本发明涉及黄曲霉毒素b1测定的
技术领域：
，具体涉及中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法。
背景技术：
：黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌产生的剧毒代谢产物，是迄今发现的最强致癌物质之一。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素b1(afb1)、b2(afb2)、g1(afg1)、g2(afg2)和m1(afm1)等，其中afb1的毒性最强，污染最为广泛，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素b1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即ⅰ类致癌物质。产毒真菌菌株广泛存在于自然界中，谷物、水果、中药、茶叶、食用油和牛奶等农产品和食品均易受黄曲霉毒素b1的污染。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，特别是南方高温高湿地区受污染的情况最为严重。因此加强黄曲霉毒素的检测、特别是速测，及时了解和掌握各种食物及农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。现有黄曲霉毒素的检测方法主要是精密仪器分析法和免疫学分析法。其中精密仪器分析法主要包括高效液相色谱法、色谱-质谱联用，这些方法灵敏度高，准确性好，然而存在仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，传统的样品前处理技术过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测的目的。近年来迅速发展的免疫层析分析方法克服了上述方法的不足，作为一类新型的快速检测分析技术，具有简便快速的操作过程、即刻呈现测试结果、价格低廉等优点，已经被广泛应用于医学诊断、食品检测等各个领域。经过检索可知，专利号为cn201710753370.6，
专利名称：为一种检测黄曲霉毒素b1的时间分辨荧光试纸条及其应用的公开材料，在该公开材料中，公开了一种黄曲霉毒素b1时间分辨荧光试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫三部分。反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端。其中，样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；反应膜上设有检测线(t线)和质控线(c线)，t线接上包被黄曲霉毒素b1抗原，c线包被抗兔抗体，并公开了试纸条的制备和使用方法，通过分析可知，检测方法的操作过于复杂，精密度差，，不能准确定量，且准确性较差。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，而提供一种检测准确、效率高、准确定量和精密度高的药材中黄曲霉毒素b1的测定方法。本发明的目的是这样实现的：中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：包括，样品选取：将200g中药材用粉碎研磨机粉碎至粉末状，使其粒径小于2mm试验筛，混合均匀后缩分至50g，储存于样品瓶中，密闭保存，供检测使用；称取1g中药材试样于50ml离心管中，加入20ml的50％甲醇水溶液，涡旋提取3分钟，4000r/min离心5分钟，上清液备用；试纸条选取：从包装中取出黄曲霉毒素b1免疫荧光试纸条，至于孵育器内，25℃恒温孵育5分钟，待用；取液：准确移取样品选取中试样上清液1.00ml至5ml离心管中，再准确加入溶液稀释剂1.00ml，涡旋混匀；滴入试纸条：移取取液操作中的试样稀释液100μl至试纸条微孔内，继续孵育10分钟；获取数据：取出试纸条插入荧光读卡仪卡槽内，读取t/c比值，根据已输入的黄曲霉毒素b1多段线性标准曲线读取样品中含有黄曲霉毒素的含量x(μg/kg)。所述黄曲霉毒素b1免疫荧光试纸条的制备是利用生物信息技术制备黄曲霉毒素b1的抗原抗体，再将黄曲霉毒素b1抗体与荧光微球偶联，采用间接竞争法制备试纸条。将荧光微球偶联抗体喷洒固定在纤维垫上，用适当浓度的抗原和二抗在nc膜上划线，将抗原和二抗包埋固定在nc膜上，37°恒温老化24h，精密度改善，形成质控线c线和检测线t线，以样品中黄曲霉毒素b1浓度为横坐标，对应浓度t/c荧光强度比值为纵坐标，绘制多段线性标准曲线，未知浓度样品可通过荧光检测仪读取t/c值，利用多段线性标准曲线求得样品中黄曲霉毒素b1的含量。所述多段线性标准曲线的设置称取6份质量为1.00g的样品至于6个50ml离心管中，分别从100ng/ml的黄曲霉毒素b1标准溶液中准确移取0μl，10μl，25μl，50μl，100μl，150μl至上述6个离心管中；按照样品选取、试纸条选取、取液和获取数据的方法读出上述6份加标样品的t/c比值，以加标浓度为横坐标，以t/c比值为纵坐标，建立多段线性标准曲线并输入荧光读卡仪。所述黄曲霉毒素b1标准溶液的含量为100ng/ml。所述溶液稀释剂：取0.5g吐温-20，加入100ml水中，混匀。所述50％甲醇水溶液的制备为取50ml水与50ml甲醇混匀。本发明的有益效果：本发明的优点在于：1、准确定量，将试纸条插入荧光读卡仪卡槽内，读取t/c比值；2、精密度高，未知浓度样品可通过荧光检测仪读取t/c值，利用多段线性标准曲线求得样品中黄曲霉毒素b1的含量；其他有益效果在具体实施例中详细说明。附图说明图1是多段线性标准曲线图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同，本说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明，本说明书所使用的术语如“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合；此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。实施例1中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：包括，样品选取：该操作用于选取待检测材料，将大约200g中药材用粉碎研磨机粉碎至粉末状，使其粒径小于2mm试验筛，混合均匀后缩分至50g，储存于样品瓶中，密闭保存，供检测使用；称取1g中药材试样(精确至0.01g)放置50ml离心管中，加入20ml的50％甲醇水溶液，涡旋提取3分钟，4000r/min离心5分钟，上清液备用，需要说明的是遇到色素较重的药材样品，可准确移取上清液10ml提取液至15ml离心管中，加入c18粉300mg，无水硫酸镁900mg，psa粉300mg，硅胶300mg，gcb90mg，涡旋3分钟，4000r/min离心，上清液备用；试纸条选取：该操作用于选取试纸条，并对试纸条做出处理，具体的，从包装中取出黄曲霉毒素b1免疫荧光试纸条，至于孵育器内，25℃恒温孵育5分钟，待用；取液：准确移取样品选取中试样上清液1.00ml至5ml离心管中，再准确加入溶液稀释剂1.00ml，涡旋混匀；滴入试纸条：移取取液操作中的试样稀释液100μl至试纸条微孔内，继续孵育10分钟；获取数据：取出试纸条插入荧光读卡仪卡槽内，读取t/c比值，根据已输入的黄曲霉毒素b1多段线性标准曲线读取样品中含有黄曲霉毒素的含量x(μg/kg)。实施例2所述黄曲霉毒素b1免疫荧光试纸条的制备是利用生物信息技术制备黄曲霉毒素b1的抗原抗体，再将黄曲霉毒素b1抗体与荧光微球偶联，采用间接竞争法制备试纸条，将荧光微球偶联抗体喷洒固定在纤维垫上，用适当浓度的抗原和二抗在nc膜上划线，将抗原和二抗包埋固定在nc膜上，37°恒温老化24h，精密度改善，形成质控线c线和检测线t线，以样品中黄曲霉毒素b1浓度为横坐标，对应浓度t/c荧光强度比值为纵坐标，绘制多段线性标准曲线，未知浓度样品可通过荧光检测仪读取t/c值，利用多段线性标准曲线求得样品中黄曲霉毒素b1的含量。本实施例中描述了黄曲霉毒素b1免疫荧光试纸条的制备原理，免疫荧光试纸条：与传统胶体金试纸条相比，免疫荧光法采用时间分辨荧光微球代替胶体金与抗体进行偶联，荧光微球与抗体偶联是通过化学键结合实现的，而胶体金是通过胶体本身的静电吸附实现的，两者相较，化学键更稳定，不容易由于试剂ph、盐等条件的改变断裂，而胶体金的静电吸附对ph、盐等条件极为敏感，容易出现偶联失败或解吸的结果。在结果读取时，仪器读取胶体金显色的灰度值，若样品本身具有颜色，对结果产生大量干扰，无法准确定量，而荧光微球在紫外光下激发的荧光，不会被样品带入的色素干扰。再者，荧光比胶体金灰度相应大几十倍，在响应值出现波动的情况下，响应值大就意味着相对偏差较小，从而对结果影响较小。在本实施例中，做出如下解释：1、“干式”：将一定浓度的荧光微球偶联抗体喷洒固定在纤维垫上，该纤维垫上下分别与样品垫、已包埋抗原和二抗的nc膜搭接，nc另一端在与吸水垫搭接，裁剪成条后，扣入试纸条卡壳内，形成终产品的一种试纸条样式。优点：样品垫、固定荧光偶联抗体的纤维垫、包埋抗原和二抗的nc膜、吸水垫搭接集成在一起，扣入卡壳中，检测过程中仅需将一定稀释度的样品提取液准确移取150μl至卡槽的进样孔处即可，无需其他操作。该设计大大减少了人员在检测过程中的操作难度和步骤，与传统湿法相比，省去了移取滴加偶联抗体，滴加抗体稀释液，振荡混匀，滴加样品提取液等步骤，降低了操作难度和差错率。2、间接竞争法：再滴加一定浓度的样品提取液后，样液首先层析至纤维垫处，样液中的真菌毒素与预先喷洒固定的偶联抗体进行免疫亲和反应并结合成为荧光微球偶联抗原抗体，该抗原抗体与未反应的荧光微球偶联抗体随着纸层析向试纸条上方移动。在t线处，荧光微球偶联抗体会与t线包埋的抗原结合，并固定在t线，已在样品垫处结合的抗原抗体不会与包埋的抗原反应，继续向前层析，到达c线，并与c线包埋的二抗结合，并固定在c线处。待反应完全，插入荧光读卡仪(激发波长365nm，发射波长610nm)，读出t、c、t/c数值具体的检测原理：先将免疫荧光试纸条平放在孵育器内25℃预热，样品经过甲醇溶液提取，将提取液定量加入免疫荧光试纸条的微孔内，将加入样品的试纸条再次放入孵育器内，并开始定时，以25℃在孵育器内恒定加热10分钟，将荧光试纸条插入荧光检测仪，荧光检测仪分别检测出c、t线的荧光强度，并求出t/c的数值，对照检测仪中的多段线性标准曲线，求出样品中黄曲霉毒素b1的含量，所用的试剂：甲醇(ch3oh)为色谱纯，吐温-20为化学纯。nc膜和纤维垫需37℃老化24h，目的在于增加偶联抗体、抗原和二抗在产品中的稳定性，从而达到产品检测结果稳定，得到精密度、准确度较高的结果。若老化不足，产品会随着时间的推移，不断变化。以样品浓度为5.0μg/kg为例，每天做10组平行测定，其平均值如下表所示孵育温度：免疫荧光试纸条可在室温储存，由于抗原抗体均具备生物活性，最佳储存条件为2～8℃。在检测开始前，应至少提前5分钟进行孵育，以使抗原抗体复苏，恢复并保持稳定的生物活性，在检测中应保持孵育状态，直至读取检测结果。现将进行孵育的检测组与未孵育的检测组进行对照，以样品浓度为5.0μg/kg为例，结果如下表所示测试1测试2测试3测试4测试5测试6测试7测试8测试9测试10平均值rsd(％)未孵育趴(μg/kg)10.138.2813.118.8511.2811.039.4312.378.8811.5810.490.13孵育组(μg/kg)5.085.025.054.875.164.995.015.064.915.015.020.02实施例3所述多段线性标准曲线的设置称取6份质量为1.00g的样品至于6个50ml离心管中，分别从100ng/ml的黄曲霉毒素b1标准溶液中准确移取0μl，10μl，25μl，50μl，100μl，150μl至上述6个离心管中；按照样品选取、试纸条选取、取液和获取数据的方法读出上述6份加标样品的t/c比值，以加标浓度为横坐标，以t/c比值为纵坐标，建立多段线性标准曲线并输入荧光读卡仪。序号标点浓度(μg/kg)t/c值101.1222.000.9535.000.74410.00.51520.00.33630.00.24该表格为六个离心管中经过检测后的t/c值，并绘制了如图1所示的多段线性标准曲线图，离心管为塑料离心管，规格为50ml，黄曲霉毒素b1标准溶液的含量为100ng/ml，溶液稀释剂：取0.5g吐温-20，加入100ml水中，混匀，50％甲醇水溶液的制备为取50ml水与50ml甲醇混匀。1、平行重复性实验用薏苡仁作为待测物，进行重复性实验，上述表格为加标浓度分ie为2.00、5.00、10.0、20.0、30.0μg/kg时，各加标浓度平行测定6次的t/c值和相对标准偏差。各点偏差均小于10％，重复性良好。2、试纸条对于不同产品的适用性通过加标(见下表)，测得薏苡仁、莲子、桃仁、远志、陈皮和胖大海中黄曲霉毒素b1含量为0～30.0μg/kg的6组结果，与标准加标值相比较，rsd分别为2.98％，1.26％，0.69％，0.20％和0.37％，说明该方法适用于多种农药中黄曲霉毒素b1的测定，品种适用性较好。具体实施方式是对本发明的进一步说明而非限制，对本领域普通技术人员来说在不脱离本发明实质内容的情况下对结构做进一步变换，而所有这些变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：包括，
样品选取：将200g中药材用粉碎研磨机粉碎至粉末状，使其粒径小于2mm试验筛，混合均匀后缩分至50g，储存于样品瓶中，密闭保存，供检测使用；称取1g中药材试样于50ml离心管中，加入20ml的50％甲醇水溶液，涡旋提取3分钟，4000r/min离心5分钟，上清液备用；
试纸条选取：从包装中取出黄曲霉毒素b1免疫荧光试纸条，置于孵育器内，25℃恒温孵育5分钟，待用；
取液：准确移取样品选取中试样上清液1.00ml至5ml离心管中，再准确加入溶液稀释剂1.00ml，涡旋混匀；
滴入试纸条：移取取液操作中的试样稀释液100μl至试纸条微孔内，继续孵育10分钟；
获取数据：取出试纸条插入荧光读卡仪卡槽内，读取t/c比值，根据已输入的黄曲霉毒素b1多段线性标准曲线读取样品中含有黄曲霉毒素的含量x(μg/kg)。
2.根据权利要求1所述的中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：所述黄曲霉毒素b1免疫荧光试纸条的制备是利用生物信息技术制备黄曲霉毒素b1的抗原抗体，再将黄曲霉毒素b1抗体与荧光微球偶联，采用干式间接竞争法制备试纸条。
3.根据权利要求2所述的中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：将荧光微球偶联抗体喷洒固定在纤维垫上，用适当浓度的抗原和二抗在nc膜上划线，将抗原和二抗包埋固定在nc膜上，37°恒温老化24h，形成质控线c线和检测线t线，以样品中黄曲霉毒素b1浓度为横坐标，对应浓度t/c荧光强度比值为纵坐标，绘制多段线性标准曲线，未知浓度样品可通过荧光检测仪读取t/c值，利用多段线性标准曲线求得样品中黄曲霉毒素b1的含量。
4.根据权利要求3所述的中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：所述多段线性标准曲线的设置称取6份质量为1.00g的样品至于6个50ml离心管中，分别从100ng/ml的黄曲霉毒素b1标准溶液中准确移取0μl，10μl，25μl，50μl，100μl，150μl至上述6个离心管中；按照样品选取、试纸条选取、取液和获取数据的方法读出上述6份加标样品的t/c比值，以加标浓度为横坐标，以t/c比值为纵坐标，建立多段线性标准曲线并输入荧光读卡仪。
5.根据权利要求4所述的中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：所述黄曲霉毒素b1标准溶液的含量为100ng/ml。
6.根据权利要求1所述的中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：所述溶液稀释剂：取0.5g吐温-20，加入100ml水中，混匀。
7.根据权利要求1所述的中药材中黄曲霉毒素b1的测定方法，其特征在于：所述50％甲醇水溶液的制备为取50ml水与50ml甲醇混匀。
技术总结本发明涉及中药材中黄曲霉毒素B1的测定方法，其特征在于：包括，样品选取：将200g中药材用粉碎研磨机粉碎至粉末状，使其粒径小于2mm试验筛，混合均匀后缩分至50g，储存于样品瓶中，密闭保存，供检测使用；称取1g中药材试样于50mL离心管中，加入20mL的50％甲醇水溶液，涡旋提取3分钟，4000r/min离心5分钟，上清液备用；试纸条选取：从包装中取出黄曲霉毒素B1免疫荧光试纸条，至于孵育器内，25℃恒温孵育5分钟，待用；取液：准确移取样品选取中试样上清液1.00mL至5mL离心管中，再准确加入溶液稀释剂1.00mL，涡旋混匀；滴入试纸条：移取取液操作中的试样稀释液100μL至试纸条微孔内，继续孵育10分钟；本发明具有检测准确、效率高、准确定量和精密度高的优点。
技术研发人员：张威;王明辉;张小乐;刘东超
受保护的技术使用者：河南华普盾安生物科技有限公司
技术研发日：2021.04.30
技术公布日：2021.08.03
