本发明涉及生物领域，特别涉及一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法。
背景技术：
胰腺导管腺癌的动态监控评估方法是一种进行胰腺癌术后检查的支撑方法，对病人术后的情况进行检测，出来结果的模型和参数符合pdad术后治疗复发监控的要求，与对病人的早筛检查属于不同的临床应用场景，随着科技的不断发展，人们对于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法的制造工艺要求也越来越高。
现有的胰腺导管腺癌的动态监控评估方法在使用时存在一定的弊端，对于pdac术后的病人，一半的动态监控是以影像学为基础的，检测频率较长，发现不及时，很多阳性患者在影像学检测结果不灵敏，呈现假阴性，直到肿瘤长大到下一次影像学才可以发现，这样对于病人的治疗的时效性非常差，不利于人们的使用，给人们的使用过程带来了一定的不利影响，为此，我们提出一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法。
技术实现要素：
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，可以更加灵敏，能够早于影像学3个月左右发现肿瘤的复发，给后期治疗带来早干预，给病人带来延长生命的优势，弥补以往以影像学为基础的不足，可以有效解决背景技术中的问题。
（二）技术方案
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，包括以下操作步骤：
s1：选取140个pdac术后病人为试验检测对象，抽取每个检测对象在术前，术后每个月，直到影像学进展的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸(edta)的普通血液收集管收集，之后冰袋运输即可；
s2：选取血清1毫升，平均分为2份，分别对两个蛋白，包括ca19-9、thbs2（即血小板反应蛋白2）进行用酶联免疫吸附测定（elisa）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准elisa的方法进行；
s3：剩余的大约4毫升血清，首先抽提cellfreedna（即cf-dna）；
s4：上面步骤的cf-dna产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对kras基因的下一代测序（ngs）检测突变检测，首先，采用多重pcr的方法捕获和富集7种常见的kras突变，捕获和扩增富集后的产物，按照illumina的测序文库搭建方法建立文库，在illumina测序仪（myseq或novaseq）上进行标准的测序过程，测序深度为1万层；
s5：另外的40纳克对两个甲基化位点进行ngs的甲基化的检测，简单地说，就是首先用亚硫酸氢盐处理对象dna，甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序；
s6：根据机器学习模型（采用随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数）的综合打分，给出胰腺导管腺癌（pdac）的复发风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的个人认为是肿瘤早期复发可能的患者，pdac术后的病人建议积极的临床干预行为。
作为一种优选的技术方案，所述s1步骤中的离心方法采用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟，离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度。
作为一种优选的技术方案，所述s2步骤中ca19-9与血小板反应蛋白2分别混合0.5毫升的血清进行酶联免疫吸附测定。
作为一种优选的技术方案，所述ca19-9为肿瘤标志物，是反映肿瘤存在的化学类物质。
作为一种优选的技术方案，所述s3步骤中提取的cf-dna产物以1：4的比例进行测序检测与甲基化检测。
作为一种优选的技术方案，所述s5步骤中加入的亚硫酸氢钠是一种无机物，化学式为nahso3，为白色结晶性粉末，有二氧化硫的不愉快气味，暴露空气中失去部分二氧化硫，同时氧化成硫酸盐。
作为一种优选的技术方案，所述s5步骤中ngs的甲基化的检测采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（bsp）的标准流程上的修改。
作为一种优选的技术方案，所述s6步骤中对pdac术后的病人的动态监控模型构建样品是肿瘤病人手术后每个月（直到影像学复发）的采血。
（三）有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，具备以下有益效果：该一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，可以更加灵敏，能够早于影像学3个月左右发现肿瘤的复发，给后期治疗带来早干预，给病人带来延长生命的优势，弥补以往以影像学为基础的不足，选取140个pdac术后病人为试验检测对象，抽取每个检测对象在术前，术后每个月，直到影像学进展的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸(edta)的普通血液收集管收集，之后冰袋运输即可，选取血清1毫升，平均分为2份，分别对两个蛋白，包括ca19-9、thbs2（即血小板反应蛋白2）进行用酶联免疫吸附测定（elisa）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准elisa的方法进行，剩余的大约4毫升血清，首先抽提cellfreedna（即cf-dna），上面步骤的cf-dna产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对kras基因的下一代测序（ngs）检测突变检测，首先，采用多重pcr的方法捕获和富集7种常见的kras突变，捕获和扩增富集后的产物，按照illumina的测序文库搭建方法建立文库，在illumina测序仪（myseq或novaseq）上进行标准的测序过程，测序深度为1万层，另外的40纳克对两个甲基化位点进行ngs的甲基化的检测，简单地说，就是首先用亚硫酸氢盐处理对象dna，甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序，根据机器学习模型（采用随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数）的综合打分，给出胰腺导管腺癌（pdac）的复发风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的个人认为是肿瘤早期复发可能的患者，pdac术后的病人建议积极的临床干预行为，整个胰腺导管腺癌的动态监控评估方法结构简单，操作方便，使用的效果相对于传统方式更好。
附图说明
图1为本发明一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法的检测评估结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，包括以下操作步骤：
s1：选取140个pdac术后病人为试验检测对象，抽取每个检测对象在术前，术后每个月，直到影像学进展的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸(edta)的普通血液收集管收集，之后冰袋运输即可；
s2：选取血清1毫升，平均分为2份，分别对两个蛋白，包括ca19-9、thbs2（即血小板反应蛋白2）进行用酶联免疫吸附测定（elisa）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准elisa的方法进行；
s3：剩余的大约4毫升血清，首先抽提cellfreedna（即cf-dna）；
s4：上面步骤的cf-dna产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对kras基因的下一代测序（ngs）检测突变检测，首先，采用多重pcr的方法捕获和富集7种常见的kras突变，捕获和扩增富集后的产物，按照illumina的测序文库搭建方法建立文库，在illumina测序仪（myseq或novaseq）上进行标准的测序过程，测序深度为1万层；
s5：另外的40纳克对两个甲基化位点进行ngs的甲基化的检测，简单地说，就是首先用亚硫酸氢盐处理对象dna，甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序；
s6：根据机器学习模型（采用随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数）的综合打分，给出胰腺导管腺癌（pdac）的复发风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的个人认为是肿瘤早期复发可能的患者，pdac术后的病人建议积极的临床干预行为。
进一步的，s1步骤中的离心方法采用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟，离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度。
进一步的，s2步骤中ca19-9与血小板反应蛋白2分别混合0.5毫升的血清进行酶联免疫吸附测定。
进一步的，ca19-9为肿瘤标志物，是反映肿瘤存在的化学类物质。
进一步的，s3步骤中提取的cf-dna产物以1：4的比例进行测序检测与甲基化检测。
进一步的，s5步骤中加入的亚硫酸氢钠是一种无机物，化学式为nahso3，为白色结晶性粉末，有二氧化硫的不愉快气味，暴露空气中失去部分二氧化硫，同时氧化成硫酸盐。
进一步的，s5步骤中ngs的甲基化的检测采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（bsp）的标准流程上的修改。
进一步的，s6步骤中对pdac术后的病人的动态监控模型构建样品是肿瘤病人手术后每个月（直到影像学复发）的采血。
工作原理：选取140个pdac术后病人为试验检测对象，抽取每个检测对象在术前，术后每个月，直到影像学进展的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸(edta)的普通血液收集管收集，之后冰袋运输即可，选取血清1毫升，平均分为2份，分别对两个蛋白，包括ca19-9、thbs2（即血小板反应蛋白2）进行用酶联免疫吸附测定（elisa）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准elisa的方法进行，剩余的大约4毫升血清，首先抽提cellfreedna（即cf-dna），上面步骤的cf-dna产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对kras基因的下一代测序（ngs）检测突变检测，首先，采用多重pcr的方法捕获和富集7种常见的kras突变，捕获和扩增富集后的产物，按照illumina的测序文库搭建方法建立文库，在illumina测序仪（myseq或novaseq）上进行标准的测序过程，测序深度为1万层，另外的40纳克对两个甲基化位点进行ngs的甲基化的检测，简单地说，就是首先用亚硫酸氢盐处理对象dna，甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序，根据机器学习模型（采用随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数）的综合打分，给出胰腺导管腺癌（pdac）的复发风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的个人认为是肿瘤早期复发可能的患者，pdac术后的病人建议积极的临床干预行为，可以更加灵敏，能够早于影像学3个月左右发现肿瘤的复发，给后期治疗带来早干预，给病人带来延长生命的优势，弥补以往以影像学为基础的不足。验证样本结果显示两组间p-value小于0.0001，差异显著（图1）。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二（一号、二号）等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。
1.一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，包括以下操作步骤：
s1：选取140个pdac术后病人为试验检测对象，抽取每个检测对象在术前，术后每个月，直到影像学进展的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸(edta)的普通血液收集管收集，之后冰袋运输即可；
s2：选取血清1毫升，平均分为2份，分别对两个蛋白，包括ca19-9、thbs2（即血小板反应蛋白2）进行用酶联免疫吸附测定（elisa）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准elisa的方法进行；
s3：剩余的大约4毫升血清，首先抽提cellfreedna（即cf-dna）；
s4：上面步骤的cf-dna产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对kras基因的下一代测序（ngs）检测突变检测，首先，采用多重pcr的方法捕获和富集7种常见的kras突变，捕获和扩增富集后的产物，按照illumina的测序文库搭建方法建立文库，在illumina测序仪（myseq或novaseq）上进行标准的测序过程，测序深度为1万层；
s5：另外的40纳克对两个甲基化位点进行ngs的甲基化的检测，简单地说，就是首先用亚硫酸氢盐处理对象dna，甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序；
s6：根据机器学习模型（采用随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数）的综合打分，给出胰腺导管腺癌（pdac）的复发风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的个人认为是肿瘤早期复发可能的患者，pdac术后的病人建议积极的临床干预行为。
2.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，其特征在于：所述s1步骤中的离心方法采用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟，离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度。
3.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，其特征在于：所述s2步骤中ca19-9与血小板反应蛋白2分别混合0.5毫升的血清进行酶联免疫吸附测定。
4.根据权利要求3所述的一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，其特征在于：所述ca19-9为肿瘤标志物，是反映肿瘤存在的化学类物质。
5.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，其特征在于：所述s3步骤中提取的cf-dna产物以1：4的比例进行测序检测与甲基化检测。
6.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，其特征在于：所述s5步骤中加入的亚硫酸氢钠是一种无机物，化学式为nahso3，为白色结晶性粉末，有二氧化硫的不愉快气味，暴露空气中失去部分二氧化硫，同时氧化成硫酸盐。
7.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，其特征在于：所述s5步骤中ngs的甲基化的检测采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（bsp）的标准流程上的修改。
8.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的动态监控评估方法，其特征在于：所述s6步骤中对pdac术后的病人的动态监控模型构建样品是肿瘤病人手术后每个月（直到影像学复发）的采血。
技术总结