本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法。
背景技术：
目前检测1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-ag）的方法有全酶法，反相色谱法，液质联用分析法（lc/ms)，酶联免疫法（elisa)等。公开号为cn108918447a的发明专利，涉及了一种基于qcm的检测1,5-ag的传感器及检测方法，但该方法对石英晶振片的处理过程复杂。公开号为cn110702676a的发明专利，涉及了一种1,5-ag的检测试剂盒及方法，通过选择适宜的方法和稳定剂使试剂r1和试剂r2在高葡萄糖浓度的干扰下保持稳定，通过吡喃糖氧化酶法测定人体血清样本中的1,5-ag含量；但该方法操作复杂，成本较高。因此，需要开发一种简便、快速检测1,5-ag的方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-血红素/纳米铂（rgo-cmcs-hemin/ptnps）的纳米复合材料构建电化学传感器，实现1,5-ag检测的方法。
为了解决该技术问题，利用一步还原法制备rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料，采用层层自组装方式将rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料和1,5-ag在吡喃糖氧化酶（prod）固定在修饰纳米金的丝网印刷电极表面，构建了基于rgo-cmcs-hemin/ptnps的电化学生物传感器。1,5-ag在prod的催化作用下，生成1,5-脱水果糖和过氧化氢(h2o2)，h2o2再次被rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料催化分解为h2o和o2，产生明显的电流响应信号，采用电化学工作站的差分脉冲伏安法（dpv）记录该峰电流，然后根据1,5-ag浓度和传感器的响应电流关系绘制出工作曲线，实现对1,5-ag的电化学检测。
本发明按以下步骤进行：
步骤1：rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料的制备
（1）还原性氧化石墨烯（rgo）的制备
称取单层氧化石墨烯（go）置于蒸馏水中混匀，加入抗坏血酸（aa）进行还原，得还原性氧化石墨烯（rgo）。
（2）rgo-cmcs的制备
在rgo溶液中加入羧甲基壳聚糖溶液，超声混匀，得rgo-cmcs分散液。
（3）rgo-cmcs-hemin的制备
在rgo-cmcs分散液加入氯化血红素，搅拌混匀，得到还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-血红素（rgo-cmcs-hemin）溶液。
（4）rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料制备
在rgo-cmcs-hemin分散液中加入氯铂酸钠和抗坏血酸，搅拌并离心洗涤，即得到rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料。
步骤2：电化学传感界面的构建
(1)将丝网印刷电极（spce）置于稀硫酸溶液中活化。
(2)将活化后的spce置入氯金酸溶液中，进行恒电位沉积，得到aunps/spce。
(3)在aunps/spce电极上滴加rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料悬浊液孵育，洗涤晾干，得到rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce。
(4)取prod滴加在rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce上，孵育洗涤，得到prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce传感界面，晾干备用。
步骤3：1,5-ag工作曲线的绘制
(1)将标准1,5-ag溶液滴加到步骤2得到的prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce传感界面，孵育洗涤，得到工作电极，晾干备用。
(2)将工作电极放入pbs溶液中，采用差分脉冲伏安法（dpv）进行扫描，记录传感器的响应电流值。
(3)分别对不同浓度的1,5-ag进行检测，记录峰电流，根据峰电流和1,5-ag浓度的关系绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限。
步骤4：实际血清样本中1,5-ag的检测
(1)将正常人血清样本以1:1的比例与1,5-ag标准溶液充分混合，制成混合液，在步骤2制备的传感界面滴加待测混合液，孵育洗涤，得到工作电极，晾干备用。
(2)将工作电极放入pbs溶液中，采用差分脉冲伏安法（dpv）进行扫描，记录传感器的响应电流值。
(3)根据步骤3所得到的工作曲线，计算待测实际血清样本中1,5-ag的浓度。
其中，步骤1为步骤2提供一种高导电率的纳米复合材料。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中1,5-ag电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤3的1,5-ag的工作曲线为步骤4的实际血清样本中1,5-ag浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用以rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料实现1,5-ag的检测。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.本发明所制备的rgo-cmcs-hemin/ptnps纳米复合材料具有独特的膜状结构，较大的比表面积、较强的催化活性以及较高的导电性，其中,rgo-cmcs-hemin纳米复合材料的大比表面积为ptnps以及prod提供了有效的结合位点，加大prod酶在电极的固定，增强对1,5-ag的催化效率，提高了检测灵敏度。此外，利用cmcs的良好生物相容性和成膜能力、rgo的高比表面积和高电子转移效率、hemin的过氧化物酶性能以及纳米铂（ptnps）的优异催化，通过协同作用形成具有高效类过氧化物酶性能的rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料，可高效催化分解h2o2，产生大量电子。同时rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料具有良好的导电性能，从而增加了电子转移效率，有效放大了检测的电流信号。
2.本发明采用prod对1,5-ag的特异性识别和催化分解，构建基于rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料的纳米电化学传感器；该传感器能达到0.0384mg/ml的检测限。
附图说明
图1基于rgo-cmcs-hemin/ptnps纳米复合材料检测1,5-ag的原理图；
图2rgo-cmcs-hemin（a）和rgo-cmcs-hemin/ptnps（b）的透射电镜（tem）图；
图3电极表面修饰过程的扫描电镜（sem）表征图；
图4不同1,5-ag浓度的dpv曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于rgo-cmcs-hemin/ptnps纳米复合材料检测1,5-ag的检测原理见图1。首先，利用cmcs的良好生物相容性和成膜能力、rgo的高比表面积和高电子转移效率、hemin的过氧化物酶性能以及纳米铂（ptnps）的优异催化，通过协同作用形成具有高效类过氧化物酶性能的rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料；采用层层自组装方式将rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料和1,5-ag在吡喃糖氧化酶（prod）固定在纳米金修饰的丝网印刷电极表面，构建了基于rgo-cmcs-hemin/ptnps的电化学生物传感器。prod与1,5-ag特异性结合催化生成双氧水(h2o2)，h2o2再次被rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料催化分解为h2o和o2，产生的电子经rgo-cmcs-hemin/ptnps复合纳米膜传递到电极表面。采用电化学工作站的差分脉冲伏安法（dpv）记录该峰电流响应信号，然后根据1,5-ag浓度和传感器的响应电流关系绘制出工作曲线，实现对1,5-ag的电化学检测。
具体实施步骤如下：
1.rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料的制备
首先，称取6mg氧化石墨烯（go），置于蒸馏水中定容至60ml，使用超声细胞破碎仪超声1h使其充分溶解均匀，制成0.1mg/ml的go水溶液。随后加入10mg抗坏血酸（aa）搅拌还原20h，即得rgo溶液。
其次，加入20mgcmcs到rgo溶液中，超声破碎30min，获得混合均匀的rgo-cmcs分散液。
第三，在rgo-cmcs溶液加入10ml1mg/ml的hemin溶液，超声破碎1h使其充分混匀，得到rgo-cmcs-hemin分散液。
第四，在rgo-cmcs-hemin分散液中加入4ml0.01mg/ml的氯铂酸钠，边搅拌边加入抗坏血酸10mg，搅拌20h，得到rgo-cmcs-hemin/ptnps悬浊液。
最后，离心洗涤，并于70oc干燥，即得rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料。
采用美国fei公司生产的tecnaig2f30s-twin透射电子显微镜（tem）对rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料进行表征分析，见如图2所示。图2a为rgo-cmcs-hemin的tem图，可以看出rgo-cmcs-hemin是较为平整的膜状褶皱结构。图2b为rgo-cmcs-hemin/ptnps的tem图，膜状褶皱结构中出现深颜色的小颗粒且更加清晰平整，这说明rgo-cmcs-hemin/ptnps复合材料制备成功。
电化学生物传感界面的构建
丝网印刷电极（spce）在使用前首先浸泡在0.5mol/lh2so4溶液中进行循环伏安（cv）扫描，在-0.4v—1.0v的电压范围内扫描20圈；扫描完成之后用水洗净，干燥，得到活化的spce。将活化后的spce电极放入10ml0.01%氯金酸溶液，在-0.4v恒电位沉积120s，洗涤吹干，得到aunps/spce。将aunps/spce电极用2.5%戊二醛浸泡15min，用ph7.4pbs洗涤吹干，然后滴加6μl的rgo-cmcs-hemin/ptnps悬浊液，孵育60min，pbs洗涤，晾干，得rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce。将3μlprod滴加到rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce界面上，孵育3h，洗涤未能固定到界面的prod，自然晾干，得到prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce传感界面。
采用日本日立公司生产的su8020扫描电镜对电极表面的修饰过程进行表征。典型的扫描电镜图（sem）如图3所示，图3a是spce，表面较为平整。图3b是aunps/spce，可观察到表面有许多闪亮的小颗粒物质，说明纳米金沉积到丝网印刷电极上。图3c是rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce，相对图3b，闪亮的小颗粒物质减少，出现包裹状，这是由于rgo-cmcs-hemin/ptnps附着造成的；图3d明显看到白色片状结构，说明prod已经成功的附着在rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce上，上述现象均表明已经成功的制备了1,5-ag传感器。
工作曲线的绘制
在prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce传感界面滴加3µl1,5-ag溶液，37℃温度下孵育30min，用ph7.4的pbs溶液和蒸馏水交替洗涤并吹干，得到1,5-ag/prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce。sem图见图3e。对比图3d，有明显可见的小点点，这表示1,5-ag已通过和prod特异性结合，成功固定到了电极表面。
将1,5-ag/prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce置于pbs缓冲液（0.2mol/l，ph7.4）中，采用电化学工作站的dpv扫描，记录其峰值电流。不同1,5-ag浓度的dpv曲线图见图4。1,5-ag的浓度从0.1mg/ml到2mg/ml内，传感器的电流响应值与1,5-ag的浓度呈线性关系，线性方程y=4.01372 2.18401x（其中y为电流峰电位响应强度，x为1,5-ag浓度），r²=0.98229。通过公式clod=3sb/b计算得到传感器的检测限为0.0384mg/ml（sb为6次重复检测空白样本所计算得到的标准偏差，b为工作曲线的斜率）。
实际血清样本中1,5-ag的检测
将正常人血清样本以1:1的比例分别与0.5mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的1,5-ag标准溶液充分混合，制成混合液。分别滴加3μl上述混合液到prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce表面形成工作电极。按照步骤3所述，将工作电极置于pbs缓冲液中，采用dpv进行扫描，记录其电流值。根据步骤3的标准曲线y=4.01372 2.18401x，计算可得到对应的实际血清样本中1,5-ag的浓度，检测结果见表1。其回收率在99.25-107.60%范围内，rsd值为1.80-6.14%。这些结果表明，所开发的1,5-ag电化学传感器具有良好的应用前景。
表1实际血清样本中1,5-ag的检测结果
（注：血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供）。
1.一种rgo-cmcs-hemin/ptnps纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）称取6mg氧化石墨烯，置于蒸馏水中定容至60ml，使用超声细胞破碎仪超声1h使其充分溶解均匀，制成0.1mg/ml的go水溶液；加入10mg抗坏血酸，搅拌还原20h，即得rgo溶液；
（2）加入20mgcmcs到rgo溶液中，超声破碎30min，获得混合均匀的rgo-cmcs分散液；
（3）在rgo-cmcs溶液加入10ml1mg/ml的hemin溶液，超声破碎1h使其充分混匀，得到rgo-cmcs-hemin分散液；
（4）在rgo-cmcs-hemin分散液中加入4ml0.01mg/ml的氯铂酸钠，边搅拌边加入抗坏血酸10mg，搅拌20h，得到rgo-cmcs-hemin/ptnps悬浊液；
（5）离心洗涤，并于70℃干燥，即得rgo-cmcs-hemin/ptnps纳米复合材料。
2.一种基于权利要求1所述的纳米复合材料检测1,5-ag的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
步骤一：电化学生物传感界面的构建
（1）丝网印刷电极在使用前首先浸泡在0.5mol/lh2so4溶液中进行循环伏安（cv）扫描，在-0.4v—1.0v的电压范围内扫描20圈；扫描完成之后用水洗净，干燥，得到活化的spce；
（2）将活化后的spce电极放入10ml0.01%氯金酸溶液，在-0.4v恒电位沉积120s，洗涤吹干，得到aunps/spce；
（3）将aunps/spce电极用2.5%戊二醛浸泡15min，用ph为7.4pbs洗涤吹干，然后滴加6μl的rgo-cmcs-hemin/ptnps悬浊液，孵育60min，pbs洗涤，晾干，得rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce；
（4）将3μlprod滴加到rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce界面上，孵育3h，洗涤未能固定到界面的prod，自然晾干，得到prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce传感界面；
步骤二：1,5-ag工作曲线的绘制
（1）在prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce传感界面滴加3µl1,5-ag溶液，37℃温度下孵育30min，用ph值7.4的pbs溶液和蒸馏水交替洗涤并吹干，得到1,5-ag/prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce；
（2）将1,5-ag/prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce置于浓度为0.2mol/l，ph值为7.4的pbs缓冲液中，采用电化学工作站的dpv扫描，记录其峰值电流；1,5-ag的浓度从0.1mg/ml到2mg/ml内，传感器的电流响应值与1,5-ag的浓度呈线性关系，y为电流峰电位响应强度，x为1,5-ag浓度，线性方程y=4.01372 2.18401x；
步骤三：实际血清样本中1,5-ag的检测
（1）将正常人血清样本以1:1的比例分别与0.5mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的1,5-ag标准溶液充分混合，制成混合液；
（2）分别滴加3μl上述混合液到prod/rgo-cmcs-hemin/ptnps/aunps/spce表面形成工作电极；按照步骤3所述，将工作电极置于pbs缓冲液中，采用dpv进行扫描，记录其电流值；
（3）根据步骤3的标准曲线，计算可得到对应的实际血清样本中1,5-ag的浓度。
技术总结