本发明属于食品安全检测的技术领域，涉及用于萃取油脂中亲脂性污染物的固相逆向相转移萃取技术。
背景技术：
食用植物油是以食用植物油料或植物原油为原料制成的食用油脂，也是亲脂性污染物饮食暴露的主要途径之一。生活中常见的食用植物油包括大豆油、菜籽油、花生油、芝麻油、食用植物调和油等。
研究发现，这些亲脂性污染物主要包括：农药残留(如硫丹、毒死蜱、氯氰菊酯、六氯环己烷和毒杀芬等)、真菌毒素(如黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等)、多环芳烃、邻苯二甲酸酯类化合物、双酚a、氯化石蜡、氯丙醇酯和缩水甘油酯等，其中，很多化合物被证明具有内分泌干扰活性或致癌致畸变活性。
故而，亲脂性污染物的检测技术至关重要。然而，现有的食用油中亲脂性污染物检测技术中包含以下缺陷：样品前处理过程复杂，需要使用大量有机溶剂，且严重依赖液相色谱、气相色谱等大型仪器设备，检测时间长、费用高，由此导致对食用油中污染物检测覆盖率极低、时效性差。
为解决上述技术问题，亟需开发一种能够对食用油中亲脂性污染物进行现场检测的快速检测技术。
目前，由于可以通过改进抗原、不断免疫筛选、抗体基因改造等途径优化、完善抗体这种核心原材料，免疫检测技术已成为研究最多、应用最广(如免疫诊断试剂盒)的快速检测技术之一。虽然用于真菌毒素、农药残留、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类化合物等有机污染物的免疫检测技术已有很多报道，但是能应用于食用油中亲脂性污染物快速检测的报道并不多见。特别是食用油中亲脂性污染物不仅从油脂中萃取相对较为困难，而且免疫检测中的抗体作为一种蛋白，其活性受微环境的影响较大，使得样品提取液中微量油脂的存在会导致某些免疫检测的灵敏度及回收率明显降低，因此现有的免疫检测技术不能对食用油中亲脂性污染物进行现场快速检测，检测之前需要进行除油预处理。
例如，褚庆华等报导的食用油中赭曲霉毒素a快速检测方法和马良等报导的食用油中黄曲霉毒素b1快速检测方法，采用的是有机溶剂萃取-真菌毒素免疫亲和柱净化-荧光分光光度计检测的方式[1,2]。liuy等建立了检测山茶油中5中有机磷农药残留的elisa方法[3]，样品需经基质分散固相萃取技术(mspd)分离净化以降低油料基质干扰。cuix报道了一种检测食用油中邻苯二甲酸二异丁酯的间接竞争荧光免疫分析方法[4]，其样品预处理过程包括了甲醇萃取、溶剂挥干、正己烷复溶、弗罗里硅土柱净化、洗脱等步骤。
显然，由于样品预处理过程的复杂，现有食用油中污染物免疫检测技术还很难真正应用于现场快速检测。
因此，目前制约食用油中污染物快速免疫检测技术发展的瓶颈在于缺少能够快速、高效将油相中亲脂性污染物萃取到水相中的样品预处理方法。
中国发明专利cn202011303576.7中公开了一种油脂中辣椒碱类化合物的逆向相转移萃取剂(inverse-phasetransferextractants,ipte)萃取并检测工艺，可以对辣椒碱类化合物进行现场快速检测，从而实现对地沟油的鉴别；采用ipte的类似技术在快速检测食用油中玉米赤霉烯酮的应用研究也已经发表[5]。但是，对于一些脂溶性特别强的化合物，如玉米赤霉烯酮、毒死蜱、苯并芘等，ipte的萃取效率仍有待提高，以进一步提高检测灵敏度。为此，本发明提出了一种固相逆向相转移萃取剂(solidinverse-phasetransferextractants,sipte)技术。本技术实现的关键是保证作为sipte的免疫微球上的抗体活性在剧烈油水混合振荡过程中不受油脂破坏，虽然中国发明专利cn201510477644.4中公开免疫微球周围构建了一层水化层，虽然能够保护微球上的抗体不会与油相接触，但是在剧烈振荡过程中，这个水化层对抗体的保护效果有限。为保证抗体活性在剧烈振荡过程中不受油脂破坏，本发明提出了在微球周围构建更稳定的水化层的技术，通过将含有sipte的水相与油相充分振荡混合、平衡后，直接将混合液滴到相应的免疫层析试纸上反应，从而实现对油中亲脂性污染物的现场快速检测。在此基础上，将进行基于固相逆向相转移萃取技术的食用油中亲脂性污染物快速检测所需的所有耗材集成在了一个试剂盒中的一种油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒以实现现场定量检测。
相关文献可参见：
1)褚庆华；郭德华；王敏；王雄,免疫亲和柱净化快速测定油籽和食用植物油中赭曲霉毒素a.检验检疫科学2004；(03):45-47.
2)马良；李培武；张文；丁晓霞；谢立华；姜俊,食用油中黄曲霉毒素b_1免疫亲和检测技术研究.中国油脂2007；(04):72-75.
3)liu,y.；guo,y.；zhu,g.；tang,f.,enzyme-linkedimmunosorbentassayforthedeterminationoffiveorganophosphoruspesticidesincamelliaoil.jfoodprot2014；77(7):1178-1183.
4)cui,x.；wu,p.；lai,d.；zheng,s.；chen,y.；eremin,s.a.；peng,w.；zhao,s.,developmentofahighlyspecificfluorescenceimmunoassayfordetectionofdiisobutylphthalateinedibleoilsamples.jagricfoodchem2015；63(42):9372-9378.
5)maox,wuy,chenh,wangy,yub,shig.amix-and-detectmethodbasedoncolloidalgoldimmunochromatographicassayforon-sitedetectionofzearalenoneinedibleoils.analmethods2020；12:5628-5634.
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是目前制约食用油中污染物现场快速免疫检测技术发展的瓶颈在于缺少能够快速、高效将油相中亲脂性污染物萃取到水相中的样品预处理方法。
为解决上述技术问题，本发明提出一种用于萃取油脂中亲脂性污染物的固相逆向相转移萃取技术，该技术所用的sipte是一种对抗体进行亲水性保护的免疫微球，即将目标物的高亲和力抗体偶联到胶体金/荧光微球/磁性微球等固相载体上，然后在微球周围结合一层亲水性化合物，形成水化层，保护微球上的抗体蛋白不与油脂接触。将sipte与油相充分混合后会形成如图1所示的“油-水-固”三相萃取体系，在热力学平衡的驱动下，将油相中的目标物“吸”到抗体上。本发明提出了一定比例的牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠在微球周围构建更稳定的水化层的技术，以保证在油水剧烈混合的过程中，微球表面的抗体蛋白不会与脂肪分子发生结合而导致构象不可逆的改变。
选择预装sipte悬液的注射器和对应的侧向流免疫层析检测卡，将待测试的油样倒入样品杯中，用预装sipte溶液的注射器从样品杯吸入油样并盖上注射器自带的密封帽，充分振荡后，竖直插在试剂盒的注射器支架上静置，取出注射器，去掉密封帽，将注射器口对准侧向流免疫层析检测卡的样品孔，轻推注射器推杆，向样品孔中滴加若干滴下层水相，检测卡静置反应，最后得出检测模式得出检测结果；
其中：所述预装sipte的注射器为预装有针对目标化合物的sipte悬液，所述sipte是以胶体金为载体微球或以羧基化或氨基化的微球为载体微球；所述sipte悬液是将sipte均匀分散在ipte溶液中，在sipte悬液中的微球含量为1-5μg/ml；
所述侧向流免疫层析检测卡的制备：利用划膜仪将一定浓度包被抗原以及羊抗鼠igg均匀涂到层析膜上，经一定干燥工艺处理后生成能够与sipte结合的检测线和参考线。将试纸装载于塑料卡壳中，制成检测卡。将一支检测卡和一包干燥剂装入铝箔袋中，密封保存。
优选地，所述快速检测试剂盒包括盒体，盒体内通过隔板设置有注射器储存区、免疫层析检测卡储存区、注射器支架和样品杯区，所述盒体包括盒底、盒侧面和盒盖，所述盒侧面包括两个长侧面和两个短侧面，所述盒盖和一个所述长侧面转动连接，所述注射器储存区紧靠另一个所述长侧面设置，所述注射器储存区相邻设置免疫层析检测卡储存区和注射器支架，所述注射器支架相邻设置样品杯区和免疫层析检测卡储存区；
所述的注射器储存区设置有若干预装sipte的注射器，所述免疫层析检测卡储存区设置有若干侧向流免疫层析检测卡，所述注射器支架设置有用于垂直静置注射器的若干孔洞，所述样品杯区设置有若干样品杯。
优选地，所述sipte悬液加入nan3或procline300以防止长菌。
优选地，所述ipte包括：月桂醇聚醚类化合物c12h25(och2ch2)noh，分子式中的n＝3-35、烷基酚聚氧乙烯醚类化合物c8-9h17-19c6h4(och2ch2)noh、环糊精及其衍生物。
优选地，将所述预装sipte的注射器10-20支、所述侧向流免疫层析检测卡10-20袋、所述样品杯10-20个装入所述快速检测试剂盒中，完成试剂盒的组装，获得油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒的成品。
优选地，以胶体金为载体微球的制备为：取平均粒径为25nm的纳米金颗粒的溶液，用0.1mol/l的碳酸钾溶液调节ph值为7.5，向溶液中加入一定浓度的单克隆抗体，反应30分钟后，加入含牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠的封闭缓冲液，继续反应30分钟；标记与封闭完成后，纳米金表面形成保护抗体的水化层；经4℃、12000r/min离心30分钟后，去除上清，然后用磷酸盐缓冲液洗涤、重悬后，制得以胶体金为载体的sipte。
优选地，以羧基化的微球为载体微球的制备为：
(1)微球储备液超声15min得到悬浮液，取微球悬浮液至2ml的圆底离心管中，加edc和sulfo-nhs(mes缓冲液，50mm，ph5)，上下吹打，室温下，颠倒混匀反应20min，4℃，12000rpm离心30min，移除液相；
(2)离心后的沉淀加mes缓冲液(50mm，ph5)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；重复一次，共两次洗涤；
(3)向离心后的沉淀加单克隆抗体溶液(pb缓冲液，20mm，ph7.2)，上下吹打混匀；室温下，颠倒混匀反应20min，在4℃，12000rpm离心30min，移除液相；
(4)离心后的沉淀加pb缓冲液(20mm，ph7.2)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；重复一次，共两次洗涤；
(5)离心后沉淀加含牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠的封闭液，静置30min，微球表面形成保护抗体的水化层。4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；
(6)用pb缓冲液(20mm，ph7.2)洗涤两次后，复溶，制得以羧基化微球为载体的sipte。
本发明实施例提供的上述技术方案，至少具有如下有益效果：
(1)本发明提出一种油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒，该快速检测试剂盒将进行基于固相逆向相转移萃取技术的食用油中亲脂性污染物快速检测所需的所有耗材集成在了一个试剂盒中，尤其是盒中隔板上还设计了可将多个注射器插入其中，进行竖直静置的搁架，这些设计的有益之处在于充分考虑了现场检测的应用场景，方便使用。
(2)本发明的快速检测试剂盒中的注射器储存区设置有若干预装sipte的注射器，与以前报道的利用ipte对食用油中目标物进行检测的过程相比，本发明的不需要频繁更换移液枪头，只需要采用预装sipte溶液的注射器，提高了集成度，减少了操作步骤，降低了实验人员因频繁更换移液枪头而出错的概率，降低了综合成本。
(3)本发明首次设计了固相逆向相转移萃取剂(sipte)，通过“油-水-固”三相体系，萃取油相中的目标化合物。
(4)本发明sipte使用的胶体金/荧光微球/磁性微球等固相载体同时是侧向流免疫层析试纸的标记物，一方面显著提高了对油相中亲脂性污染物的萃取效率的同时，另一方面，它们可以被试纸上包被的目标化合物包被抗原(t线抗原)和二抗(c线)捕获，产生可以目视观察或被仪器检测的荧光、或磁力信号，用于目标物含量的判读。
(5)本发明采用水化层强化技术。抗体结合在胶体金/荧光微球/磁性微球等固相载体上以后，通过加入由牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠组成的封闭溶液，使得载体微球表面形成了加厚稳定的水化层，采用强化水化层技术保证免疫微球上的抗体在油水剧烈混合过程中不被脂肪破坏。
虽然现有技术中确实存在选用牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮作为本领域研究者常用的封闭剂，但是仅有这些是不足以形成加厚且稳定的水化层，聚乙烯吡咯烷酮pvpk12加少量海藻酸钠的加入协同起到原始水化层加厚并保持稳定的技术效果。而加厚稳定水化层的有益效果在于保护sipte上的抗体在油样与水样的剧烈混合振荡过程中，不会因为接触到油脂而变性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的sipte的工作原理的结构示意图；其中：1-油相，11-亲脂性污染物，2-水相，3-sipte，4-抗体，5-亲水性聚合物，6-加厚水化层。
图2为本发明的一种油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒的结构示意图；其中：12-盒侧面，4-抗体，41-预装sipte的注射器，5-亲水性聚合物，51-侧向流免疫层析检测卡，6-加厚水化层，61-孔洞，7-样品杯区，71-样品杯。
图3为本发明的一种油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒的俯视图；其中：1-盒体，11-亲脂性污染物，13-盒盖，2-第一隔板，3-第二隔板，4-注射器储存区，5-免疫层析检测卡储存区，6-注射器支架，61-孔洞，7-样品杯区。
图4为本发明的一种油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒的使用方法示意图；其中：(1)为吸取油样的步骤，(2)为振荡混匀静置分层，(3)为免疫层析，(4)为读卡分析。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
如图4所示，本发明提供了一种用于萃取油脂中亲脂性污染物的固相逆向相转移萃取技术，包括预装有sipte的一次性注射器和对应的检测试纸。使用时，用一次性注射器吸入一定体积油样，充分振荡后，竖直插在试剂盒的注射器支架上静置(也可放置在其它能保证注射器竖直的位置)，然后用注射器将一定体积下层水相滴加到试纸上检测。如果检测试纸是胶体金或彩色微球等可以通过目视观察进行判读的试纸，则可以直接进行现场定性检测；如果检测试纸是基于量子点荧光或时间分辨荧光等需要仪器协助判读的检测模式，则配以手持式的检测仪器，就可以实现现场定量检测。
其中：所述预装sipte的注射器41为预装有针对目标化合物的sipte悬液，所述sipte是以胶体金为载体微球或以羧基化或氨基化的微球为载体微球；所述sipte悬液是将sipte均匀分散在ipte溶液中，在sipte悬液中的微球含量为1-5μg/ml；
所述侧向流免疫层析检测卡的制备：利用划膜仪将一定浓度包被抗原以及羊抗鼠igg均匀涂到层析膜上，经一定干燥工艺处理后生成能够与免疫微球结合的检测线和参考线。将试纸装载于塑料卡壳中，制成检测卡。将一支检测卡和一包干燥剂装入铝箔袋中，密封保存。
特别地，如图2和3所示，所述快速检测试剂盒包括盒体1，盒体1内通过第一隔板2和第二隔板3设置有注射器储存区4、免疫层析检测卡储存区5、注射器支架6和样品杯区7，所述盒体1包括盒底11、盒侧面12和盒盖13，所述盒侧面包括两个长侧面和两个短侧面，所述盒盖和一个所述长侧面转动连接，所述注射器储存区紧靠另一个所述长侧面设置，所述注射器储存区4相邻设置免疫层析检测卡储存区5和注射器支架6，所述注射器支架6相邻设置样品杯区7和免疫层析检测卡储存区5；
所述的注射器储存区4设置有若干预装sipte的注射器41，所述免疫层析检测卡储存区5设置有若干侧向流免疫层析检测卡51，所述注射器支架6设置有用于垂直静置注射器的若干孔洞61，所述样品杯区7设置有若干样品杯71。
特别地，所述sipte悬液均加入nan3或procline300以防止长菌。
特别地，所述ipte包括：月桂醇聚醚类化合物c12h25(och2ch2)noh，分子式中的n＝3-35、烷基酚聚氧乙烯醚类化合物c8-9h17-19c6h4(och2ch2)noh、环糊精及其衍生物。
特别地，将10-20支所述预装sipte的注射器41、10-20袋所述侧向流免疫层析检测卡51、10-20个所述样品杯71装入所述快速检测试剂盒的盒体1中，完成试剂盒的组装，获得油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒的成品。
特别地，以胶体金为载体微球的制备为：取平均粒径为25nm的纳米金颗粒的溶液，用0.1mol/l的碳酸钾溶液调节ph值为7.5，向溶液中加入一定浓度的单克隆抗体，反应30分钟后，加入含牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠的封闭缓冲液，继续反应3分钟；标记与封闭完成后，纳米金表面形成保护抗体的水化层；经4℃、12000r/min离心30分钟后，去除上清，然后用磷酸盐缓冲液洗涤、重悬后，制得以胶体金为载体的sipte。
特别地，以羧基化的微球为载体微球的制备为：
(1)微球储备液超声15min得到悬浮液，取微球悬浮液至2ml的圆底离心管中，加edc和sulfo-nhs(mes缓冲液，50mm，ph5)，上下吹打，室温下，颠倒混匀反应20min，4℃，12000rpm离心30min，移除液相；
(2)离心后的沉淀加mes缓冲液(50mm，ph5)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；重复一次，共两次洗涤；
(3)向离心后的沉淀加单克隆抗体溶液(pb缓冲液，20mm，ph7.2)，上下吹打混匀；室温下，颠倒混匀反应20min，在4℃，12000rpm离心30min，移除液相；
(4)离心后的沉淀加pb缓冲液(20mm，ph7.2)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；重复一次，共两次洗涤；
(5)离心后沉淀加含牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠的封闭液，微球表面形成保护抗体的水化层。静置30min，4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；
(6)用pb缓冲液(20mm，ph7.2)洗涤两次后，复溶，制得以羧基化微球为载体的sipte。
本发明sipte的工作原理如下所示：
在sipte工作的“油-水-固”三相体系中，油相中的目标化合物先扩散进入水相，然后再从水相扩散到固相表面(即sipte表面)，被抗体捕获。目标化合物的相转移遵守方程1所示的热力学平衡：
其中，如图1所示，co、cw分别代表亲脂性污染物11在油相1和水相2中的浓度，cs代表sipte3上结合的亲脂性污染物11的量。kf代表亲脂性污染物11从油相1向水相2的扩散系数，kf’代表亲脂性污染物11从水相2向油相1的扩散系数，ka代表亲脂性污染物11从水相2向sipte3转移的扩散系数，sipte3上固定的抗体4对亲脂性污染物11的亲和常数对此有决定性影响，因此，ka可以大致代表抗体4对亲脂性污染物11的亲和常数，而kd可以大致代表亲脂性污染物11从抗体4上的解离常数。显然，增加ka和kf有助于亲脂性污染物11从油相1转移到sipte3。由于抗体4对亲脂性污染物11的亲和常数(ka)可达107-109数量级，又由于可以在水相2中加入提高亲脂性污染物11从油相1向水相2转移的ipte(即增加kf)，因此sipte3可以实现对油相1中亲脂性污染物11的高效逆向相转移萃取。
本发明中的水化层厚度和稳定性比前期已授权的专利(一种植物油中污染物快速免疫检测方法和应用，zl201510477644.4)中更厚更稳定，通过加入由牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠组成的封闭溶液以得到亲水性聚合物5并协同获得的加厚和稳定的水化层6是其所不具备的。
实施例1
油脂中玉米赤霉烯酮的现场检测
1)取0.2g月桂醇聚醚-15试剂，加入100ml磷酸盐缓冲液(20mm，ph7.2)，充分溶解制得0.2％的月桂醇聚醚-15溶液，此为玉米赤霉烯酮的ipte溶液。向此溶液中加入proclin300，使防腐剂终浓度为0.03％。
2)取平均粒径为25nm的纳米金颗粒的溶液，用0.1mol/l的碳酸钾溶液调节ph值为7.5，向溶液中加入一定浓度的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，反应30分钟后，加入封闭缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液，ph7.2，含牛血清白蛋白5％、酪蛋白0.3％、聚乙烯吡咯烷酮pvpk120.5％、海藻酸钠0.02％)，继续反应30分钟，制成玉米赤霉烯酮的sipte试剂。12000转离心30分钟，去上清，用上述ipte溶液重悬此sipte试剂，使溶液中sipte的含量约为5μg/ml。
3)用2ml塑料注射器吸取1ml上述sipte溶液，盖上密封帽，备用。
4)利用划膜仪将玉米赤霉烯酮包被抗原(zen-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(0.5mg/ml)均匀涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，37℃烘干4小时，将玻璃纤维膜、nc膜、吸水纸依次贴在pvc底板上，用切条机切成宽度为3.8mm的试纸条。将试纸装载于塑料卡壳中，制成玉米赤霉烯酮检测卡。将一支检测卡和一包干燥剂装入铝箔袋中，密封保存。
5)将预装注射器(10支)、侧向流免疫层析检测卡(10袋)、一次性塑料杯(10个)装入图2和3所述试剂盒中，备用。
6)现场检测时，向一次性塑料杯中倒入少量食用油样品，用预装注射器吸取0.5ml，盖上注射器自带的密封帽后剧烈振荡，竖直放在试剂盒的注射器支架中，静置2min。
7)取出注射器，去掉密封帽，将注射器口对准检测卡的样品孔，轻推注射器推杆，向样品孔中滴加4滴下层水相(100μl)，检测卡静置反应5分钟；
8)最后，用胶体金检测卡读数仪检测卡t线和c线灰度值，带入仪器内置玉米赤霉烯酮定量标准曲线，计算样品中玉米赤霉烯酮含量。该方法对于植物油中玉米赤霉烯酮的最低检出限可达2ppb，相比于我们此前报导的仅利用ipte提取玉米赤霉烯酮的方法(maoetal.analmethods2020；12:5628-5634.)，降低了约20倍。
实施例2：
油水混合体系中毒死蜱抗体的亲水性保护
1)时间分辨荧光微球(ms)储备液超声15min得到悬浮液，取一定量ms悬浮液至2ml的圆底离心管中，加一定量edc和sulfo-nhs(mes缓冲液，50mm，ph5)，上下吹打，室温下，颠倒混匀反应20min，4℃，12000rpm离心30min，移除液相。离心后的沉淀加一定量mes缓冲液(50mm，ph5)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相。重复一次，共两次洗涤。向离心后的沉淀加100μg毒死蜱单克隆抗体溶液(pb缓冲液，20mm，ph7.2),上下吹打混匀。室温下，颠倒混匀反应20min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相。离心后的沉淀加一定量pb缓冲液(20mm，ph7.2)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相。重复一次，共两次洗涤。
2)离心后沉淀平均分为两份，a加入封闭缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液，ph7.2，含牛血清白蛋白5％、酪蛋白0.3％、pvpk120.5％、海藻酸钠0.02％)，静置30min，4℃，12000rpm，离心30min，移除液相。用pb缓冲液(20mm，ph7.2)洗涤两次后，复溶，记为sipte-a。b加入封闭缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液，ph7.2，含牛血清白蛋白5％、酪蛋白0.3％)，静置30min，4℃，12000rpm，离心30min，移除液相。用pb缓冲液(20mm，ph7.2)洗涤两次后，复溶，记为sipte-b。
3)取1gα-环糊精试剂，加入100ml磷酸盐缓冲液(20mm，ph7.2)，充分溶解制得1％的α-环糊精溶液，此为毒死蜱的ipte溶液。向此溶液中加入proclin300，使防腐剂终浓度为0.03％。
4)用上述ipte溶液重悬sipte-a和sipte-b试剂，使两种溶液中sipte的含量均为1μg/ml。
5)用2ml塑料注射器吸取1ml上述sipte溶液，盖上密封帽，备用。
6)利用划膜仪将毒死蜱包被抗原(dsp-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(0.5mg/ml)均匀涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，37℃烘干4小时，将玻璃纤维膜、nc膜、吸水纸依次贴在pvc底板上，用切条机切成宽度为3.8mm的试纸条。将试纸装载于塑料卡壳中，制成毒死蜱检测卡。将一支检测卡和一包干燥剂装入铝箔袋中，密封保存。
7)向一次性塑料杯中倒入少量食用油样品，分别用预装了sipte-a和sipte-b的注射器吸取0.5ml，盖上注射器自带的密封帽后剧烈振荡，竖直放在试剂盒的注射器支架中，静置2min。
7)取出注射器，去掉密封帽，将注射器口对准检测卡的样品孔，轻推注射器推杆，向样品孔中滴加4滴下层水相(100μl)，检测卡静置反应5分钟；
8)最后，用时间分辨荧光读数仪检测卡t线和c线荧光值。sipte-a处理的样品能够观察到清晰的t、c线荧光，而sipte-b处理的样品在t、c线处检测不到荧光。分析原因，发现在检测卡的玻璃纤维素膜与nc膜交界处有大量的荧光颗粒聚集。显示由于抗体没有被有效保护而发生了变性，使微球形成了较大的聚集体。
综上可见，本发明实施例提供的上述技术方案，至少具有如下有益效果：
(1)本发明提出一种油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒，该快速检测试剂盒将进行基于固相逆向相转移萃取技术的食用油中亲脂性污染物快速检测所需的所有耗材集成在了一个试剂盒中，尤其是盒中隔板上还设计了可将多个注射器插入其中，进行竖直静置的搁架，这些设计的有益之处在于充分考虑了现场检测的应用场景，方便使用。
(2)本发明的快速检测试剂盒中的注射器储存区设置有若干预装sipte的注射器，与以前报道的利用ipte对食用油中目标物进行检测的过程相比，本发明的不需要频繁更换移液枪头，只需要采用预装sipte溶液的注射器，提高了集成度，减少了操作步骤，降低了实验人员因频繁更换移液枪头而出错的概率，降低了综合成本。
(3)本发明首次设计了固相逆向相转移萃取剂(sipte)，通过“油-水-固”三相体系，萃取油相中的目标化合物。
(4)本发明sipte使用的胶体金/荧光微球/磁性微球等固相载体同时是侧向流免疫层析试纸的标记物，一方面显著提高了对油相中亲脂性污染物的萃取效率的同时，另一方面，它们可以被试纸上包被的目标化合物包被抗原(t线抗原)和二抗(c线)捕获，产生可以目视观察或被仪器检测的荧光、或磁力信号，用于目标物含量的判读。
(5)本发明采用水化层强化技术。抗体结合在胶体金/荧光微球/磁性微球等固相载体上以后，通过加入由牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠组成的封闭溶液，使得载体微球表面形成了加厚稳定的水化层，采用强化水化层技术保证免疫微球上的抗体在油水剧烈混合过程中不被脂肪破坏。
虽然现有技术中确实存在选用牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮作为本领域研究者常用的封闭剂，但是仅有这些是不足以形成加厚且稳定的水化层，聚乙烯吡咯烷酮pvpk12加少量海藻酸钠的加入协同起到原始水化层加厚并保持稳定的技术效果。而加厚稳定水化层的有益效果在于保护sipte上的抗体在油样与水样的剧烈混合振荡过程中，不会因为接触到油脂而变性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种用于萃取油脂中亲脂性污染物的固相逆向相转移萃取技术，其特征在于，选择预装sipte悬液的注射器和对应的侧向流免疫层析检测卡；将待测试的油样倒入样品杯中，用预装sipte悬液的注射器从样品杯吸入油样并盖上注射器自带的密封帽，充分振荡后，竖直插在试剂盒的注射器支架上静置，取出注射器，去掉密封帽，将注射器口对准侧向流免疫层析检测卡的样品孔，轻推注射器推杆，向样品孔中滴加若干滴下层水相，检测卡静置反应，最后得出检测结果；
其中：所述预装sipte的注射器为预装有针对目标化合物的sipte悬液，所述sipte是以胶体金为载体微球或以羧基化或氨基化的微球为载体微球，微球表面结合了针对目标化合物的特异性抗体，并通过强化的水化层来保护抗体蛋白；所述sipte悬液是将sipte均匀分散在ipte溶液中，在sipte悬液中的微球含量为1-5μg/ml；
所述侧向流免疫层析检测卡的制备：利用划膜仪将一定浓度包被抗原以及羊抗鼠igg均匀涂到层析膜上，经一定干燥工艺处理后生成能够与免疫微球结合的检测线和参考线。将试纸装载于塑料卡壳中，制成检测卡。将一支检测卡和一包干燥剂装入铝箔袋中，密封保存。
2.根据权利要求1所述的固相逆向相转移萃取技术，其特征在于，所述快速检测试剂盒包括盒体，盒体内通过隔板设置有注射器储存区、免疫层析检测卡储存区、注射器支架和样品杯区，所述盒体包括盒底、盒侧面和盒盖，所述盒侧面包括两个长侧面和两个短侧面，所述盒盖和一个所述长侧面转动连接，所述注射器储存区紧靠另一个所述长侧面设置，所述注射器储存区相邻设置免疫层析检测卡储存区和注射器支架，所述注射器支架相邻设置样品杯区和免疫层析检测卡储存区；
所述的注射器储存区设置有若干预装sipte的注射器，所述免疫层析检测卡储存区设置有若干侧向流免疫层析检测卡，所述注射器支架设置有用于垂直静置注射器的若干孔洞，所述样品杯区设置有若干样品杯。
3.根据权利要求1所述的固相逆向相转移萃取技术，其特征在于，sipte表面的强化的水化层由牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠生成。
4.根据权利要求1所述的固相逆向相转移萃取技术，其特征在于，所述sipte悬液加入nan3或procline300以防止长菌。
5.根据权利要求1所述的固相逆向相转移萃取技术，其特征在于，所述ipte包括：月桂醇聚醚类化合物c12h25(och2ch2)noh，分子式中的n＝3-35、烷基酚聚氧乙烯醚类化合物c8-9h17-19c6h4(och2ch2)noh、环糊精及其衍生物。
6.根据权利要求2所述的固相逆向相转移萃取技术，其特征在于，将所述预装sipte的注射器10-20支、所述侧向流免疫层析检测卡10-20袋、所述样品杯10-20个装入所述快速检测试剂盒中，完成试剂盒的组装，获得油脂中亲脂性污染物的快速检测试剂盒的成品。
7.根据权利要求1所述的固相逆向相转移萃取技术，其特征在于，以胶体金为载体微球的制备为：取平均粒径为25nm的纳米金颗粒的溶液，用0.1mol/l的碳酸钾溶液调节ph值为7.5，向溶液中加入一定浓度的单克隆抗体，反应30分钟后，加入含牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠的封闭缓冲液，继续反应30分钟；标记与封闭完成后，纳米金表面形成保护抗体的水化层；经4℃、12000r/min离心30分钟后，去除上清，然后用磷酸盐缓冲液洗涤、重悬后，制得以胶体金为载体的sipte。
8.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于，以羧基化的微球为载体微球的制备为：
(1)微球储备液超声15min得到悬浮液，取微球悬浮液至2ml的圆底离心管中，加edc和sulfo-nhs(mes缓冲液，50mm，ph5)，上下吹打，室温下，颠倒混匀反应20min，4℃，12000rpm离心30min，移除液相；
(2)离心后的沉淀加mes缓冲液(50mm，ph5)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；重复一次，共两次洗涤；
(3)向离心后的沉淀加单克隆抗体溶液(pb缓冲液，20mm，ph7.2)，上下吹打混匀；室温下，颠倒混匀反应20min，在4℃，12000rpm离心30min，移除液相；
(4)离心后的沉淀加pb缓冲液(20mm，ph7.2)，上下吹打，超声3min，在4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；重复一次，共两次洗涤；
(5)离心后沉淀加含牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠的封闭液，静置30min，4℃，12000rpm，离心30min，移除液相；
(6)用pb缓冲液(20mm，ph7.2)洗涤两次后，复溶，制得以羧基化微球为载体的sipte。
技术总结