本发明属于医药领域，特别涉及一种长春碱类衍生物在制备治疗骨肉瘤和/或软组织肉瘤药物中的应用。
背景技术
骨肉瘤和软组织肉瘤是起源于间叶组织的恶性肿瘤，其转移和复发率极高。手术和化学疗法是骨肉瘤和软组织肉瘤的主要治疗手段。顺铂、环磷酰胺、阿霉素和甲氨蝶呤是骨肉瘤化疗的一线药物，而阿霉素和异环磷酰胺构成了软组织肉瘤化疗的两大基石。化疗可使骨肉瘤患者5年内生存率提高到60～70％，而软组织肉瘤患者化疗生存率仍低于10％。骨肉瘤和软组织肉瘤主要通过血行转移方式转移至肺，发生肺转移的患者5年内生存率低于20％。大剂量的化疗药物可使患者产生恶心呕吐、骨髓抑制和心脏毒性等不良反应，导致患者依从性差和生活质量不高。因此，发展低毒和高效的靶向治疗药物在骨肉瘤和软组织肉瘤治疗中具有重要的意义。
酶激活式前药可提高母药对酶表达细胞的靶向性，降低母药对机体的毒副作用。其具体原理为：利用多肽封闭母药的活性基团形成失活形式的前药，该前药是某种特定酶的水解底物，当前药遇到细胞高表达的特定酶时被水解释放出具有活性的母药，从而杀伤表达该酶的细胞。成纤维细胞激活蛋白α(fibroblast activation proteinα,FAPα)是一种Ⅱ型丝氨酸蛋白酶，属于二肽基肽酶家族成员之一，具有二肽酶水解活性，且独特地具有限制性内切酶活性，可特异性水解与N-terminal benzyloxy carbonyl(Z)-blocked Gly-Pro(Z-GP)耦联的底物。研究发现，FAPα在正常骨和软组织中不表达或低表达，但在骨和软组织肿瘤细胞上持续高表达FAPα(Dohi O et al.Histopathology.2009,55(4):432-40)；骨肉瘤患者肿瘤细胞高表达FAPα，并与其预后和转移呈正相关(Yuan et al.J Surg Oncol.2013,108(3):157-62；Zhang et al.Clin Exp Med.2020,20(1):121-30)。上述研究表明，FAPα可作为骨肉瘤和软组织肉瘤治疗的有效靶标，而FAPα酶激活式前药有望成为骨肉瘤和软组织肉瘤治疗药物的良好设计策略。
长春碱类化合物是指从夹竹桃科植物长春花中分离得到的一类已知的双吲哚类生物碱及其衍生物，包括长春碱、长春瑞滨、长春氟宁、长春新碱、长春质碱或文多灵等。申请人暨南大学申请和公开的中国发明专利申请(CN201310138241.8)，公开了一类长春碱类化合物经肼解及加二肽衍生化后的长春碱类衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该专利申请的全部内容将被引入本申请中，作为参考。
药理研究表明，长春碱及其类似物或者衍生物属于细胞毒性药物，主要抑制微管蛋白的聚合，从而妨碍纺锤体微管的形成，使细胞核分裂被阻滞于中期(Martino E,et al.Bioorg Med Chem Lett.2018,28(17):2816-26)。从20世纪70年代开始，临床上将长春碱及其衍生物单独或与骨肉瘤一线治疗药物合用，但并未取得令人满意的治疗效果(Claudia MH et al.Pharmacogenomics.2016,17(18):2097-114；Véronique MC et al.Eur J Cancer.2012,48(15):2409-16)。此外，长春碱及其衍生物具有骨髓抑制等不良反应，限制了其长期和大剂量应用。综上所述，对于骨肉瘤和软组织肉瘤，临床亟需有效的治疗药物。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供长春碱类衍生物在制备治疗骨肉瘤和/或软组织肉瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
长春碱类衍生物在制备治疗骨肉瘤和/或软组织肉瘤药物中的应用，所述的长春碱类衍生物包括长春碱类二肽及其生理上可接受的盐。
所述的应用优选为在制备抑制骨肉瘤细胞和/或软组织肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移、原位生长或肺转移药物中的应用。
所述的长春碱类二肽为肼解长春碱类化合物与N-苄氧羰基二肽缩合得到的化合物(即长春碱类二肽为长春碱类化合物与水合肼反应形成的肼解长春碱类化合物，再与N-苄氧羰基二肽缩合所得的化合物)；优选为长春碱加二肽(BX-CCJ)、长春瑞滨加二肽(BX-CCRB)、长春氟宁加二肽(BX-CCFN)和长春新碱加二肽(BX-CCXJ)中的一种或以上，其结构式如式II～V所示：
其中，Z-GP表示苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基。
所述的长春碱类衍生物的合成路线如下：
所述的肼解长春碱类化合物为长春碱类化合物与水合肼反应得到的化合物优选为肼解长春碱(JJ-CCJ)、肼解长春瑞滨(JJ-CCRB)、肼解长春氟宁(JJ-CCFN)或肼解长春新碱(JJ-CCXJ)。
所述的长春碱类化合物优选为长春碱(CCJ)、长春瑞滨(CCRB)、长春氟宁(CCFN)或长春新碱(CCXJ)。
所述的N-苄氧羰基二肽优选为N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH)；所述的N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸的结构式如式I所示：
所述的骨肉瘤细胞包括但不限于如下骨肉瘤细胞系的细胞：骨肉瘤细胞系SJSA-1、骨肉瘤细胞系143B、骨肉瘤细胞系MNNG/HOS、骨肉瘤细胞系U2OS、骨肉瘤细胞系Saos-2、骨肉瘤细胞系HOS、骨肉瘤细胞系MG-63；
所述的软组织肉瘤细胞包括但不限于如下软组织肉瘤细胞系的细胞：软组织肉瘤细胞系A673、软组织肉瘤细胞系RD-ES、软组织肉瘤细胞系TC-32、软组织肉瘤细胞系SW982、软组织肉瘤细胞系SW684、软组织肉瘤细胞系SK-PN-DW、软组织肉瘤细胞系HT-1080。
所述的生理上可接受的盐包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明针对骨肉瘤和/或软组织肉瘤肿瘤细胞高表达FAPα的特点设计的长春碱类化合物经肼解及加二肽衍生化形成FAPα酶激活式前药，在体内外均有良好的抗肿瘤生长和肺转移的活性，其降低了长春碱及其衍生物的毒副作用并增强其治疗效果。
本发明长春碱类二肽及其生理上可接受的盐，在体外可显著抑制骨肉瘤和/或软组织肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，在体内显著抑制骨肉瘤和/或软组织肉瘤细胞原位生长和肺转移，其效果优于长春瑞滨，可应用于骨肿瘤和软组织肉瘤患者的治疗。
附图说明
图1是长春碱类衍生物BX-CCJ和长春瑞滨对SJSA-1,143B,A-673和HT-1080细胞迁移能力的抑制作用图(*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001vs空白对照组)。
图2是长春碱类衍生物BX-CCJ和长春瑞滨对SJSA-1,143B,A-673和HT-1080细胞侵袭能力的抑制作用图(*P<0.05和***P<0.001vs空白对照组)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中涉及的长春碱类化合物依次为长春碱(CCJ)、长春瑞滨(CCRB)、长春氟宁(CCFN)和长春新碱(CCXJ)，它们经肼解后所得的肼解长春碱类化合物；肼解长春碱类化合物为：肼解长春碱(JJ-CCJ)、肼解长春瑞滨(JJ-CCRB)、肼解长春氟宁(JJ-CCFN)和肼解长春新碱(JJ-CCXJ)；
本发明实施例中涉及的长春碱类二肽为为长春碱类化合物与水合肼反应形成的肼解长春碱类化合物，再与N-苄氧羰基二肽(N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH))缩合所得的化合物；长春碱类二肽为长春碱二肽(BX-CCJ)、长春瑞滨二肽(BX-CCRB)、长春氟宁二肽(BX-CCFN)及长春新碱二肽(BX-CCXJ)；
所述化合物的结构及命名如下所示：
实施例1长春碱类衍生物BX-CCJ对人骨肉瘤细胞和软组织肉瘤细胞增殖能力的抑制作用
实验方法：将处于对数生长期的细胞消化接种至96孔板，接种密度为5×103细胞/孔，培养箱培养过夜后，移去旧的培养基，每孔加入含不同药物浓度的灭活血清的培养液，另外加入同等体积的PBS作为阴性对照孔，而同等体积的不含药物的完全培养液作为阳性对照孔。细胞培养72h后，弃除去旧的细胞培养基，每孔加入30μL的MTT，37℃孵育4h后，移除回收MTT溶液，每孔再加入100μL的DMSO，摇床晃动将反应生成产物甲瓒溶解完全后，用荧光多功能酶标仪(波长590nm)，检测每个孔的OD值。计算细胞存活率的公式如下：细胞存活率％＝(给药处理组平均OD值-空白孔平均OD值)/(对照组平均OD值-空白孔平均OD值)×100％。结果如表1所示。
从表中所示实验结果可以看出：长春碱类衍生物BX-CCJ可抑制骨肉瘤细胞和软组织肉瘤细胞的增殖能力，而且其抗增殖能力优于长春瑞滨。
表1细胞存活率统计结果
实施例2长春碱类衍生物BX-CCJ对人骨肉瘤细胞和软组织肉瘤细胞细胞迁移能力的抑制作用
实验方法：将正处于对数生长期的细胞，消化离心，用无血清培养基重悬细胞，按1×104细胞/孔接种到孔径8.0μm的Transwell嵌套的上室，接种细胞混悬液体积100μL，下室添加500μL含10％FBS和特定浓度(0nmol/L、2nmol/L、4nmol/L)的BX-CCJ或长春瑞滨的培养基，每组设置3个复孔。培养箱37℃孵育48h后，移去位于上室和下室的全部培养基，用4％多聚甲醛室温固定细胞50min，清洗2次，向下室中加入500μL的0.1％结晶紫溶液，染色3min。PBS清洗小室，并用棉签轻轻擦去在嵌套上室未迁移至下室的细胞。待Transwell嵌套小室自然晾干后，使用倒置显微镜观察已向嵌套室下层迁移的细胞并拍照，每个嵌套随机挑选5个视野进行拍照，使用IPP软件统计迁移的细胞数量。细胞侵袭实验同迁移实验操作相同，只是在Transwell嵌套上室提前铺好20μL基质胶，并在37℃凝固30min，基质胶浓度为2.5mg/mL。结果如图1所示。
从图中所示实验结果可以看出：与空白对照组相比，长春碱类衍生物BX-CCJ能显著抑制SJSA-1,143B,A-673和HT-1080细胞的迁移能力，而且其效果优于长春瑞滨。
实施例3长春碱类衍生物BX-CCJ对人骨肉瘤细胞和软组织肉瘤细胞细胞侵袭能力的抑制作用
实验方法：将正处于对数生长期的细胞，消化离心，用无血清培养基重悬细胞，按1×104细胞/孔接种到孔径8.0μm的铺有20μL 2.5mg/mL Matrigel基质胶(BD公司)的Transwell嵌套的上室，接种细胞混悬液体积100μL，下室添加500μL含10％FBS和特定浓度(0nmol/L、2nmol/L、4nmol/L)的BX-CCJ或长春瑞滨的培养基，每组设置3个复孔。培养箱37℃孵育48h后，移去位于上室和下室的全部培养基，用4％多聚甲醛室温固定细胞50min，清洗2次，向下室中加入500μL的0.1％结晶紫溶液，染色3min。PBS清洗小室，并用棉签轻轻擦去在嵌套上室未迁移至下室的细胞。待Transwell嵌套小室自然晾干后，使用倒置显微镜观察已向嵌套室下层迁移的细胞并拍照，每个嵌套随机挑选5个视野进行拍照，使用IPP软件统计迁移的细胞数量。结果如图2所示。
从图中所示实验结果可以看出：与空白对照组相比，长春碱类衍生物BX-CCJ能显著抑制SJSA-1,143B,A-673和HT-1080细胞的侵袭能力，而且其效果优于长春瑞滨。
实施例4长春碱类衍生物BX-CCJ对裸鼠原位移植人骨肉瘤细胞和软组织肉瘤细胞的生长和肺转移的抑制作用
实验方法：消化并收集处于对数生长期的SJSA-1和143B细胞，PBS清洗3次，离心，细胞沉淀与预冷的PBS混合并吹打均匀，调整细胞密度为4×107个/mL。按0.05mL/只的体积，用胰岛注射器将细胞悬液注射到4-6周龄雄性BALB/C nude裸鼠的胫骨近端。
取对数期生长的A-673和HT-1080细胞，PBS清洗3次，调整细胞浓度为4×107细胞/mL，每只BALB/c Nu/Nu小鼠的股四头肌接种0.1mL。待肿瘤体积逐渐增加至80～100mm3左右，将荷瘤鼠随机分为溶剂对照组、BX-CCJ和长春瑞滨给药组，每组6只。给药方式：尾静脉注射BX-CCJ或长春瑞滨1mg/kg，两天一次。记录裸鼠的体重，并测量瘤径。骨肉瘤的体积计算公式均表示为：V＝4/3π[1/4(a b)]2，其中a、b分别为垂直于胫骨的肿瘤的长径和短径。软组织肉瘤的体积计算公式为：V＝1/2(a*b2)，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。结果如表2所示。给药治疗20天后，处死小鼠，解剖取肿瘤及肺组织。肿瘤组织称重，拍照。肿瘤和肺组织用4％多聚甲醛固定、包埋进行切片，H&E染色后进行组织学分析。结果如表3所示。
从表中所示实验结果可以看出：长春碱类衍生物BX-CCJ能显著抑制143B,SJSA-1,A-673和HT-1080移植瘤的生长能力，抑瘤率分别为93.10％,88.92％,91.20％和90.55％，高于长春瑞滨的抑瘤率(59.31％,65.46％,54.67％和56.73％)，且对裸鼠的体重无明显影响。BX-CCJ能显著减少143B和HT-1080细胞肺转移灶的数量和面积，其效果优于长春瑞滨。
表2瘤重和抑瘤率统计结果
表3肺转移灶的数量和面积统计结果
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001VS生理盐水组；#P<0.05,##P<0.01VS长春瑞滨组
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
