本发明涉及植物组织培养和生物技术领域，具体为一种柠条锦鸡儿离体再生方法。
背景技术：
柠条(caraganakorshinskii)属豆科锦鸡属落叶大灌木，又叫毛条、白柠条，是一种生长在荒漠、半荒漠地区多年生灌木(王赞,高洪文,韩建国.柠条锦鸡儿dna提取及aflp反应体系的建立[j].草地学报,2005,13(2):126-129)。随着沙漠化治理工作的快速推进，锦鸡儿属植物作为荒漠区的优势植物，得到了高度重视。柠条对沙地环境有很强的适应能力，是防风固沙、保持水土、改善土壤微量元素含量、具有较高饲用及药用价值且表现出极强的抗逆性和适应性，不仅成为优良的生态、经济树种，还为植物抗逆性研究提供良好的材料(牛西午.柠条生物学特性研究[j].华北农学报，1998，13(4)：122-129)。
目前对柠条的研究多围绕其生态价值、生理生态、形态结构以及抗逆分子机理等方面，对其高效稳定再生体系建立报道甚少，迄今为止，柠条在组培方面相关研究都是以茎段、子叶节、上胚轴、下胚轴为外植体进行不定芽诱导。高玫等以柠条的上胚轴、下胚轴(或幼茎)直接诱导出不定芽(高玫,李天然.几种野生豆科锦鸡儿属(caraganafabr.)植物离体培养过程中器官分化和内源植物激素含量的关系[j].内蒙古大学学报(自然科学版),1990(03):127-137 162)；宋俊双等以柠条锦鸡儿无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，诱导出愈伤组织和直接诱导出不定芽并生根(宋俊双,王赞,孙桂芝,等.柠条锦鸡儿的组织培养[j].草地学报,2007,15(1):66-66)。慈忠玲等以柠条锦鸡儿的子叶和胚轴为外植体进行愈伤组织诱导(慈忠铃.柠条锦鸡儿愈伤组织的培养和分化[j].内蒙古林学院学报,1998,20(12):15-19)；邵玲玲以柠条茎段为外植体，建立一套较为完整的快繁体系(邵玲玲.柠条锦鸡儿组织培养技术[j].农业系统科学与综合研究(4):469-474)。但总体来说，柠条离体再生处于尝试阶段，其遗传转化受限的关键因素是缺乏高效的离体再生体系。
因此，开展柠条离体培养和植株再生研究刻不容缓，为培育创制转基因柠条新品种，实现柠条分子育种提供技术支持。
技术实现要素：
为了解决上述瓶颈问题，本发明人开展柠条离体再生研究，最终获得柠条离体再生体系。
发明人尝试以不同的外植体(如茎段、胚尖、下胚轴)做为起始材料进行研究探索，最终确定以柠条胚尖为外植体，建立柠条离体再生体系，实现柠条高效离体再生。目前采用胚尖作为外植体及其诱导培养实现离体再生，无论是柠条还是其他锦鸡儿属植物均尚未见报道。
本发明提供一种柠条锦鸡儿离体再生方法，其包括如下步骤：
(1)无菌苗的制备：将消毒的柠条种子接种至ms培养基中进行培养。优选地，第(1)步骤的具体操作：挑选颗粒饱满、无虫眼、无黑色斑点的柠条种子，消毒接种至ms培养基中。其中，消毒方式在超净台外用洗洁精清洗3min，75％回收酒精棉花包裹擦拭种子，进入超净台后再用75％回收酒精过一下后，用75％酒精消毒2min，最后用10％次氯酸钠消毒20min；
(2)不定芽诱导预培养：选取(1)中培养4-10d的无菌苗，切取胚尖接种至不定芽诱导预培养培养基上，所述不定芽诱导预培养培养基优选为ms改良培养基(ms培养基的大量元素和微量元素以及b5培养基的有机成分，后面简称msb5培养基)，并添加6-苄氨基嘌呤(ba)0.1-1mg/l和萘乙酸(naa)0.01-0.1mg/l，优选地ba添加量为0.4-0.6mg/l、naa为0.04-0.06mg/l，光下培养7-25d，优选为10-20d，最优选为14-16d；
优选地，第(2)步骤具体操作：选取(1)中培养7d的无菌苗，用解剖刀切取2mm左右胚尖，接种至不定芽诱导预培养培养基上。
(3)不定芽诱导培养：将第(2)步预培养后获得胚尖转接至不定芽诱导培养基进行培养，所述不定芽诱导培养基优选为以msb5为基本培养基，并添加6-苄氨基嘌呤(ba)1-6mg/l，优选地，ba添加量为3mg/l，培养时间为8-20d，优选为培养10-12d，植株不定芽诱导启动后，优选地再继代培养1-2次，更优选继代培养1次；
(4)不定芽伸长培养：将第(3)步中诱导出带有基座的丛生芽，接种至不定芽伸长诱导培养基，所述不定芽伸长培养基优选为以msb5作为基本培养基，并添加0.1-2mg/l6-ba与0.01-0.2mg/lnaa；优选地，6-ba添加量为0.8-1.2mg/l，naa添加量为0.05-0.1mg/l，培养20-35d，发现丛芽有明显生长的趋势；优选地，继代培养3-4次，优选为3次，得到伸长的芽苗。
进一步地，所述方法还包括下述步骤，即(5)生根培养：将第(4)步继代培养伸长的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导。优选地，所述生根培养基ms培养基作为基本培养基，并添加naa0.1-1.5mg/l，优选为0.5-1mg/l，于光下培养时间为30-40d。
优选地，第(1)至(5)中采用的培养基中添加蔗糖30g/l，肌醇0.1g/l，琼脂粉5.5g/l，调节培养基ph值为5.8。培养条件为20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照12h/d。
更进一步地，还包括下述步骤，即(6)炼苗：将第(5)步获得的已生根再生苗，挑选长势健壮的瓶苗进行炼苗。所述炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。
再进一步地，还包括下述步骤，即(7)移栽：将炼苗后的再生苗进行移栽，优选地移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护。
本发明首先针对不同的外植体的实验筛选出柠条胚尖为外植体效果最好，进而在不定芽诱导培养中，先是分析和利用柠条组织培养中需要的外源细胞分裂素浓度比生长素要大的多这一特点，尝试6-ba和kt。研究结果发现，相同培养时间使用6-ba对外植体的伤害较小，而胚尖接种于加kt的培养基，基部较早出现褐化坏死现象，由此选择6-ba为胚尖不定芽诱导激素。经进一步研究发现，经过外植体预培养后，再进行不定芽诱导培养时，如若在仅添加单一生长素naa培养基培养，会出现根提前被诱导出来的现象(这恰好为后续生根诱导提供了思路)，若仅在添加单一细胞分裂素6-ba且较高浓度水平6-ba会诱导出大量不定芽，这与通常要求的细胞分裂素浓度范围相差较大，这可能于柠条自身的特异性有关，之所以会出现这样的现象是因为柠条内源生长素远远大于细胞分裂素；另外，如果同时添加naa和6-ba，外植体会出现愈伤化的现象。更进一步地，在不定芽伸长培养阶段研究发现，多次继代培养过程中，如若仅使用6-ba激素，导致诱导出的不定芽伸长较困难，不定芽叶片颜色为深绿色且出现水渍化现象，因此改为选择6-ba和naa的组合并研究出最佳的配比。更进一步的在生根方面，基于不定芽诱导阶段发现的现象，将naa作为不定根诱导的优选激素，并且事实上也优于iba作为激素诱导生根的效果，最后确定采用naa是最佳激素。
附图说明
图1：茎段和下胚轴作为外植体时不定芽诱导情况。
图2：使用iba激素诱导生根状态。
图3：不定芽诱导预培养的状态。
图4：不定芽诱导培养的状态。
图5：不定芽增殖培养的状态。
图6：不定芽的伸长的状态。
图7：不定芽的伸长继代培养的状态。
图8：不定芽的生根状态。
图9：再生苗移栽入土后4周的植株。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例一
(1)外植体材料的制备
挑选颗粒饱满、无虫眼、无黑色斑点的柠条种子，先用洗洁精清洗3min，用75％回收酒精棉花包裹擦拭种皮后，超净台内操作用回收酒精过一下，再用干净的75％酒精消毒2min，最后用10％次氯酸钠消毒20min，无菌水清洗5～6次，无菌滤纸吸干材料表面水分，接种至ms基本培养基中，培养10d左右获得刚刚萌发的种子。其中，ms培养基中添加蔗糖30g/l，肌醇0.1g/l，琼脂粉5.5g/l，调节培养基ph值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
(2)不定芽诱导预培养
将柠条的茎段、胚尖、下胚轴为外植体，在相同的培养条件下进行离体再生。结果发现：茎段一个芽点只诱导出一个芽，大部分褐化枯死(如图1的左图)，下胚轴不健康愈伤化(如图1的右图)。而柠条胚尖作为外植体，则表现较好的芽的诱导效果，因此选择柠条胚尖为外植体以进行进一步研究。
将步骤(1)中获得的无菌材料，选取种皮开裂种子，使用手术刀将萌发后的柠条种子沿子叶中轴纵向剖开，切取2mm左右胚尖，将胚尖接种于msb5 0.5mg/l6-ba 0.05mg/lnaa培养基上，分别培养3、5、7、10、15d、18d、20d，旨在观察胚尖生长状态与不定芽诱导情况，进而确定预培养天数对胚尖分化性能的影响。其中，msb5培养基中添加蔗糖30g/l，肌醇0.1g/l，琼脂粉5.5g/l，调节培养基ph值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
结果表明：不同预培养天数对胚尖分化性影响差异性不大，当预培养时间为1、3、5、7d左右时间，胚尖逐渐变绿，其萌发率处于最低水平，当预培养10d时，胚尖不定芽诱导处于刚刚萌动阶段，当预培养15d左右时，胚尖不定芽诱导率处于较高启动状态(见图1)，当培养天数超过20d时，外植体胚尖会开始出现愈伤化的现象，因此优选15d为胚尖最佳预培养天数。
(3)不定芽诱导培养
根据前期研究表明，柠条组织培养中需要的外源细胞分裂素浓度比生长素要大，所以以相同终浓度的6-ba、kt进行预实验。结果发现，相同培养时间使用6-ba对外植体的伤害较小，胚尖接种于加kt的培养基，基部较早出现褐化坏死现象。由此可见，选择是6-ba为胚尖不定芽诱导激素进行研究。
因此，进一步将本步骤(2)获得预培养的胚尖转接在添加不同浓度处理6-ba(0、1、2、3、4、5、6mg/l)的msb5培养基中，每个处理3个重复，每个重复30个外植体，进行不定芽诱导培养的研究。培养25d后，不定芽发生(图2)，统计外植体诱导率(表1)，确定3mg/l为最适合胚尖不定芽诱导最佳6-ba浓度。
为了提高胚尖的再生频率，获得更多的再生植株，将上述已诱导出不定芽的胚尖进行继代培养，培养25d后，形成不定芽簇(图3)。其中，msb5培养基中添加蔗糖30g/l，肌醇0.1g/l，琼脂粉5.5g/l，调节培养基ph值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
结果表明：从表1可以看出，6-ba对胚尖不定芽诱导有促进作用。不添加6-ba时，诱导出不定芽外植体个数小于8个。当添加1～3mg/l6-ba时，不定芽诱导率随着6-ba浓度增加显著提高，当6-ba浓度为3mg/l时，胚尖不定芽发生时间最早且诱导率达到最高。当6-ba浓度高于3mg/l时，胚尖诱导率呈下降趋势，6-ba浓度为4、5mg/l时，胚尖颜色变成深绿色，胚尖生长受到抑制，其基部出现褐化现象，当6-ba浓度为6mg/l时，胚尖基部变黑出现严重褐化现象，胚尖死亡。因此，6-ba浓度为3mg/l时，最适合胚尖不定芽诱导。
表16-ba浓度对外植体诱导的影响
(4)不定芽伸长培养。
在不定芽诱导多次继代培养过程中发现，继代培养单独使用6-ba激素，诱导出的不定芽出现水渍化现象，叶片颜色为深绿色。在这个研究的基础上，在不定芽伸长过程中选用常见的生长素naa，为了获得更多健壮的再生植株，设置不同激素组合用于胚尖不定芽的伸长培养，将步骤(3)得到的不定芽簇，转入生长培养基上。不定芽伸长培养基以msb5为基本培养基，选取不同浓度的6-ba(0、0.5、0.7、1、2mg/l)与naa(0、0.05、0.07、0.1mg/l)两种常见植物激素进行不同浓度组合(表2)，研究不定芽的伸长。其中，msb5培养基中添加蔗糖30g/l，肌醇0.1g/l，琼脂粉5.5g/l，调节培养基ph值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
结果表明：添加激素对胚尖不定芽的伸长有明显的促进作用，不定芽在不添加激素的培养基上没有明显的变化，一周后出现不定芽变黄的现象，导致芽苗枯死。然而随着激素浓度配比的增加，不定芽伸长渐显困难，且基部愈伤化程度增高。当添加6-ba的最适浓度为1mg/l，naa为0.1mg/l，为不定芽伸长诱导培养的最佳激素组合配方，4～5周后可观察到芽明显伸长，图4所示，35d后统计不定芽的平均个数和伸长的平均长度，表2所示。将获得明显伸长的不定芽分割后进行继代培养，继代培养降低激素配比，添加6-ba的最适浓度为0.7mg/l，naa为0.07mg/l，培养10d后获得伸长芽苗(图5所示)。
表2不同激素组合对诱导不定芽伸长的影响
(5)生根培养
将步骤(4)获得伸长芽苗分成单株，截取一个伸长芽接种至含有一定浓度的naa、iba生根培养基上，进行生根诱导。结果发现，在iba生根培养基上，诱导出的根侧根较少，根较膨大，移栽成活率较低，如图2所示。所以，选用naa进行生根诱导。在为了确定基本培养基对芽苗的影响，预实验发现在1/2ms培养基上培养，其地上部分芽苗由于缺乏营养不生长，而再ms培养基上植株地上部分可以正常生长，所以选定ms为基本培养基。添加不同浓度naa(0.2、0.4、0.6、0.8mg/l)，如表3所示，进而确定不定芽诱导生根配方。其中培养基所含蔗糖的量为30g/l，所含琼脂粉的量为5.5g/l，调节培养基ph值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
结果表明：一定浓度的naa可以促进伸长不定芽生根，在一定的范围内提高naa的浓度可以在一定程度上提高不定芽生根率。1mg/lnaa为不定芽生根诱导培养的最佳激素。培养15d可观察到3cm左右的幼根，图6为不定芽根诱导45d的生长状态。
表3激素对诱导不定芽生根的影响
(6)炼苗移栽
将步骤(5)将已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护(图7)。1个月后统计成活率，成活率在95％以上。
1.一种柠条锦鸡儿离体再生方法，其包括如下步骤：
(1)无菌苗的制备：将消毒的柠条锦鸡儿种子接种至ms培养基中进行培养；
(2)不定芽诱导预培养：选取(1)中培养4-10d的无菌苗，切取胚尖接种至不定芽诱导预培养培养基上，所述不定芽诱导预培养培养基在基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤0.1-1mg/l和萘乙酸0.01-0.1mg/l，优选地ba添加量为0.4-0.6mg/l、naa为0.04-0.06mg/l，光下培养7-25d，优选为10-20d，最优选为14-16d；
(3)不定芽诱导培养：将第(2)步预培养后获得胚尖转接至不定芽诱导培养基进行培养，所述不定芽诱导培养基是在基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤1-6mg/l，优选地，ba添加量为3mg/l，培养时间为8-20d，优选为培养10-12d，植株不定芽诱导启动后；
(4)不定芽伸长培养：将第(3)步中诱导出带有基座的丛生芽，接种至不定芽伸长诱导培养基，所述不定芽伸长培养基是在基本培养基添加0.1-2mg/l6-ba与0.01-0.2mg/lnaa；优选地，6-ba添加量为0.8-1.2mg/l，naa添加量为0.05-0.1mg/l，培养20-35d，发现丛芽有明显生长的趋势。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基本培养基以ms培养基的大量元素、ms培养基的微量元素、b5培养的有机成分作为基本培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第(1)步骤的具体操作：挑选颗粒饱满、无虫眼、无黑色斑点的柠条种子，消毒接种至ms培养基中；优选地，所述消毒的方式具体为：先用洗洁精清洗3min，75％酒精棉花包裹擦拭种子，进入超净台后75％回收酒精过一下，再用75％酒精消毒2min，最后用10％次氯酸钠消毒20min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第(2)步骤具体操作：选取(1)中培养7d的无菌苗，用解剖刀切取2mm左右胚尖，接种至不定芽诱导预培养培养基上。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第(3)步中进行继代培养1或2次。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第(4)步继代培养2-4次，优选为3次，得到伸长的芽苗。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述步骤，即(5)生根培养：将第(4)步继代培养伸长的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导；优选地，所述生根培养基以ms培养基作为基本培养基，并添加萘乙酸(naa)0.1-1.5mg/l，优选为0.5-1mg/l，于光下培养时间为30-40d。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，第(1)至(5)中采用的培养基中添加蔗糖30g/l，肌醇0.1g/l，琼脂粉5.5g/l，调节培养基ph值为5.8；培养条件为20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照12h/d。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步还包括下述步骤，即(6)炼苗：将第(5)步获得的已生根再生苗，挑选长势健壮的瓶苗进行炼苗；所述炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步还包括下述步骤，即(7)移栽：将炼苗后的再生苗进行移栽，优选地移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护。
技术总结