本发明属于生物信息
技术领域：
，具体涉及利用白酒挥发性成分指纹图谱作为数据基础，采用多元线性逐步回归思想建立数学模型，拟合线性回归方程对不同白酒的储存时间进行临时性鉴别。
背景技术：
：年份白酒是指贮存一定时间的白酒，因其绵柔、醇厚的口感得到消费者的广泛青睐。从年份原浆的概念首次提出以来，白酒年份酒顺应市场需求，迅速成为白酒市场的重要组成部分。在白酒年份酒市场蓬勃发展的同时，其年份酒也面临着诸多挑战，如假冒伪劣、以次充好等现象时有报道，迫切需要发展相应鉴别技术。目前，年份白酒检测方法的不完善，相关行业标准的缺失，使得白酒年份造假的问题时有发生。为了维护消费者的利益和规范年份酒市场的管理秩序，亟需发展能够快速、准确鉴别年份白酒的科学方法。在白酒年份酒监管鉴别技术研究领域，目前尚无适用的国家标准，研究人员提出的主要鉴别技术包括：徐占成提出了白酒年份鉴别挥发系数法，通过构建白酒年份酒存储年限与挥发物含量间的函数关系，实现白酒年份鉴定。杨涛等提出，利用年份酒中al、fe、cu等金属离子在不同年份酒中含量变化关系，利用酒体黏度与白酒贮存时间关系，利用白酒中微量共轭不饱和双键分子与年份酒贮存时间关系，多个方面鉴别年份酒。秦人伟提出利用碳-14衰变率与年份酒贮存时间关系，鉴别确定年份酒生产年份。以上研究方法，为白酒年份酒鉴别提供了多种鉴别方案，不过这些方法，或需要较为专业的大型仪器设备，或分析步骤较为繁琐、分析时间较长。此外，白酒是一个复杂的系统，挥发组分受多种因素的影响，因此，老化的信息经常淹没在嘈杂的背景中。目前白酒年份鉴定常用的红外光谱、荧光光谱、拉曼光谱或电化学方法，通过整个挥发组分的数据集来判别白酒年龄，较难剔除噪声的干扰。因此，对特定标记化合物的科学统计分析、量化关联仍存在较大研究空间。目前，白酒年份酒市场日益庞大，待检样品数量日益增多，如何发展简单、实用的快速检测鉴别技术，成为新的迫切需求。技术实现要素：本发明为了能够简单、实用、快速的判别白酒储存时间，提供了一种多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其采用gc-ms获取不同储存时间白酒的挥发性风味成分指纹图谱，利用白酒挥发性成分指纹图谱作为数据基础，采用多元线性逐步回归思想建立数学模型，拟合线性回归方程对不同白酒的储存时间进行临时性鉴别。更具体而言，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其包括如下步骤：a、样品制备：以不同储存时间的白酒为待测样品，采用超纯水将白酒样品酒精度降度至10％vol以下，并同时加入氯化钠和内标物，得待测样；b、挥发性化合物萃取：使用顶空固相微萃取方法，通过萃取头从步骤a所得待测样中顶空萃取挥发性化合物；c、指纹图谱采集：萃取头在进样口解吸附后，采用gc-ms采集挥发性成分指纹图谱信息，得到挥发性化合物的保留时间、匹配分数和峰面积；d、通过挥发性化合物的保留时间和匹配分数进行定性，对挥发性化合物的峰面积进行归一化处理后，采用校正后的峰面积进行多元逐步回归分析，建立多元线性逐步回归数学模型，得拟合线性回归方程，通过拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别。其中，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，步骤a中，样品制备的具体操作为：以不同储存时间的白酒为待测样品，采用超纯水将白酒样品降度至5～10％vol，取4～8ml置于进样瓶中，加入0.1～0.3g/ml氯化钠至溶液饱和，并加入占体系体积分数为1％～2％内标物，得待测样。其中，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，步骤a中，所述内标物为叔戊醇；所述内标物的浓度为8.05g/l。其中，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，步骤b中，顶空固相微萃取的参数为：40～60℃平衡3～10min，40～60℃提取20～80min。其中，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，步骤c中，萃取头在进样口240～260℃解吸附1～10min。其中，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，步骤c中，gc分析条件为：使用60m×0.25mm×0.50μmtg-waxms毛细管气相色谱柱，载气为高纯氦气，流速为1.0ml/min，分流比：20：1，程序升温为：起始50℃维持2min，以3℃/min升温至145℃，再以15℃/min升温至230℃并保持3min，进样口温度保持在250℃。其中，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，步骤c中，ms分析条件为：传输线温度200℃，离子源温度260℃，扫描质量范围m/z：33～350amu，电离方式：ei ；电子能量：70ev。进一步的，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法中，当步骤a中，待测样品为储存时间0、2、4、6、9、12、15、17、21和24个月份的白酒时，步骤d所得拟合线性回归方程为：time＝0.478*油酸乙酯-0.08*乙酸丙酯 0.026*十一醇-0.189*1-丁醇 0.782*2-己酸-苯乙酯 0.022*1-亚甲基-1h-茚-0.117*己酸糠酯-0.324*十六酸乙酯-0.17*异丁醛-0.115*(3z)-3-癸烯-1-醇乙酸酯，通过拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别；其中，time单位为月。本发明具有的效果是：本发明方法白酒年份酒样品的处理步骤简单，操作方便，适用于大规模样品的处理和筛选；气相色谱质谱联用仪技术稳定成熟，仪器分析的精度较高，样品之间的误差小，重复性高，结果可靠，分析通量大；本发明通过多元线性逐步回归思想建立数学模型，拟合线性回归方程，能够较好的进行白酒储存时间鉴定，判别准确度基本达到80％以上，具有速度快、自动化程度高、准确度高等优点。具体实施方式具体的，多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，包括如下步骤：a、样品制备：以不同储存时间的白酒为待测样品，采用超纯水将白酒样品酒精度降度至10％vol以下，并同时加入氯化钠和内标物，得待测样；b、挥发性化合物萃取：使用顶空固相微萃取方法，通过萃取头从步骤a所得待测样中顶空萃取挥发性化合物；c、指纹图谱采集：萃取头在进样口解吸附后，采用gc-ms采集挥发性成分指纹图谱信息，得到挥发性化合物的保留时间、匹配分数和峰面积；d、通过挥发性化合物的保留时间和匹配分数进行定性，对挥发性化合物的峰面积进行归一化处理后，采用校正后的峰面积进行多元逐步回归分析，建立多元线性逐步回归数学模型，得拟合线性回归方程，通过拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别。本发明中，以不同储存时间的白酒为待测样品，不同储存时间的待测样品数量不少于5个，同时由于天数的储存时间精确度太高，难以检测，本发明一般以月或年为单位取不同储存时间的待测样品。本发明中，通过gc-ms采集挥发性成分指纹图谱信息后，根据化合物的离子碎片、保留时间与数据库进行比对，对物质进行定性，确定物质，通过内标物只能对物质进行半定量。gc-ms采集出来的数据，包括保留时间、匹配分数和峰面积，这些数据即为建立多元线性逐步回归数学模型的原始数据。其中，上述数据中，保留时间和匹配分数用于对物质进行定性，确定物质：匹配分数是根据质谱碎片定义到的物质与谱库标准的物质进行对比，得到的比对分数，通常认为匹配分数大于80％的物质匹配正确，然后根据匹配分数大于80％物质的保留时间与该物质的标准化合物的保留时间进行对比，得到保留指数，保留指数误差不超过30％，就认为物质匹配正确。以此通过保留时间和匹配分数确定了不同储存时间白酒的物质。峰面积则反应白酒中各物质的含量多少，由于本发明没有做(也不需要)外标曲线进行标准定量，而是仅加入了内标物，因此本发明对各物质进行了半定量。本发明方法步骤d中，为使检测结果更准确，将校正后的所有样品的所有峰面积的log10的值采用spss里面的线性回归布进法，进行多元逐步回归分析，建立多元线性逐步回归数学模型，自动进行变量筛选，获得重要变量和方程系数，得到拟合线性回归方程；逐步法结合向前法和向后法的优点，在向前引入每一个新自变量之后，会重新对已代入的自变量进行计算，以检验其有无继续保留在方程中的价值，并以此为依据进行自变量的引入和剔除交替进行，直到没有新的变量可以引入或剔除为止。本发明方法步骤d中，获得拟合线性回归方程后，将未知存储时间白酒中的重要挥发性化合物的校正峰面积的log10值带入方程，即可测定其存储时间。本发明方法步骤a中，样品制备的具体操作为：以不同储存时间的白酒为待测样品，采用超纯水将白酒样品降度至5～10％vol，取4～8ml置于进样瓶中，加入0.1～0.3g/ml氯化钠至溶液饱和，并加入占体系体积分数为1％～2％内标物，得待测样。本发明方法步骤a中，采用浓度为8.05g/l的叔戊醇为内标物，以准确半定量白酒中对储存时间鉴别贡献较大的化合物。本发明方法步骤b中，顶空固相微萃取的参数为：40～60℃平衡3～10min，40～60℃提取20～80min，避免萃取时间过长，导致萃取效果变差；步骤c中，萃取头在进样口240～260℃解吸附1～10min。本发明方法步骤c中，gc分析条件为：使用60m×0.25mm×0.50μmtg-waxms毛细管气相色谱柱，载气为高纯氦气，流速为1.0ml/min，分流比：20：1，程序升温为：起始50℃维持2min，以3℃/min升温至145℃，再以15℃/min升温至230℃并保持3min，进样口温度保持在250℃。本发明方法步骤c中，ms分析条件为：传输线温度200℃，离子源温度260℃，扫描质量范围m/z：33～350amu，电离方式：ei ；电子能量：70ev。本发明采用gc-ms获取不同储存时间白酒的挥发性风味成分指纹图谱，利用白酒挥发性成分指纹图谱作为数据基础，采用多元线性逐步回归思想建立数学模型，拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别，准确度基本达到80％以上。更具体的，上述多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法中，当步骤a中，待测样品为储存时间0、2、4、6、9、12、15、17、21和24个月份的白酒时，步骤d所得拟合线性回归方程为：time＝0.478*油酸乙酯-0.08*乙酸丙酯 0.026*十一醇-0.189*1-丁醇 0.782*2-己酸-苯乙酯 0.022*1-亚甲基-1h-茚-0.117*己酸糠酯-0.324*十六酸乙酯-0.17*异丁醛-0.115*(3z)-3-癸烯-1-醇乙酸酯，通过拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别；其中，time单位为月。此外，经试验发现，应用步骤d所得拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别时，待测样品的储存时间在不超过拟合方程酒样的两倍时间时，准确度可达到80％以上；超过拟合方程酒样的两倍时间后，准确度有所降低，但仍保持在60％以上，相对于现有技术仍具有优势，在一定程度上也能反应白酒储存时间。当拟合方程酒样的香型和待测样品不同时，待测样品与拟合方程酒样的储存时间对结果的影响与前述类似，但拟合方程酒样的香型对结果准确度具有一定影响，香型差异导致准确度有所降低，但也能基本保证准确率达到80％以上。基于上述原因，在实际操作时，可根据待测样品的预估储存时间，选择适宜的拟合方程酒样，以保证结果的准确度。下面结合实施例对本发明作详细的说明；实施例在本发明技术方案的指导下实施，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，本发明的下述实施例仅作为本发明的事例而不是限制。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进，但所有这些改变和改进，均应在本发明保护范围之内。实施例1多元线性逐步回归临时鉴别白酒储存时间的方法：a、白酒样品的选择和预处理：取储存时间分别为0、2、4、6、9、12、15、17、21和24个月份的浓香型白酒样品(依次编号为b1～b10)，每个样本点平行检测6次；采用超纯水将样品降度处理到8％vol，并取降度后样品4ml置于20ml进样瓶中，并加入10μl8.05g/l的内标叔戊醇和0.8gnacl。b、挥发性化合物萃取：步骤a进样瓶置于50℃水浴平衡5min，随后将spme萃取头(50/30×mdvb/car/pdms)插入进样瓶顶空部分，于50℃吸附40min。c、指纹图谱采集：吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250℃解吸3min，采用gc-ms采集指纹图谱信息，得到挥发性化合物的保留时间、匹配分数和峰面积(所有样品共检测出98种化合物)；气相色谱分析条件：使用60m×0.25mm×0.50μmtg-waxms毛细管气相色谱柱，载气为高纯氦气，流速为1.0ml/min，分流比：20：1，程序升温为：起始50℃维持2min，以3℃/min升温至145℃，再以15℃/min升温至230℃并保持3min，进样口温度保持在250℃。质谱分析条件：传输线温度200℃，离子源温度260℃，扫描质量范围m/z：33～350amu，电离方式：ei ；电子能量：70ev。d、通过步骤c所得98种挥发性化合物的保留时间和匹配分数进行定性，确定98种挥发性化合物；对步骤c所得挥发性化合物的峰面积进行归一化处理后，将所有校正后的峰面积log10数据进行多元逐步回归分析，建立多元线性逐步回归数学模型(模型拟合优度见表1)，得拟合线性回归方程为：t(月)＝0.478*a1-0.08*a2 0.026*a3-0.189*a4 0.782*a5 0.022*a6-0.117*a7-0.324*a8-0.17*a9-0.115*a10(r2＝0.996)；将表2中b1～b10的各重要挥发性化合物的校正峰面积(log10)带入方程中，对白酒储存时间进行临时性鉴别(验证)，结果见表3。表1重要挥发性化合物及其方程系数物质编号物质名称方程系数a1油酸乙酯0.478a2乙酸正丙酯-0.08a3十一醇0.026a41-丁醇-0.189a5己酸-2-苯乙酯0.782a61-亚甲基-1h-茚0.022a7己酸糠酯-0.117a8十六酸乙酯-0.324a9异丁醛-0.17a10(3z)-3-癸烯-1-醇乙酸酯-0.115表2b1～b10中重要挥发性化合物的校正峰面积(log10)表3b1～b10储存时间鉴别样品编号实际储存时间(月)模型预测时间(月)b100b221.8b343.6b465.8b598.6b61211.3b71516.2b81716.9b92121.3b102424.3实施例2取储存时间分别为1、2、3、4和5年的浓香型白酒样品各两份进行分析(依次编号为c1～c10)，其余分析操作均与实施例1一致，各样品中重要挥发性化合物的校正峰面积见表4，并采用实施例1建立的模型和拟合线性回归方程对1～5年白酒的储存时间进行判断，结果见表5。表4c1～c10中重要挥发性化合物的校正峰面积(log10)a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10c16.621.280.252.4510.260.392.684.135.210.87c26.941.270.363.119.120.133.534.274.681.58c37.042.110.532.8823.750.834.225.015.072.39c47.801.370.473.2425.800.713.794.894.214.02c56.621.240.312.6949.420.633.624.365.753.58c66.052.060.142.8741.290.493.723.963.880.97c75.481.420.273.0353.460.532.994.034.912.32c87.451.330.332.9151.500.742.724.874.834.21c97.252.070.722.8564.360.693.934.314.364.58c107.281.880.432.8767.191.063.544.875.344.03表5c1～c10储存时间鉴别实施例3取储存时间分别为10、20、30和40个月的酱香型白酒样品各两份进行分析(依次编号为d1～d8)，其余分析操作均与实施例1一致，各样品中重要挥发性化合物的校正峰面积见表6，并采用实施例1建立的模型和拟合线性回归方程对10～40个月的酱香型白酒的储存时间进行判断，结果见表7。表6d1～d10中重要挥发性化合物的校正峰面积(log10)a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10d14.580.210.052.319.391.364.361.364.335.37d27.210.150.182.689.601.872.395.833.694.20d35.180.220.293.3121.000.424.014.362.573.05d44.390.140.334.1922.040.573.242.583.774.27d55.940.630.422.3734.971.063.194.322.082.58d63.570.340.072.6635.552.221.873.662.363.69d76.850.280.422.9743.284.191.116.073.874.21d87.040.190.373.1247.323.511.285.235.682.99表7d1～d8储存时间鉴别当前第1页1 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技术特征：1.多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：采用gc-ms获取不同储存时间白酒的挥发性成分指纹图谱，建立多元线性逐步回归数学模型，拟合线性回归方程对不同白酒的储存时间进行鉴别。
2.根据权利要求1所述的多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、样品制备：以不同储存时间的白酒为待测样品，采用超纯水将白酒样品酒精度降度至10％vol以下，并同时加入氯化钠和内标物，得待测样；
b、挥发性化合物萃取：使用顶空固相微萃取方法，通过萃取头从步骤a所得待测样中顶空萃取挥发性化合物；
c、指纹图谱采集：萃取头在进样口解吸附后，采用gc-ms采集挥发性成分指纹图谱信息，得到挥发性化合物的保留时间、匹配分数和峰面积；
d、通过挥发性化合物的保留时间和匹配分数进行定性，对挥发性化合物的峰面积进行归一化处理后，采用校正后的峰面积进行多元逐步回归分析，建立多元线性逐步回归数学模型，得拟合线性回归方程，通过拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别。
3.根据权利要求2所述的多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：步骤a中，样品制备的具体操作为：以不同储存时间的白酒为待测样品，采用超纯水将白酒样品降度至5～10％vol，取4～8ml置于进样瓶中，按浓度0.1～0.3g/ml加入氯化钠至饱和，并加入占体系体积分数1％～2％的内标物，得待测样。
4.根据权利要求3所述的多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：步骤a中，所述内标物为叔戊醇；所述内标物的浓度为8.05g/l。
5.根据权利要求2所述的多元线性逐步回归临时鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：步骤b中，顶空固相微萃取的参数为：40～60℃平衡3～10min，40～60℃提取20～80min。
6.根据权利要求2所述的多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：步骤c中，萃取头在进样口240～260℃解吸附1～10min。
7.根据权利要求2～6任一项所述的多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：步骤c中，gc分析条件为：使用60m×0.25mm×0.50μmtg-waxms毛细管气相色谱柱，载气为高纯氦气，流速为1.0ml/min，分流比：20：1，程序升温为：起始50℃维持2min，以3℃/min升温至145℃，再以15℃/min升温至230℃并保持3min，进样口温度保持在250℃。
8.根据权利要求2～6任一项所述的多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：步骤c中，ms分析条件为：传输线温度200℃，离子源温度260℃，扫描质量范围m/z：33～350amu，电离方式：ei ；电子能量：70ev。
9.根据权利要求2～8任一项所述的多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其特征在于：当步骤a中，待测样品为储存时间0、2、4、6、9、12、15、17、21和24个月份的白酒时，步骤d所得拟合线性回归方程为：time＝0.478*油酸乙酯-0.08*乙酸丙酯 0.026*十一醇-0.189*1-丁醇 0.782*2-己酸-苯乙酯 0.022*1-亚甲基-1h-茚-0.117*己酸糠酯-0.324*十六酸乙酯-0.17*异丁醛-0.115*(3z)-3-癸烯-1-醇乙酸酯，通过拟合线性回归方程对白酒储存时间进行鉴别；其中，time单位为月。
技术总结本发明公开了一种多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，属于生物信息技术领域。本发明为了能够简单、实用、快速的判别白酒储存时间，提供了一种多元线性逐步回归鉴别白酒储存时间的方法，其采用GC‑MS获取不同储存时间白酒的挥发性风味成分指纹图谱，利用白酒挥发性成分指纹图谱作为数据基础，采用多元线性逐步回归思想建立数学模型，通过拟合线性回归方程对不同白酒的储存时间进行鉴别。本发明能够较好的进行白酒储存时间鉴定，判别准确度基本达到80％以上，具有速度快、自动化程度高、准确度高等优点。
技术研发人员：许正宏;张晓娟;孟连君;沈才洪;陆震鸣;史劲松;王松涛
受保护的技术使用者：泸州品创科技有限公司;江南大学;泸州老窖股份有限公司
技术研发日：2021.03.31
技术公布日：2021.08.03
