本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及一种杨树远缘杂种双二倍体的培育方法。
背景技术：
远缘杂交是物种杂交的一种极端形式。通过远缘杂交，可以实现亲缘关系较远的物种间的种质渗透，综合利用远缘亲本的优良性状，从而获得较强的杂种优势，是植物遗传改良的重要手段。迄今，远缘杂交已经在水稻(oryza)、小麦(triticum)、玉米(zea)、油菜(brassica)、棉花(gossypium)等很多作物品种的育种中获得了显著成效。
然而，由于远缘杂种在减数分裂联会过程中缺乏同源染色体，导致染色体的不平衡分离，往往引起配子体的高度败育，严重影响了远缘杂种作为育种材料的再利用。在杨属中，以青杨派树种小叶杨(populussimonii)与胡杨派树种胡杨(p.euphratica)杂交获得的小胡杨便是一个派间远缘杂种，综合了双亲的优良性状，具有扦插易繁殖、耐盐碱和抗干旱能力强等特点，经济利用价值高。细胞学观察发现，小胡杨花粉多为空瘪花粉，存在高度败育性，导致该远缘杂种难以在后续的育种计划中加以利用并实现持续改良。
为克服远缘杂种配子体高度败育的问题，育种学家提出了一些措施，其中将远缘杂种通过体细胞染色体加倍诱导为双二倍体是最为可行的方案。双二倍体化不仅可以克服远缘杂交带来的杂种不育，而且利于增强基因组间的杂合性，增大基因组容量，扩大遗传变异范围，提高应对逆境胁迫的能力，从而获得更好的遗传性状，组培过程较为困难，而且即便通过茎段培养形成了不定芽，也是通过先形成愈伤组织的间接器官发生途径而产生的。迄今尚未有关于染色体加倍诱导杨树双二倍体的相关报道。同时，考虑到三倍体育种在杨树遗传改良中的重要性，一旦通过诱导获得远缘杂种小胡杨的双二倍体种质，恢复远缘杂种配子育性，与二倍体杂交后可产生具有三套远缘种质来源的染色体组，同时实现远缘优异种质与倍性优势的综合利用，育种前景巨大。因此，研发杨树远缘杂种双二倍体培育方法十分必要。
技术实现要素：
为了解决杨树远缘杂种高度败育，难以在育种计划中继续利用，同时又缺乏杨树双二倍体种质的问题。本发明的目的是提供一种杨树远缘杂种双二倍体的培育方法。
现有技术中，使用秋水仙碱进行多倍体诱导时，利用植物的脱分化再分化能力，对植物外植体先进行脱分化处理形成愈伤组织，对愈伤组织进行秋水仙碱处理后，愈伤组织再分化形成器官，进而形成多倍体植株。在对愈伤组织进行多倍体诱导时，由于愈伤组织细胞分裂阶段不一致，易产生嵌合体。
本发明提供一种不产生愈伤组织，直接由叶片外植体产生不定芽，对不定芽进行多倍体诱导产生双二倍体杨树的方法，
一种杨树远缘杂种双二倍体的培育方法包括：将叶片外植体接种不定芽诱导培养基进行预培养；使用秋水仙碱处理预培养后的不定芽进行多倍化；将秋水仙碱处理后的不定芽，重新接种到不定芽诱导培养基，产生双二倍体不定芽；所述不定芽诱导培养基中6-ba与kt的浓度比为(1-2)：(1-2)。
在本发明提供的不定芽诱变培养基中，所使用的植物生长调节剂均为细胞分裂素类植物生长调节剂6-ba(6-苄基氨基嘌呤)与kt(激动素)；本发明通过实践探究，首次发现在不定芽诱导培养基中，添加浓度比为(1-2)：(1-2)的6-ba、kt，可以使得叶片外植体不产生愈伤组织，通过直接器官发生途径产生不定芽。
具体地，在本发明提供的培育方法中，所述不定芽诱导培养基中含有如下组分：ms、0.3-0.6mg/l6-ba、0.3-0.6mg/lkt、蔗糖和琼脂，培养基ph为5.8-6.0；
优选地，所述不定芽诱导培养基中含有如下组分：ms、0.4mg/l6-ba、0.4mg/lkt、30g/l蔗糖和6g/l琼脂，培养基ph为5.8-6.0。
在本发明提供的培育方法中，所述预培养的培养时间为13-17天；优选地，在所述预培养的时间为15天。
在本发明提供的培育方法中，所述叶片外植体为无菌叶片从一侧横穿主脉进行剪切，长度为1.0-1.5cm的外植体。
在对由叶片外植体直接发育的不定芽进行秋水仙碱加倍时，考虑到不定芽的生长特性，使用添加0.01-0.02％秋水仙碱的ms液体培养基进行多倍化诱变。
在本发明提供的培育方法中，所述秋水仙碱处理为使用含有0.01-0.02％秋水仙碱的ms液体培养基在黑暗条件下浸泡48-72小时。
本发明提供的培育方法，还包括，采集秋水仙碱处理后的不定芽的叶片，使用流式细胞仪进行倍性检测，根据峰型判断倍性水平。
本发明提供的培育方法，还包括，将检测为双二倍体的不定芽接种到生根培养基上，诱导生根，获得双二倍体杨树再生植株。
在本发明提供的培育方法中，所述生根培养基含有如下组分：1/2ms、0.1-0.5mg/liba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂；培养基ph为5.8-6.0。
在本发明提供的培育方法中，所述杨树远缘杂种为经种间或派间杂交获得，且具有配子高度败育特征的杨树杂种材料。
具体地，本发明提供的培育方法，是以配子高度败育的杨树远缘杂种无菌叶片为材料，筛选适宜叶片不定芽直接器官发生的诱导培养基，使得叶片外植体不产生愈伤组织，通过直接器官发生途径产生不定芽，对不定芽施加秋水仙碱处理，诱导不定芽染色体加倍，并对秋水仙碱处理后的不定芽进行倍性检测，从而筛选出双二倍体种质的不定芽，经生根培养后获得完整的双二倍体植株。
本发明避免了嵌合体的形成，可实现杨树远缘杂种的育性恢复，保证其在杨树遗传改良计划中加以有性利用。
在本发明提供的培育方法中，选取生长健壮的苗龄为40d的小胡杨组培苗，取顶端向下数第3-6片真叶为外植体材料，从叶片的一侧横穿主脉进行剪切，剪成长度1.0-1.5cm的小段，接到含有蔗糖30g/l、琼脂6g/l、6-ba0.4mg/l、kt0.4mg/l、ph值为5.8-6.0的ms固体培养基中，近轴面接触培养基。组培室温度控制在25±1℃内，光照强度2000lx，光培养与暗培养周期为16h/8h。
预培养15天后，转入含有0.01-0.02％的秋水仙碱ms液体培养基在黑暗条件下浸泡48-72h，无菌水冲洗4-6遍，用滤纸吸干表面，再重新接种到上述不定芽诱导培养基中培养。
从加倍处理后的不定芽上采集2-3片幼叶进行混合，使用流式细胞仪进行倍性分析，以未处理的小胡杨幼叶为对照，根据流式细胞分析的峰型判断整个不定芽的倍性水平，不存在倍性嵌合体。
将检测后为双二倍体的不定芽接种到1/2ms 0.3mg/liba 30g/l蔗糖 6g/l琼脂(ph5.8-6.0)的固体培养基中，置于温度为25±1℃，光照强度2000lx，光培养与暗培养周期为16h/8h的组培室内进行培养生根。采用本发明提供的方法，双二倍体最高诱导率达到16.7％。
本发明还要求保护一种杨树不定芽诱导培养基，所述不定芽诱导培养基中6-ba与kt的浓度比为(1-2)：(1-2)；
优选地，所述培养基含有以下组分：ms、0.3-0.6mg/l6-ba、0.3-0.6mg/lkt、蔗糖和琼脂；培养基ph为5.8-6.0；
更优选地，所述培养基含有以下组分：ms、0.4mg/l6-ba、0.4mg/lkt、30g/l蔗糖和6g/l琼脂；培养基ph为5.8-6.0。
本发明的有益效果至少在于，
(1)本发明首次实现了具有配子高度败育特征的杨树远缘杂种的双二倍体种质创制；
(2)本发明提供的培育方法，在不定芽诱导培养基中添加两种细胞分裂素类生长激素(6-ba、kt)，使得叶片外植体不产生愈伤组织，直接获得不定芽，避免受到愈伤组织等多细胞影响而形成倍性嵌合体的可能，获得的双二倍体种质利用价值更高；
(3)采用本发明提供的培育方法得到的杨树双二倍体材料可极大地改善远缘杂种配子高度败育的问题，恢复其配子育性，从而在杨树多倍体遗传改良计划中加以有性利用，将远缘亲本间的优良特性进行有效聚合，实现多目标性状遗传改良。
附图说明
图1为本发明实施例1中小胡杨二倍体的流式细胞术检测图。
图2为本发明实施例1中小胡杨双二倍体的流式细胞术检测图。
图3为本发明实施例1中小胡杨双二倍体根尖染色体数结果图。
图4为本发明实施例1中小胡杨双二倍体组培再生植株图。
图5为本发明实施例2中小胡杨叶片不定芽直接器官发生体视观察图。
图6为本发明对比例1中小胡杨叶片不定芽诱导结果图。
图7为本发明对比例2中小胡杨叶片不定芽诱导结果图。
图8为本发明对比例3中小胡杨叶片不定芽诱导结果图。
图9为本发明对比例4中小胡杨叶片不定芽诱导结果图。
图10为本发明对比例5中小胡杨叶片不定芽诱导结果图。
图11为本发明对比例6中小胡杨叶片不定芽诱导结果图。
图12为本发明对比例7中小胡杨叶片不定芽诱导结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂、植株均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供杨树远缘杂交双二倍体的培育方法，具体步骤如下：
(1)本实施例的试验材料选择小叶杨和胡杨派间远缘杂交选育的小胡杨雄株无性系的无菌组培苗。
在小胡杨组培苗培养30天后，取顶端向下数第3-6片真叶为外植体材料，接种到最佳叶片不定芽再生培养基中，即ms 0.4mg/l6-ba 0.4mg/lkt 30g/l蔗糖 6g/l琼脂(ph5.8-6.0)，预培养15天；
转入含有0.01％、0.02％、0.03％的秋水仙碱ms液体培养基在黑暗条件下浸泡24h、48h、72h，然后用无菌水冲洗4-6遍，用滤纸吸干表面的水，再重新接种到叶片不定芽再生培养基中培养。每个处理重复3次，每个重复包括13个叶片外植体。50天后统计存活率，然后将再生出的不定芽转入小胡杨生根培养基中，待其长成完整植株后进行倍性鉴定，统计双二倍体数量，计算双二倍体诱导率。存活率＝(存活的叶片数/接种的叶片数)×100％，双二倍体诱导率＝(双二倍体植株数/成活的植株总数)×100％。
(2)对培育得到的不定芽植株进行倍性水平检测，具体步骤如下：
对经秋水仙碱处理诱导叶片不定芽染色体加倍后形成的不定芽植株进行倍性鉴定，不定芽上采集2-3片幼叶进行混合，使用流式细胞仪进行倍性分析，以未处理的小胡杨幼叶为对照(图1)，根据流式细胞分析的峰型判断整个不定芽的倍性水平。对于流式细胞分析确定为双二倍体的材料，再用根尖体细胞染色体计数法进行确认。
图2为小胡杨双二倍体的流式细胞术检测图，证明其是双二倍体，不是倍性嵌合体，图3为小胡杨双二倍体根尖染色体数结果图，图4为本实施例中小胡杨双二倍体组培再生植株。
研究发现，叶片预培养15d后，以0.01-0.02％秋水仙碱处理叶片48-72h可有效诱导小胡杨体细胞染色体加倍。研究共诱导获得小胡杨双二倍体4株，不存在倍性嵌合体，结果见表1，最高诱导率为16.7％。
表1不同浓度秋水仙碱诱导小胡杨叶片体细胞染色体加倍情况
实施例2叶片不定芽诱导培养基的筛选
本实施例进行试验筛选小胡杨叶片不定芽再生培养基。具体步骤如下：
选取生长健壮的苗龄为40d的小胡杨组培苗，取顶端向下数第3-6片真叶为外植体材料，从叶片的一侧横穿主脉进行剪切，剪成长度1.0-1.5cm的小段，接到含有蔗糖30g/l、琼脂6g/l、ph值为5.8-6.0的ms固体培养基中，并在培养基中添加6-ba(0.3，0.4，0.5，0.6mg/l)和kt(0.3，0.4，0.5，0.6mg/l)，近轴面接触培养基。组培室温度控制在25±1℃内，光照强度2000lx，光培养与暗培养周期为16h/8h。每个试验重复3次，每个重复包含15个外植体。
研究发现，小胡杨叶片外植体在不同培养基上的不定芽再生情况存在明显差异(表2)。综合叶片分化率和单个外植体再生不定芽的数量，筛选出ms 0.4mg/l6-ba 0.4mg/lkt 30g/l蔗糖 6g/l琼脂(ph5.8-6.0)，可作为小胡杨叶片不定芽诱导的最佳培养基。
利用体视显微镜每隔5d观察小胡杨叶片不定芽再生情况，发现外植体接种5d后叶片切口处尚无可见的变化；外植体接种10d后叶片切口处变厚，未观察到愈伤组织形成；接种20d后叶片切口处可观察到小芽点的形成，未观察到愈伤组织的存在(图5)；此后芽点继续发育，叶片接种40d后，不定芽形态清晰，且不定芽直接与叶片外植体连接，未观察到愈伤组织的存在；随着培养时间的延长，形成的不定芽会逐渐伸长，50d可长至1cm左右。可见，在上述叶片不定芽诱导培养条件下，小胡杨叶片不定芽的形成属于直接器官发生。
表26-ba和kt处理对小胡杨叶片分化率及不定芽数量的影响
实施例3生根培养基的筛选
对小胡杨生根培养基中的iba浓度进行筛选。将不定芽接入分别添加0、0.1、0.3、0.5mg/liba的生根培养基中进行培养，基本培养基为1/2ms培养基，添加蔗糖30g/l、琼脂6g/l，调节ph值为5.8-6.0，培养条件如前所述。每个处理重复3次，每个重复包括10个带芽茎段。
研究发现，小胡杨不定芽在未添加iba的1/2ms培养基上未生根，并且随着接种时间的延长，叶片逐渐变黄，最终脱落。no.4处理小胡杨生根率达到100％，并且随着iba浓度的降低生根率逐渐降低，但no.2-4的3组处理间生根率差异不显著(p＝0.5278，表3)，说明3种浓度iba都能较好地诱导小胡杨生根。综合考虑生根率、根长、根数量以及组培苗生长情况这些因素，同时从降低成本的角度出发，确定最佳生根培养基为1/2ms 0.3mg/liba 30g/l蔗糖 6g/l琼脂(ph5.8-6.0)。
表3不同iba浓度下小胡杨生根及生长情况比较
对比例1
本对比例采用ms基本培养基结合不同浓度6-ba和naa组合来进行小胡杨叶片不定芽诱导，然而培养30d后仅部分叶片外植体伤口处形成了愈伤组织(表4)，均未形成不定芽(图6)，故不适于进行双二倍体诱导研究。
表46-ba和naa组合对小胡杨叶片愈伤组织诱导情况
对比例2
本对比例采用ms 0.4mg/l6-ba 30g/l蔗糖 6g/l琼脂，作为培养基，进行小胡杨叶片不定芽诱导，培养20d后，叶片外植体伤口处均未形成不定芽(图7)，部分形成了愈伤组织，故不适于进行双二倍体诱导研究。
对比例3
本对比例采用ms 0.8mg/l6-ba 30g/l蔗糖 6g/l琼脂，作为培养基，进行小胡杨叶片不定芽诱导，培养20d后，叶片外植体伤口处均未形成不定芽(图8)，部分形成了愈伤组织，故不适于进行双二倍体诱导研究。
对比例4
本对比例采用ms 0.4mg/lkt 30g/l蔗糖 6g/l琼脂，作为培养基，进行小胡杨叶片不定芽诱导，培养20d后，叶片外植体伤口处均未形成不定芽(图9)，部分形成了愈伤组织，故不适于进行双二倍体诱导研究。
对比例5
本对比例采用ms 0.8mg/lkt 30g/l蔗糖 6g/l琼脂，作为培养基，进行小胡杨叶片不定芽诱导，培养20d后，叶片外植体伤口处均未形成不定芽(图10)，部分形成了愈伤组织，故不适于进行双二倍体诱导研究。
对比例6
本对比例采用ms 0.4mg/lkt 0.4mg/lzt 30g/l蔗糖 6g/l琼脂，作为培养基，进行小胡杨叶片不定芽诱导，培养20d后，叶片外植体伤口处均形成了愈伤组织，均未形成不定芽(图11)，故不适于进行双二倍体诱导研究。
对比例7
本对比例采用ms 0.4mg/l6-ba 0.4mg/lzt 30g/l蔗糖 6g/l琼脂，作为培养基，进行小胡杨叶片不定芽诱导，培养20d后，叶片外植体伤口处均未形成不定芽(图12)，部分形成了愈伤组织，故不适于进行双二倍体诱导研究。
对对比例2-7的培养基诱导产生愈伤组织的诱导结果进行多重比较，结果见表5。
表5xhu-dk叶片愈伤组织诱导率的多重比较
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
1.一种杨树远缘杂种双二倍体的培育方法，其特征在于，包括：将叶片外植体接种到不定芽诱导培养基进行预培养；所述预培养中叶片外植体不产生愈伤组织，经不定芽直接器官发生，产生不定芽；
使用秋水仙碱对预培养后的不定芽进行多倍化；将秋水仙碱处理后的不定芽，重新接种到不定芽诱导培养基，产生双二倍体不定芽；
所述不定芽诱导培养基中6-ba与kt的浓度比为(1-2)：(1-2)。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基中含有如下组分：ms、0.3-0.6mg/l6-ba、0.3-0.6mg/lkt、蔗糖和琼脂，培养基ph为5.8-6.0；
优选地，所述不定芽诱导培养基中含有如下组分：ms、0.4mg/l6-ba、0.4mg/lkt、30g/l蔗糖和6g/l琼脂。
3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述预培养培养时间为13-17天；
优选地，所述预培养的时间为15天。
4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述叶片外植体为无菌叶片从一侧横穿主脉进行剪切，长度为1.0-1.5cm的外植体。
5.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述秋水仙碱处理为使用含有0.01-0.02％秋水仙碱的ms液体培养基在黑暗条件下浸泡48-72小时。
6.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，还包括，采集秋水仙碱处理后的不定芽的叶片，使用流式细胞仪进行倍性检测，根据峰型判断倍性水平。
7.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，还包括，将倍性检测为双二倍体的不定芽接种到生根培养基上，诱导生根，获得双二倍体杨树再生植株。
8.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，所述生根培养基含有如下组分：1/2ms、0.1-0.5mg/liba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂；培养基ph为5.8-6.0。
9.根据权利要求1-8任一项所述的培育方法，其特征在于，所述杨树远缘杂种为经种间或派间杂交获得，且具有配子高度败育特征的杨树杂种材料。
10.一种杨树不定芽诱导培养基，其特征在于，所述不定芽诱导培养基中6-ba与kt的浓度比为(1-2)：(1-2)；
优选地，所述培养基含有以下组分：ms、0.3-0.6mg/l6-ba、0.3-0.6mg/lkt、蔗糖和琼脂，培养基ph为5.8-6.0；
更优选地，所述培养基含有以下组分：ms、0.4mg/l6-ba、0.4mg/lkt、30g/l蔗糖和6g/l琼脂，培养基ph为5.8-6.0。
技术总结