本发明属于植物培养技术领域，具体涉及百香果的培养。
背景技术：
百香果，学名：西番莲(passifloraedulis)，又名“鸡蛋果”、为西番莲科(passifloraceae)中最大且最重要的西番莲属(passifloral.)热带多年生常绿攀缘木质藤本植物。我国栽培百香果具有悠久历史，在唐代、清代作为观赏植物，称玉蕊花。百香果花果俱美，适于观赏，以其枝繁叶茂、花色奇特、挂果期长等而成为庭院绿化新宠；果实为浆果，甜酸可口，集菠萝、荔枝、香蕉、草莓、杨桃等数种水果香味于一体，是世界上已知的最芳香的水果之一，其风味浓郁，芳香怡人。据测定，百香果果实含有超过132种以上的芳香物质，百香果被称为“果汁之王”，加工成果汁的方法简单，但风味独特。百香果香味的特殊性、其富含的营养成分及潜在的抗焦虑等药用价值，使其获得了人们的广泛认可。
百香果种植行业存在的主要问题就是种苗的培育，传统百香果育苗为扦插和嫁接两种，但这两种传统育苗方法种苗繁育效率低，且常常会出现植株感染病毒，经多年无性繁育后，植株体内大量积累病毒，尤其是花叶病毒及木质化病毒，会导致品种退化、质量下降和产量锐减，对整个百香果产业造成严重的影响。因此，对百香果进行组培脱毒，是提升百香果产业的一个重要技术方向。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了百香果组织培养基及其在脱毒百香果组培苗快速繁育中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种百香果组织培养基，包括诱导培养基、继代培养基和生根培养基；
所述诱导培养基以改良的rms培养基为基础，还包括：6-ba(6-苄氨基嘌呤)0.8～1.2mg/l、naa(萘乙酸)0.15～0.25mg/l、间苯三酚4.5～5.5mg/l、蔗糖28～32g/l、以及琼脂5.5～6.5g/l，ph5.7～5.9；
所述继代培养基以改良的rms培养基为基础，还包括：naa0.4～0.6mg/l、ga3(赤霉素)0.8～1.2mg/l、间苯三酚4.5～5.5mg/l、蔗糖38～42g/l、以及琼脂5.5～6.5g/l，ph5.7～5.9；
所述生根培养基以1/2改良的rms培养基(所述1/2改良的rms培养基中各组分的浓度均为改良的rms培养基中各组分的浓度的一半)为基础，还包括：iba(吲哚丁酸)0.4～0.6mg/l、naa0.4～0.6mg/l、蔗糖18～22g/l、活性炭0.8～1.2g/l、以及琼脂5.5～6.5g/l，ph5.7～5.9；
其中，所述改良的rms培养基是将ms培养基中的kno3、nh4no3、kh2po4、mgso4、cacl2、ca(no3)2的浓度调整为kno31940～1960mg/l、nh4no3820～830mg/l、kh2po4365～375mg/l、mgso4365～375mg/l、cacl2215～225mg/l、ca(no3)2215～225mg/l而得。
具体地，本发明所述的改良的rms培养基包括：
大量元素：kno31940～1960mg/l、nh4no3820～830mg/l、kh2po4365～375mg/l、mgso4365～375mg/l、cacl2215～225mg/l、ca(no3)2215～225mg/l；
微量元素：ki0.80～0.85mg/l、h3bo36.1～6.3mg/l、mnso4·4h2o22.2～22.4mg/l、znso4·7h2o8.5～8.7mg/l、na2moo4·2h2o0.2～0.3mg/l、cuso4·5h2o0.02～0.03mg/l、cocl2·6h2o0.02～0.03mg/l；
铁盐：feso4·7h2o27.5～28.0mg/l、na2-edta·2h2o37.0～37.5mg/l；
有机成分：肌醇98～102mg/l、烟酸0.4～0.6mg/l、盐酸吡哆醇0.4～0.6mg/l、盐酸硫胺素0.4～0.6mg/l、甘氨酸1.8～2.2mg/l。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种上述的百香果组织培养基在脱毒百香果组培苗繁育中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种利用上述的百香果组织培养基进行脱毒百香果组培苗繁育的方法，包括：
1)组培材料取材和消毒：剪取无病结果期百香果植株藤蔓顶端14～16cm的枝条，去掉枝条叶片，留0.8～1.2cm的叶柄，洗净、消毒、滤干水分；
2)组培材料组培：无菌条件下，将消毒好的枝条切成1.5～2.0cm长、带1～2个茎节的茎段，接入所述诱导培养基中(为避免交叉感染，每瓶只接一个茎段)，培养28～32天后，采用微扦插的方式进行繁殖；转入所述继代培养基中继代培养28～32天，取高度2.5cm以上、具2个节及以上的小苗移入所述生根培养基中生根培养28～32天；培养条件为温度26～28℃，光照强度为1800～2100lx；
3)组培苗移植：将具有2条根以上、3～4cm高、带3～4片叶、生长健壮的生根苗，洗净去除基部培养基，用内吸性的杀菌剂浸泡后，在温室大棚中移栽到基质中；
4)组培苗移栽后的管理：移栽后，基质保持湿润，空气相对湿度为75～85％，忌强光直射，温度为5～28℃；培养获得可用于大田定植的百香果种苗。
进一步地，所述步骤1)中，选取防虫网大棚内种植的无病结果期百香果植株，于晴天的午后剪取藤蔓顶端的枝条，以减少组培材料带菌。
进一步地，所述步骤1)中，消毒的方法为：将洗净后的枝条放入含有280～320mg/l利福平和4～6mg/l硝酸银的溶液振荡，再用68～72％的酒精浸泡，0.08～0.12％的升汞消毒，最后用无菌水冲洗；随后再用无菌滤纸滤干残余的水分。采用这种消毒方法能够取得良好的除菌效果。
进一步地，所述步骤2)中，继代培养的增殖系数至少达到3.2倍/月，以降低变异率及减少玻璃化苗的形成。
进一步地，所述步骤3)中，所述生根苗先在炼苗大棚炼苗8～12天后再进行移栽。炼苗的目的主要是让百香果逐渐适应外界环境，从而提高移栽成活率。
进一步地，所述步骤3)中，所述内吸性的杀菌剂为28～32％恶霉灵1000倍液(即28～32％恶霉灵稀释1000倍)。
进一步地，所述步骤3)中，所述基质包括体积比为8～12:1～3的进口草炭和珍珠岩。这种基质具有良好透气性和保水性。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±20％范围内。
本发明中，％在表示浓度时，除有特别说明外，溶质为液体时％代表体积百分比，溶质为固体时％代表g/100ml。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1、本发明所选用的百香果组培材料种植于具防虫网的大棚内，所用枝条为结果的百香果藤蔓顶端，剪取枝条的时间为晴天的午后，这样可减少组培材料所带的病菌。
2、在组培过程中，用300mg/l的利福平 5mg/l的硝酸银溶液对枝条进行预处理。利福平对革兰氏阳性和阴性细菌以及结核杆菌有明显的抗菌作用，加入一定量的利福平对百香果表面的细菌及其孢子的去除有一定的作用；并且硝酸银中的银离子也有一定的杀菌功效。
3、本发明在研究过程中，通过多次对基本培养基进行调整，最终采用改良rms作为基本培养基。改良rms更适合百香果的生长，并且采用改良rms培养基，组培苗长势良好。
4、在继代过程中，加入适当浓度的间苯三酚，可有效抑制玻璃化苗的产生。
5、在百香果组培苗生产体系建立过程中，采用微扦插的方法进行快繁，每经历一个培养周期，枝条的数目都以对数方式增加，并且因为茎尖细胞都是二倍体，在培养的条件下不易发生基因型的变化。因此，采用此方法，既可在短时间内(当年10月到次年4月中旬)生产出一定量的百香果组培苗，满足市场的需要。而且，在整个组培过程中，都未加入分裂素，又可降低种苗的变异率。
5、在百香果移栽时，基质良好透气性和保水性是移栽成活率的关键。同时，在移栽后的管理过程中，要适当控制水分，加强光照，加强棚内通风条件，以降低组培苗在基质中出现烂苗及猝倒的几率。百香果组培苗获得较高的移栽成活率，不仅是建立其生产体系的重要环节，同时为百香果种苗的进一步商业化生产奠定良好的基础。
附图说明
图1为百香果微扦插及茎芽增殖方式示例图。
图2为本发明实施例中百香果培育过程的照片，其中(a)为芽诱导照片，(b)为增殖照片，(c)为生根照片，(d)为移栽照片。
图3为采用常规诱导培养基(以ms培养基为基础)增殖的百香果苗，可见茎短、基部胀大、叶片发黄、有点畸形。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：百香果组织培养基的制备过程
本实施例的一种百香果组织培养基，由诱导培养基、继代培养基、生根培养基组成，分别在不同的组织培养阶段使用。其中：
诱导培养基配方组成：改良的rms培养基 6-ba1.0mg/l naa0.2mg/l 间苯三酚5.0mg/l 蔗糖30g/l 琼脂6.0g/l，ph＝5.8。
继代培养基配方组成：改良的rms培养基 naa0.5mg/l ga31.0mg/l 间苯三酚5.0mg/l 蔗糖40g/l 琼脂6.0g/l，ph＝5.8。
生根培养基配方组成：1/2改良的rms培养基 iba0.5mg/l naa0.5mg/l 蔗糖20g/l 活性炭1.0g/l 琼脂6.0g/l，ph＝5.8。
其中，改良的rms培养基是对ms培养基中的大量元素进行改良，而其他元素保持不变。改良后的大量元素的量如下：kno31950mg/l、nh4no3825mg/l、kh2po4370mg/l、mgso4370mg/l、cacl2220mg/l、ca(no3)2220mg/l。
具体的，本实施例采用的改良的rms培养基的配方如下：
大量元素：kno31950mg/l、nh4no3825mg/l、kh2po4370mg/l、mgso4370mg/l、cacl2220mg/l、ca(no3)2220mg/l。
微量元素：ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l；
铁盐：feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta·2h2o37.3mg/l；
有机成分：肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l。
实施例2：利用百香果组织培养基进行脱毒百香果组培苗快速繁育的方法
(1)组培材料取材和消毒：选取防虫网大棚内种植的无病结果期百香果植株，于晴天的午后(以减少组培材料带菌)剪取藤蔓顶端大约15cm枝条。去掉枝条叶片，仅留1cm左右的叶柄，自来水冲洗干净后，用软毛刷把材料由上而下将其刷干净。然后在超净工作台上，将枝条放入300mg/l的利福平 5mg/l的硝酸银溶液振荡20min左右，再用70％的酒精浸泡30s，0.1％的升汞(加2～3滴吐温-80，1滴约为0.05ml)消毒10min，最后用无菌水冲洗4～5遍，冲洗掉残余的消毒液，再用无菌滤纸滤干残余的水分。
(2)组培材料组培：无菌条件下，将消毒好的枝条切成1.5～2.0cm长、带1～2个茎节的茎段，茎段接入实施例1的诱导培养基中(为避免交叉感染，每瓶只接一个茎段)，培养30天后，采用微扦插的方式进行繁殖。(见附图1)转入实施例1的继代培养基中继代培养30天(增殖系数达到3.2倍/月，降低变异率及减少玻璃化苗的形成)，取高度2.5cm以上，具2个节及以上的小苗移入实施例1的生根培养基中生根培养30天。培养条件为温度26～28℃，光照强度为2000lx。
(3)组培苗移植：于次年3月进行。将具有2条根以上、3～4cm高、带3～4片叶、生长健壮的生根苗，在炼苗大棚炼苗10天后(炼苗的目的主要是让百香果逐渐适应外界环境，从而提高移栽成活率)，将炼好后的生根苗取出，用水冲洗根部残留的培养基(根部若有愈伤组织，应将愈伤组织去掉)，在离鳞茎2.0cm左右将叶片切除，用内吸性的杀菌剂30％恶霉灵1000倍液浸泡1分后，在温室大棚中，移栽到基质为进口草炭：珍珠岩＝10:2(体积比)的基质中。
(4)组培苗移栽后的管理
(4.1)水分管理
百香果喜湿润环境。基质始终要保持湿润，不能等到基质完全干透再浇。一般在基质表层稍干白而中下部湿润时浇水，浇水一定要浇透。“见干见湿”的原则，不适合用于百香果的种植管理。大棚内空气相对湿度控制在75～85％。若是达不到，可向植株叶面喷水雾，并向植株周围地面上洒水，以保持空气湿润。不然叶片容易萎蔫。并且百香果浇水要尽量在上午浇水，最好不要下午浇水，否则晚上的时候，大棚内湿度大，容易导致疫病的发生。
(4.2)光照管理
百香果较耐荫，忌强光直射。因为如果光照过强叶色会偏黄，易“焦尖”。养护过程中苗的摆放不要太密，如果摆放太密，下面的叶片不能接受充分的光照，湿度又大，下部的叶片“易黄”或“焦叶”。
(4.3)温度管理
百香果属喜温暖性植物，20～28℃为生长适宜。越冬温度不低于5℃，在漳州，冬天应采取保温设施，冬季下午在温度下降到16℃时要及时封棚。夏天应加强遮荫和通风，补充叶面水和地面水达到降温的目的。
通过培养即可获得生长健壮无病虫的百香果苗用于大田定植。
实施例3：不同诱导培养基配方效果对比
(1)常规诱导培养基配方(以常规的ms培养基为基础)：
大量元素：kno31900mg/l、nh4no31650mg/l、kh2po4170mg/l、mgso4370mg/l、cacl2·2h2o440mg/l。
微量元素：ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l；
铁盐：feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta·2h2o37.3mg/l；
有机成分：肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l；
其他物质：6-ba1.0mg/l、naa0.2mg/l、间苯三酚5.0mg/l、蔗糖30g/l、以及琼脂6.0g/l；
ph为5.8。
(2)改良的诱导培养基配方(以本发明的改良的rms培养基为基础)：
大量元素：kno31950mg/l、nh4no3825mg/l、kh2po4370mg/l、mgso4370mg/l、cacl2220mg/l、ca(no3)2220mg/l；
微量元素：ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l；
铁盐：feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta·2h2o37.3mg/l；
有机成分：肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l；
其他物质：6-ba1.0mg/l、naa0.2mg/l、间苯三酚5.0mg/l、蔗糖30g/l、以及琼脂6.0g/l
ph为5.8。
将消毒好的百香果枝条接入常规诱导培养基(以常规的ms培养基为基础)及改良诱导培养基(以改良的rms培养基为基础)中。每次均接入100个芽，试验重复3次。从结果(表1)看，相对于ms培养基，改良rms培养基对出芽率及芽生长势均有显著影响。
表1试验结果
注：列表中方差分析结果用字母表示，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
实施例4：接种方式对继代培养过程中继代苗生长影响
在百香果继代试验过程中，在以ms培养基为基础的继代培养基中采用常规丛生芽分小丛的方式进行繁殖，在以改良rms培养基为基础的本发明的继代培养基中采用促进腋芽生枝和单节茎段微扦插的方式进行繁殖。从表2结果可看出，由于两种方式在试验过程中均未添加分裂素，因此采用促进腋芽生枝和单节茎段微扦插的方式的增殖倍数明显高于常规丛生芽分小丛的方式。并且采用促进腋芽生枝和单节茎段微扦插的方式苗的长势明显优于常规丛生芽分小丛的方式。
表2试验结果
注：列表中方差分析结果用字母表示，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
1.一种百香果组织培养基，其特征在于：包括诱导培养基、继代培养基和生根培养基；
所述诱导培养基以改良的rms培养基为基础，还包括：6-ba0.8～1.2mg/l、naa0.15～0.25mg/l、间苯三酚4.5～5.5mg/l、蔗糖28～32g/l、以及琼脂5.5～6.5g/l，ph为5.7～5.9；
所述继代培养基以改良的rms培养基为基础，还包括：naa0.4～0.6mg/l、ga30.8～1.2mg/l、间苯三酚4.5～5.5mg/l、蔗糖38～42g/l、以及琼脂5.5～6.5g/l，ph为5.7～5.9；
所述生根培养基以1/2改良的rms培养基为基础，还包括：iba0.4～0.6mg/l、naa0.4～0.6mg/l、蔗糖18～22g/l、活性炭0.8～1.2g/l、以及琼脂5.5～6.5g/l，ph为5.7～5.9；
其中，所述改良的rms培养基是将ms培养基中的kno3、nh4no3、kh2po4、mgso4、cacl2、ca(no3)2的浓度调整为kno31940～1960mg/l、nh4no3820～830mg/l、kh2po4365～375mg/l、mgso4365～375mg/l、cacl2215～225mg/l、ca(no3)2215～225mg/l而得。
2.根据权利要求1所述的百香果组织培养基，其特征在于：所述改良的rms培养基包括：
大量元素：kno31940～1960mg/l、nh4no3820～830mg/l、kh2po4365～375mg/l、mgso4365～375mg/l、cacl2215～225mg/l、ca(no3)2215～225mg/l；
微量元素：ki0.80～0.85mg/l、h3bo36.1～6.3mg/l、mnso4·4h2o22.2～22.4mg/l、znso4·7h2o8.5～8.7mg/l、na2moo4·2h2o0.2～0.3mg/l、cuso4·5h2o0.02～0.03mg/l、cocl2·6h2o0.02～0.03mg/l；
铁盐：feso4·7h2o27.5～28.0mg/l、na2-edta·2h2o37.0～37.5mg/l；
有机成分：肌醇98～102mg/l、烟酸0.4～0.6mg/l、盐酸吡哆醇0.4～0.6mg/l、盐酸硫胺素0.4～0.6mg/l、甘氨酸1.8～2.2mg/l。
3.一种权利要求1或2所述的百香果组织培养基在脱毒百香果组培苗繁育中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述的百香果组织培养基在脱毒百香果组培苗繁育中的应用方法，其特征在于：包括：
1)组培材料取材和消毒：剪取无病结果期百香果植株藤蔓顶端14～16cm的枝条，去掉枝条叶片，留0.8～1.2cm的叶柄，洗净、消毒、滤干水分；
2)组培材料组培：无菌条件下，将消毒好的枝条切成1.5～2.0cm长、带1～2个茎节的茎段，接入所述诱导培养基中，培养28～32天后，采用微扦插的方式进行繁殖；转入所述继代培养基中继代培养28～32天，取高度2.5cm以上、具2个节及以上的小苗移入所述生根培养基中生根培养28～32天；培养条件为温度26～28℃，光照强度为1800～2100lx；
3)组培苗移植：将具有2条根以上、3～4cm高、带3～4片叶、生长健壮的生根苗，洗净基部培养基，用内吸性的杀菌剂浸泡后，在温室大棚中移栽到基质中；
4)组培苗移栽后的管理：移栽后，基质保持湿润，空气相对湿度为75～85％，忌强光直射，温度为5～28℃；培养获得可用于大田定植的百香果种苗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，选取防虫网大棚内种植的无病结果期百香果植株，于晴天的午后剪取藤蔓顶端的枝条。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，消毒的方法为：将洗净后的枝条放入含有280～320mg/l利福平和4～6mg/l硝酸银的溶液中振荡，再用68～72％的酒精浸泡，0.08～0.12％的升汞消毒，最后用无菌水冲洗；随后再用无菌滤纸滤干残余的水分。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，继代培养的增殖系数至少达到3.2倍/月。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述生根苗先在炼苗大棚炼苗8～12天后再进行移栽。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述内吸性的杀菌剂为28～32％恶霉灵1000倍液。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述基质包括体积比为8～12:1～3的进口草炭和珍珠岩。
技术总结