本发明属于生物检测领域，具体涉及一种可视化抗原免疫层析试纸及其测定方法。
背景技术：
单克隆抗体主要是由效应b细胞分泌的，将b细胞与骨髓瘤细胞进行融合，既保持了效应b细胞分泌特异性抗体的能力，同时也具有骨髓瘤细胞的无限增殖的能力。单克隆抗体由于其高特异性而被认为是目前最为成熟和可靠的分子识别工具，被广泛应用于生物学和医学研究的各个领域。然而目前对单克隆抗体的制备和应用过程均依赖间接elisa方法，包括小鼠血清效价的测定、阳性微孔的测定、抗体的效价及特异性的测定。而间接elisa对抗体的测定需要包被，封闭，洗脱，孵育等以及多种试剂的配制，步骤多，时间长，这种费时费力的测定方式，已经成为制约单克隆抗体制备及使用的重要瓶颈之一。
与间接elisa相比，胶体金免疫层析试纸具有成本低、易操作、快速、便携和可视化等特征。目前，胶体金免疫层析试纸被广泛应用于抗生素、非法添加物、真菌毒素、农药残留、转基因、生物毒素、致病菌及癌症等有害物的检测，因其成熟的技术也被广泛用于席卷全球的新冠病毒的检测。然而，国内外还未有关于采用此方法快速检测杂交瘤产生的抗体和纯化后的抗体的相关的文献报道。因此，有必要利用免疫层析原理，构建一种新型专门用于单克隆抗体快速测定的试纸，减少单抗制备及使用过程中的人力成本，缩短单抗制备及使用所需要的时间，从而降低单个单抗制备及使用的成本。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种可视化抗原免疫层析试纸及其测定方法。
本发明提供了一种可视化抗原免疫层析试纸，用于高亲和力抗体的快速测定，具有这样的特征，包括：依次排列于pvc底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，结合垫上喷涂有金纳米标记的羊抗鼠抗体，用于捕获待测目标抗体，硝酸纤维素膜上喷涂有灭活的细菌抗原形成检测线即t线，硝酸纤维素膜上还喷涂于兔抗羊抗体形成质控线，该质控线位于检测线旁并靠近吸水垫一侧，即硝酸纤维素膜上的c线处。
本发明还提供了一种采用可视化抗原免疫层析试纸进行高亲和力抗体快速测定的方法，具有这样的特征，包括如下步骤：步骤1，构建检测线为灭活的细菌抗原，且质控线为兔抗羊抗体的试纸条；步骤2，将金纳米标记的羊抗鼠抗体喷涂于结合垫上，而后将试纸条插入阳性细胞上清中进行层析，反应5-10min；步骤3，观察试纸条的检测线，根据检测线以及质控线判定结果为阴性或阳性，从而得到细胞上清中的抗体与灭活的细菌抗原是否产生免疫应答。
在本发明提供的采用可视化抗原免疫层析试纸进行高亲和力抗体快速测定的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，金纳米标记的羊抗鼠抗体的浓度大于3μg/ml。
在本发明提供的采用可视化抗原免疫层析试纸进行高亲和力抗体快速测定的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，金纳米标记的羊抗鼠抗体的浓度为12μg/ml。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的可视化抗原免疫层析试纸及其测定方法，能够用于高亲和力抗体快速测定，减少单抗制备及使用过程中的人力成本，缩短单抗制备及使用所需要的时间，从而降低单个单抗制备及使用的成本。
附图说明
图1是本发明的实施例中可视化抗原免疫层析试纸结构示意图；
图2是本发明烧制的纳米金溶液在450-700nm波长处吸光值示意图；
图3是本发明的实施例中金纳米在不同ph和抗体浓度下标记羊抗鼠抗体结果图；
图4是本发明的实施例中可视化抗原免疫层析试纸用于高亲和力杂交瘤细胞上清测试菌测试结果图；
图5是本发明实施例中抗原免疫层析试纸用于细胞上清和抗体灵敏度测试结果图；
图6是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于果斑菌6d4细胞上清特异性测试结果图；
图7是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于小鼠免疫血清测试结果图；
图8是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于新制备小肠结肠炎耶尔森氏菌2f杂交瘤细胞上清特异性测试图；
图9是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于新制备小肠结肠炎耶尔森氏菌9h杂交瘤细胞上清特异性测试图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
本发明提供了一种可视化抗原免疫层析试纸，用于高亲和力抗体的快速测定，具有依次排列于pvc底板7上的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫6，其中，结合垫2上喷涂有金纳米标记的羊抗鼠抗体，用于捕获待测目标抗体，硝酸纤维素膜3上喷涂有灭活的细菌抗原形成检测线4即t线，硝酸纤维素膜3上还喷涂于兔抗羊抗体形成质控线5，该质控线5位于检测线4旁并靠近吸水垫6一侧，即硝酸纤维素膜3上的c线处。
本发明还提供了一种采用可视化抗原免疫层析试纸进行高亲和力抗体快速测定的方法，包括如下步骤：
步骤1，构建检测线4为灭活的细菌抗原，且质控线5为兔抗羊抗体的试纸条。
步骤2，将金纳米标记的羊抗鼠抗体喷涂于结合垫2上，而后将试纸条插入阳性细胞上清中进行层析，反应5-10min。
本发明中，金纳米标记的羊抗鼠抗体的浓度大于3μg/ml。
步骤3，观察试纸条的检测线4，根据检测线4以及质控线5判定结果为阴性或阳性，从而得到细胞上清中的抗体与灭活的细菌抗原是否产生免疫应答。
实施例：
首先介绍本实施例中所使用的试剂与仪器：
主要试剂
pvp、tween-20国药集团化学试剂有限公司；样品垫、吸水垫上海金标生物科技有限公司；bsa上海杰一生物技术有限公司；氯金酸默克(sigma)；硝酸纤维素膜(nc膜)95赛多利斯；羊抗鼠洛阳佰奥通实验材料中心。血性大肠杆菌o157:h7杂交瘤(d3、e7)、果斑菌杂交瘤(6d)和副溶血性弧菌杂交瘤(h7,c9)均为本市实验保存。
主要仪器
高压蒸汽灭菌锅购自日本tomy；酶标仪spectramaxm2购自moleculardevices；nanodrop2000c购自thermoscientific；点样仪ad6010购自bio-dot；恒温培养摇床sph-100b购自上海世平；蛋白纯化仪biologictmlp358br5057购自bio-rad；单人净化工作台sw-sj-2d型购自苏州净化。
一、测效价荧光试纸条组建
1、可视化抗原免疫试纸条结构
图1是本发明的实施例中可视化抗原免疫层析试纸结构示意图。
如图1所示，测效价荧光试纸条包括：样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、检测线4、质控线5，吸水垫6和pvc底板7。pvc7在最下层，其次是硝酸纤维素膜3(nc膜)，硝酸纤维素膜居于中间，两端分别连着结合垫2和吸水垫6，样品垫1连着结合垫2远离nc膜3的一端，nc膜3上具有检测线3和质控线4，检测线3靠近结合垫2一侧。
2、胶体金制备
将纳米金制备实验所涉及到的玻璃器皿均采用hcl/hno3(v/v，3:1)提前浸泡一天，浸泡完后，回收浸泡试剂，并将玻璃器皿先用自来水清洗，再用超纯水清洗5次以上，置于55℃烘箱烘干备用。将99ml超纯水加入到烧瓶中，调节磁力搅拌器到110-130℃，不超过130℃，搅拌速率为650rpm，在溶液中插入温度感应器以尽量防止溶液形成涡旋，加热至沸腾并保持15s，在充分搅动同时迅速加入2.7ml的1％的柠檬酸三钠和1ml的1％的氯金酸溶液，纳米金粒子直径在15nm左右，溶液开始有蓝色变成成紫红色，最终变成深红色，保持煮沸10min，10min后停止加热，移至室温冷却，于4℃避光保存备用。
图2是本发明烧制的纳米金溶液在450-700nm波长处吸光值示意图。
采用全波长酶标仪对胶体金溶液进行450-700nm波长进行扫描，观察吸收峰，峰越窄说明颗粒越均匀，结果如图2所示，烧制的纳米金的最大的吸收峰为520nm，吸收峰处于495nm-545nm之间，烧制的纳米金比较均匀。
3、金标抗体制备
(1)最佳ph的优化
各取100μl制备好的胶体金溶液置于8个微孔中，分别加入0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μl的0.2mk2co3溶液，调节金纳米溶液的ph值，震荡混匀5min，再每孔加入10μg的抗体蛋白，再次震荡混匀5min。观察各微孔溶液颜色变化，选出几组颜色最红最深的孔。在颜色无法区分的情况下，取标记好的金纳米溶液10μl置于抗原免疫层析试纸结合垫上，插入含有阳性细胞上清的微孔进行免疫层析区别。在免疫层析试纸无法区分的情况下，每孔加入10μl10％nacl溶液震荡混匀反应5min，并将微孔中的金纳米溶液移至1ml离心管中，10000rpm/min离心10分钟，通过倒置离心管，观察离心管底部金纳米复溶情况，复溶情况越好，说明ph越合适。
图3是本发明的实施例中金纳米在不同ph和抗体浓度下标记羊抗鼠抗体结果图，其中，图3(a)是标记ph优化测试结果图，图3(b)是抗体浓度优化测试结果图。
按照上述中的方法对纳米金抗体进行最佳ph进行优化，结果如图3(a)所示，在100μl胶体金溶液体系中，加入0.3～0.9μl0.2mk2co3溶液，胶体金复核溶液颜色较为红，但用肉眼无法区分哪个颜色最红，经抗原免疫层析试纸层析发现，当加入0.9μlk2co3溶液时，对应的t线最亮。因此，在100μl体系中，加入0.9μl0.2mk2co3溶液所对应的ph值为最佳ph值。
(2)最佳抗体浓度
各取100μl制备好的胶体金溶液置于8个微孔中，同时每个微孔加入优化过的最佳ph值所对应的0.2mk2co3溶液体积，震荡混匀5min，再分别加入0、0.3、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、9.6μg羊抗鼠多克隆抗体，再次震荡混匀5min。观察各微孔溶液颜色变化，选出几组颜色最红最深的孔。在颜色无法区分的情况下，取标记好的金纳米溶液10μl置于抗原免疫层析试纸结合垫上，插入含有阳性细胞上清的微孔进行免疫层析区分，其余步骤同优化ph步骤一致。
按照上述优化最佳ph的条件，加入不同体积的抗体进行标记，结果如图3(b)所示，当胶体金溶液浓度为3μg/ml-12μg/ml，胶体金复核溶液颜色较为红，但用肉眼无法区分哪个颜色最红，经抗原免疫层析试纸层析发现，当胶体金复合溶液抗体浓度为12μg/ml时，对应t线最亮，因此，最佳的抗体浓度为12μg/ml。
(3)金标抗体的制备
按照优化好的ph值条件，逐滴向搅拌中的金纳米溶液加入0.2mk2co3溶液，搅拌5min，再按优化的好抗体浓度，逐滴的加入到调整过ph值的金纳米溶液中，搅拌1h，然后加入1/10体积10％bsa溶液继续搅拌30min。搅拌结束后，取上清12000rpm离心10min，弃上清，用等体积的金标抗体保存液重悬底部沉淀，再以12000rpm离心10min，弃上清，将沉淀用1/10体积金标抗体保存液重悬，并于1000rpm下离心10min，吸取上清于4℃保存备用。
二、抗原免疫层析试纸条测试
1、抗原免疫层析试纸条灵敏度测试
为了调查抗原免疫层析试纸的灵敏度，d3、6d4细胞上清和6f单克隆抗体的梯度稀释物被同时用来间接elisa和抗原免疫层析试纸测定，间接elisa用于细胞上清效价及特异性的测定细胞上清、单克隆抗体测定的步骤如下：
步骤1，加入100μl的108菌液于所设定的孔中进行包被，37℃避光孵育2小时或者4℃过夜。洗板2次，每次加入200μl1×pbst，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干，每孔加入200μl3％bsa封闭液封闭菌板，37℃避光孵育1.5小时或者4℃过夜。
步骤2，洗板2次，每次加入200μl1*pbst，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干，将待测抗体或者血清按照倍比梯度稀释，充分混匀，在每孔中加入100μl稀释过不同梯度的一抗，轻轻摇动微孔板混匀，室温37℃避光孵育1小时。
步骤3，洗板3次，每次加入200μl1*pbst，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干，每孔加入100μl稀释好的二抗，室温37℃避光孵育1小时。
步骤4，洗板3次，每次加入200μl1*pbst，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干，加入100μl的tmb显色液(配制好的显色液无色，出现颜色变化不能使用用)，室温37℃避光孵育10-15分钟，加入50μl的终止液终止反应，在450nm下读od值(读数前使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。od值大于2.1倍的阴性值判读为阳性结果。
图4是本发明的实施例中可视化抗原免疫层析试纸用于高亲和力杂交瘤细胞上清测试菌测试结果图，图4(a)是d3细胞上清效价测定结果图，图4(b)是6d4细胞上清效价测定结果图，图4(c)是6f有效抗体浓度测定结果图。
间接elisa测定细胞上清效价结果如表2.1所示，间接elisa对d3和6d4细胞上清测定效价分别为800和100倍，而抗原免疫层析试纸的结果为1600和200倍如图4(a)和图4(b)所示。6f抗体在低温冷冻保藏超过2年了，在进一步使用之前，需要对其有效单克隆抗体浓度进行测定，采用aics方法测定的6f有效单克隆抗体浓度为56.25ng/ml如图4(c)所示，而间接elisa方法测定的有效单克隆抗体浓度为112.5ng/ml。综上，抗原免疫层析试纸灵敏度比间接elisa灵敏度要高2倍。
表2.1细胞上清效价和有效抗体浓度间接elisa测定结果
2、抗原免疫层析试纸条适用范围测试
图5是本发明实施例中抗原免疫层析试纸用于细胞上清和抗体灵敏度测试结果图。
为了验证aics的应用及准确性，5株高亲和力杂交瘤细胞上清被用来测试，包括出血性大肠杆菌o157:h7(d3、e7)、果斑菌(6d)和副溶血性弧菌(h7,c9)，同时对5株杂交瘤细胞上清进行间接elisa测定。间接测定结果如表2.2所示，5株杂交瘤细胞上清测试结果均为阳性。抗原免疫层析试纸结果如图5所示，与间接elisa测试结果一致。
表2.2细胞上清间接elisa测定结果
3、抗原免疫试纸条特异性测试
本实验选取了实验室24株菌，分别进行扩大培养并用pbs洗涤，进行喷t线，制备不同的抗原免疫层析试纸条，分别取100μl细胞上清同时用于间接elisa和免疫层析试纸的交叉反应测试。
图6是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于果斑菌6d4细胞上清特异性测试结果图。
果斑菌6d抗体及其相关产品的特异性均已被测试，为了进一步验证其特异性，24株常见食源性致病菌被用来测试6d单克隆抗体的特异性，结果如图6所示，6d杂交瘤细胞细胞上清与其他菌株均无交叉反应，间接elisa结果如表2.3所示，其测试结果与抗原免疫层析试纸测试结果一致。
表2.36d细胞上清特异性间接elisa测试结果
4、抗原免疫试纸条应用
图7是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于小鼠免疫血清测试结果图，图8是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于新制备小肠结肠炎耶尔森氏菌2f杂交瘤细胞上清特异性测试图，图9是本发明的实施例中抗原免疫层析试纸用于新制备小肠结肠炎耶尔森氏菌9h杂交瘤细胞上清特异性测试图，图7中，(a)为aics用于不同小鼠血清稀释1000倍测定结果图，(b)为aics用于不同小鼠血清稀释16000倍测定结果图图。
为了进一步验证aics对实际样品的有效性、可靠性及准确性，采用atcc23715和cmcc52207双抗原免疫层析试纸对cmcc52207免疫的小鼠进行效价和特异性进行快速测定，结果如图7所示，结果显示小鼠只对cmcc52207产生免疫应答，对atcc23715小鼠出现漏检，且2号小鼠和4号小鼠血清效价最高，达到16000倍以上，可以对4号小鼠进行加强免疫，用于后续的杂交瘤制备。融合后新制备的杂交瘤的2f和9h，为了快速对其特异性进行测定，采用抗原免疫层析试纸对其特异性进行测定，结果分别为图8和图9所示，2f和9h特异性好，均对atcc23715漏检，与小鼠血清特异性测定结果一种，且整个检测过程只需要5-10min。
实施例的作用与效果
以上实施例中的可视化抗原免疫层析试纸，由于采用了新的试纸条及设计，实验结果显示，与间接elisa方法对比，采用该试纸条的可视化单克隆抗体快速测定方法的灵敏度高，时间仅需5-10min。
因此，本实施例的可视化抗原免疫层析试纸及其测定方法，能够用于高亲和力抗体快速测定，减少单抗制备及使用过程中的人力成本，缩短单抗制备及使用所需要的时间，从而降低单个单抗制备及使用的成本。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
1.一种可视化抗原免疫层析试纸，用于高亲和力抗体的快速测定，具有依次排列于pvc底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：
其中，所述结合垫上喷涂有金纳米标记的羊抗鼠抗体，用于捕获待测目标抗体，
所述硝酸纤维素膜上喷涂有灭活的细菌抗原形成检测线即t线，
所述硝酸纤维素膜上还喷涂于兔抗羊抗体形成质控线，该质控线位于所述检测线旁并靠近所述吸水垫一侧，即所述硝酸纤维素膜上的c线处。
2.一种采用如权利要求1所述的可视化抗原免疫层析试纸进行高亲和力抗体快速测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，构建检测线为灭活的细菌抗原，且质控线为兔抗羊抗体的试纸条；
步骤2，将金纳米标记的羊抗鼠抗体喷涂于所述结合垫上，而后将所述试纸条插入阳性细胞上清中进行层析，反应5-10min；
步骤3，观察所述试纸条的检测线，根据所述检测线以及所述质控线判定结果为阴性或阳性，从而得到所述细胞上清中的抗体与所述灭活的细菌抗原是否产生免疫应答。
3.根据权利要求2所述的可视化抗原免疫层析试纸进行高亲和力抗体快速测定的方法，其特征在于：
其中，所述步骤2中，金纳米标记的羊抗鼠抗体的浓度大于3μg/ml。
4.根据权利要求3所述的可视化抗原免疫层析试纸进行高亲和力抗体快速测定的方法，其特征在于：
其中，所述步骤2中，金纳米标记的羊抗鼠抗体的浓度为12μg/ml。
技术总结