型构建方法，包括以下步骤：
1)细胞提取：取健康b-nod小鼠一只，下腹做t字切口，摘取精囊腺，剥离表面筋膜，置于200目筛网上轻柔研磨，收集精囊腺细胞，使用少量dmem混匀得精囊腺细胞悬液，调整精囊腺细胞在精囊腺细胞悬液中的比例为4×106个/ml浓度；
2)将动物组织块复苏后剪碎至大小为10-30mm3，将剪碎后的动物组织块和精囊腺细胞悬液按体积比为1:1混匀获得含有精囊腺细胞的组织块；
3)将含有精囊腺细胞的组织块移至装有eps的培养皿内培养获得混合液，密封，置于冰面上转移至动物房。在生物安全柜内，将混合液与基质胶按体积比为1:1混合移植至小鼠皮下；
4)将瘤块生长良好的荷瘤鼠，麻醉处死，无菌条件下剥去肿瘤组织，在30min内，使用heps溶液冲洗肿瘤组织，并将肿瘤组织切块至2-3mm3大小，获得肿瘤组织块，选取粉红色新鲜具有活力的肿瘤组织块置于dmem培养液中保存，48h内无法移植至宿主动物时，可直接进行组织冻存操作。在每2-3小块肿瘤组织块中加入2ml组织冻存液置于2ml灭菌冻存管获得肿瘤细胞溶液，颠倒混匀3分钟，放入2-8℃冰箱内静置20min，然后轻柔颠倒混匀4-5次，移入-20℃冰箱内冷冻20min，然后移至-80℃冰箱过夜，最后移入液氮环境长期冻存，然后从液氮罐取出冻存管，按照玻璃化复苏流程复苏后，于37℃条件下30r/min振荡培养30min，最后将复苏后的肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代，获得前列腺癌pdx模型。
实验动物的前处理：取检疫合格的spf级b-nod小鼠，给予40mg/kg的睾酮灌胃，灌胃次日接种，接种后每周给药1次。
实施例4、一种前列腺癌pdx模型构建方法
一种前列腺癌pdx模型构建方法，包括以下步骤：
1)细胞提取：取健康b-nod小鼠一只，下腹做t字切口，摘取精囊腺，剥离表面筋膜，置于200目筛网上轻柔研磨，收集精囊腺细胞，使用少量dmem混匀得精囊腺细胞悬液，调整精囊腺细胞在精囊腺细胞悬液中的比例为5×106个/ml浓度；
2)将动物组织块复苏后剪碎至大小为10-30mm3，将剪碎后的动物组织块和精囊腺细胞悬液按体积比为1:1混匀获得含有精囊腺细胞的组织块；
3)将含有精囊腺细胞的组织块移至装有eps的培养皿内培养获得混合液，密封，置于冰面上转移至动物房。在生物安全柜内，将混合液与基质胶按体积比为1:1混合移植至小鼠皮下；
4)将瘤块生长良好的荷瘤鼠，麻醉处死，无菌条件下剥去肿瘤组织，在30min内，使用heps溶液冲洗肿瘤组织，并将肿瘤组织切块至2-3mm3大小，获得肿瘤组织块，选取粉红色新鲜具有活力的肿瘤组织块置于dmem培养液中保存，48h内无法移植至宿主动物时，可直接进行组织冻存操作。在每2-3小块肿瘤组织块中加入2ml组织冻存液置于2ml灭菌冻存管获得肿瘤细胞溶液，颠倒混匀3分钟，放入2-8℃冰箱内静置20min，然后轻柔颠倒混匀4-5次，移入-20℃冰箱内冷冻20min，然后移至-80℃冰箱过夜，最后移入液氮环境长期冻存，然后从液氮罐取出冻存管，按照玻璃化复苏流程复苏后，于37℃条件下30r/min振荡培养30min，最后将复苏后的肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代，获得前列腺癌pdx模型。
实验动物的前处理：取检疫合格的spf级b-nod小鼠，给予40mg/kg的睾酮灌胃，灌胃次日接种，接种后每周给药1次。
实验例
观察与体重：每周观察或测量实施例1制备的前列腺癌pdx模型植入瘤块瘤径的变化，并测量小鼠体重。瘤径测量：皮下植入使用游标卡尺测量瘤块的长径和短径，以公式：v＝(长径×短径2)/2记录瘤块体积变化。结果显示接种6周后肿瘤组织体积为259mm3以上。
病理检测：参考图1，待瘤块组织长至约800mm3以上，处死小鼠后进行剖检，观察病灶转移并剥离皮下肿瘤组织，保留一半以上组织量进行玻璃化冻存，剩余组织根据检测需求切分并各自保存。
参考图2-3，he染色确定肿瘤结构，观察核分裂像确认肿瘤组织活性。接种后6周小鼠体内培养后，组织内腺细胞大量增殖，仍可见腺泡状组织结构，非肿瘤透明细胞消失，基质逐渐被鼠源组织取代。
本发明构建了高效稳定的前列腺癌pdx模型，克服了前列腺癌临床研究和治疗中动物模型有限的困难，并且本发明依附小鼠生殖系统生长，与临床的前列腺癌具有较高的相似性；采用本发明的构建方法，肿瘤细胞移植后成瘤率高，保留了肿瘤组织原有的微环境，构建方法简单，成本较低，可以广泛应用于前列腺癌的个体化精准诊疗、抗癌新药临床前药物筛选和前列腺癌的研究。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
1.一种前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将剪碎后的动物组织块与细胞比例为2×106-5×106个/ml的精囊腺细胞悬液混匀获得混合液，然后将混合液与基质胶混合移植至动物体内，再将肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代。
2.如权利要求1所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，所述精囊腺细胞悬液中的精囊腺细胞比例为2×106个/ml。
3.如权利要求1所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，所述剪碎后的动物组织块的大小为10-30mm3。
4.如权利要求1所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，所述剪碎后的动物组织块与精囊腺细胞悬液的体积为1:1。
5.如权利要求1所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，所述将肿瘤细胞移植至动物体内进行传代的具体步骤为：获取肿瘤组织，冲洗切块，获得肿瘤组织块，在肿瘤组织块中加入组织冻存液获得肿瘤细胞溶液，颠倒混匀，冷藏及冷冻放置，然后将冷冻的肿瘤细胞溶液按照玻璃化复苏流程复苏及培养，最后将复苏后的肿瘤细胞溶液移植至动物体内进行传代。
6.如权利要求5所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，肿瘤细胞溶液按照玻璃化复苏流程复苏后于35-38℃条件下震荡培养，震荡培养的转速为20-40r/min，震荡时间为20-40min。
7.如权利要求5所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，所述颠倒混匀的时间为1-10min。
8.如权利要求5所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞溶液颠倒混匀后，放置温度为2-8℃条件下冷藏10-30min。
9.如权利要求5所述的前列腺癌pdx模型构建方法，其特征在于，所述冷冻放置的时间为10-30min。
技术总结