一种基于PISA的抗菌高分子纳米颗粒的制备方法和应用与流程

一种基于pisa的抗菌高分子纳米颗粒的制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于抗菌高分子材料技术领域，具体涉及一种基于pisa的抗菌高分子纳米颗粒的制备方法和应用。


背景技术：

2.致病菌是公共卫生的一大威胁，细菌附着在材料表面会形成生物膜不易清除，而抗生素的滥用会导致单细胞病原菌耐药性增强。传统的有机高分子杀菌材料由于其高效的杀菌性质和较低的生物毒性被广泛应用，但单一杀菌剂由于其杀菌机制不断消耗的杀菌粒子和细菌生物膜残留，导致长时间作用会损坏表面，且具有较差的稳定性和持久性，而单一的抗粘附表面往往抗菌性能不如接触杀菌材料。金属纳米粒子、抗菌肽等高生物活性抗菌剂则通常伴随着高度繁琐的合成步骤、过高的成本和难以预知的风险。因此开发新的抗菌物质和策略变得日益重要，如何基于传统抗菌剂，通过分子设计和结构参数调整提高其抗菌效率和时长吸引了越来越多的关注。
3.季铵盐类抗菌高分子材料是有机抗菌剂中较为常见的一类，其制备工艺相对简便，生物相容性较好，抗菌效果高等优点而受到广泛关注。但如何更加简便有效的制备不同形态不同湿润性的的季铵盐高分子，进一步对其功能化和修饰提高抗菌效果持久性仍然面临难题。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种基于pisa的抗菌高分子纳米颗粒的制备方法和应用，通过采用可逆加成断裂链转移
‑
聚合诱导自组装(raft
‑
pisa)技术，在无皂乳液聚合体系中一步法、高固含量制备基于季胺化聚(n,n
‑
二甲氨基)甲基丙烯酸酯乙酯(pdmaemasalt)的嵌段高分子纳米颗粒pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)，其高比表面积可作为季胺链段的有效载体，通过静电相互作用吸附带负电的细菌体，瓦解细胞壁从而抑制细菌生长。同时疏水链段p(st
‑
co
‑
tfema)的引入，维持抗菌性能的同时能减少细胞毒性。即本发明提供了一种操作简单、成本低廉、具有抗粘附和杀菌双功能的高分子材料的制备方法。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
6.本发明提供了一种基于pisa的抗菌高分子纳米颗粒的制备方法，所述方法包括：
7.步骤1、以甲基丙烯酸二甲胺基乙酯为单体，在链转移剂2
‑
氰基
‑2‑
丙基苯并二硫和偶氮引发剂的作用下发生反应，然后加入1
‑
溴丁烷继续反应，制得大分子raft链转移剂pdmaemasalt
‑
cta；
8.步骤2、将苯乙烯和甲基丙烯酸三氟乙酯混合，加至已溶于水的大分子raft链转移剂pdmaemasalt
‑
cta中，混合均匀并加入偶氮引发剂，封口除氧后，于50～70℃油浴中反应，冷却得白色浑浊乳液，即为所述高分子纳米颗粒pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)。
9.进一步地，步骤1中，将所述单体甲基丙烯酸二甲胺基乙酯、链转移剂2
‑
氰基
‑2‑
丙
基苯并二硫和偶氮引发剂溶解，混合均匀并封口除氧后，于50～70℃油浴中反应，反应物提纯后烘干得到橘粉色粘稠固体，将所述橘粉色粘稠固体溶于二甲基甲酰胺中，50～70℃下逐滴加入1
‑
溴丁烷开始反应，反应结束后除杂干燥，得到所述大分子raft链转移剂pdmaemasalt
‑
cta。
10.进一步地，所述反应物提纯的方法为：用丙酮溶解并用正己烷沉淀，重复三次进行提纯。
11.进一步地，所述橘粉色粘稠固体与1
‑
溴丁烷反应结束后，采用过量的乙酸乙酯沉淀目标产物进行除杂。
12.进一步地，步骤1中，所述单体甲基丙烯酸二甲胺基乙酯和所述链转移剂2
‑
氰基
‑2‑
丙基苯并二硫的摩尔比为30～100：1。
13.进一步地，所述大分子raft链转移剂pdmaemasalt
‑
cta的链段长度为20～100。
14.进一步地，步骤2中，所述甲基丙烯酸三氟乙酯和苯乙烯的摩尔比为1：0.5～10。
15.进一步地，步骤1或步骤2中所述偶氮引发剂选自aibn、aiba、aibi或acva中的任意一种或多种。
16.本发明还提供了一种嵌段共聚物高分子纳米颗粒，所述嵌段共聚物高分子纳米颗粒采用上述制备方法制成。
17.本发明还提供了所述嵌段共聚物高分子纳米颗粒在制备具有抗粘附和杀菌双功能的高分子材料中的应用。
18.进一步地，所述嵌段共聚物高分子纳米颗粒的浓度为20～80mg/ml。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.(1)本发明选用了raft
‑
pisa无皂乳液聚合，可以一步法借助亲水性链转移剂引入具有杀菌性能的亲水性季胺基链段pdmaemasalt，疏水链段聚合的同时完成自组装形成阳离子型的纳米颗粒，制备过程简单快速，一次可制备固含量高达30wt％且相对稳定的嵌段共聚物自组装结构。
21.(2)本发明制备得到的嵌段共聚物高分子纳米颗粒具有高比表面积，可作为季胺链段的有效载体，通过静电相互作用吸附带负电的细菌体，瓦解细菌细胞壁从而有效抑制细菌生长，并且通过调节pdmaemasalt的链段长度以及疏水链段中st和tfema的比例，可以实现材料表面湿润性和抗菌性能的调控。
22.(3)本发明制备的嵌段共聚物高分子纳米颗粒具有抗粘附/杀菌双功能，克服了单一抗菌剂可能带来的相容性，持久性与稳定性等问题，而且结合了具有特异性基团的杀菌性能和低表面能单体的抗粘附性能，通过该方法可以将主动攻击(杀灭细菌)和被动防御(抵抗或排斥细菌附着)两种抗生物膜策略结合到一起。
附图说明
23.图1为本发明实施例1中嵌段聚合物pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的合成方案示意图；
24.图2为本发明实施例1中嵌段聚合物的元素结构分析图，其中图2
‑
a为1hnmr谱图，图2
‑
b为
19
f nmr谱图，图2
‑
c为gpc谱图，图2
‑
d为dsc谱图；
25.图3为本发明实施例1中嵌段聚合物的fe
‑
sem图和tem图；
26.图4为本发明实施例1中不同嵌段聚合物的亲水接触角和表面能测定结果；
27.图5为本发明实施例1中不同浓度pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)聚合物的抑菌圈图片；
28.图6为本发明实施例1中不同聚合物的抗菌性能测定结果；
29.图7为本发明实施例1中聚合物在玻璃板上成膜后的抑菌效果以及相容性检测结果。
具体实施方式
30.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1
32.1、嵌段共聚物pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的制备
33.所述pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的合成方案为：
[0034][0035]
合成方案示意图如图1所示，制备方法具体为：
[0036]
(1)大分子raft链转移剂pdmaema
‑
cta的制备
[0037]
向25ml干燥的圆底烧瓶中依次加入一定量的单体甲基丙烯酸二甲胺基乙酯(dmaema)、链转移剂2
‑
氰基
‑2‑
丙基苯并二硫(cpdb)，引发剂偶氮二异丁腈(aibn)和溶剂1,4
‑
二氧六环，充分搅拌混合均匀后封口。冰水浴中放置，通入高纯氮气除氧40min，将反应体系整体转移至65℃油浴锅中反应，达到预期效果后启口暴露在空气中终止反应。
[0038]
反应物通过丙酮溶解/正己烷沉淀操作三次进行提纯，40℃真空干燥至恒重，得到橘粉色粘稠的固体。
[0039]
(2)大分子raft链转移剂pdmaemasalt
‑
cta的制备
[0040]
将该固体溶于20ml二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌使其充分溶解，60℃下逐滴滴加过量的1
‑
溴丁烷开始反应。反应24h后启口，采用过量的乙酸乙酯沉淀所得粉末真空干燥24h，即为季铵化的大分子raft链转移剂pdmaemasalt
‑
cta。
[0041]
通过调节dmaema和cpdb的摩尔比，以制备得到不同链段长度的pdmaemasalt
‑
cta，其中当dmaema和cpdb的投料摩尔比为30：1时，得到链段长度为25的pdmaemasalt
25
‑
cta；当dmaema和cpdb的投料摩尔比为70：1时，得到链段长度为65的pdmaemasalt
65
‑
cta；当dmaema和cpdb的投料摩尔比为80：1时，得到链段长度为73的pdmaemasalt
73
‑
cta；当dmaema和cpdb的摩尔比为100：1时，得到链段长度为91的pdmaemasalt
91
‑
cta。
[0042]
(3)嵌段共聚物pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的制备
中f的特征峰证实了含氟三元嵌段聚合物的合成。
[0051]
图2
‑
c为季铵盐均聚物pdmaemasalt
65
‑
cta，嵌段聚合物pdmaemasalt
65
‑
b
‑
pst
600
与pdmaemasalt
65
‑
b
‑
p(st
600
‑
co
‑
tfema
60
)的gpc谱图曲线，pdmae masalt
‑
cta的数均分子量mn为52534，二元聚合物和三元聚合物的mn分别为219815、336002，远大于其他方法计算出来的统计分子量，其原因是因为用dmf作流动相时，未添加溴化锂调节体系极性，且聚合物与dmf的极性相差过大，导致聚合物分子链无法舒展开，从而形成了与实际分子量5
‑
10倍的差异。分子量分布指数分别为1.72和1.5，分布指数较大是因为含有少量未反应完全的均聚物。
[0052]
图2(d)为pdmaemasalt
65
、pdmaemasalt
65
‑
b
‑
pst
600
和pdmaemasalt
65
‑
b
‑
p(st
600
‑
co
‑
tfema
60
)的差式扫描热量曲线，图中
‑
23.2℃对应于pdmaemas alt的玻璃化转变温度tg，pst链段的tg在101.4℃，第三组分tfema的引入后pst
‑
co
‑
ptfema的tg在98.4℃，均与理论值相符。
[0053]
通过1h nmr、
19
f nmr、gpc和dsc证明了嵌段聚合物的成功制备。
[0054]
3、透射电镜分析
[0055]
对上述制得的产物进行透射电镜观察分析，其中嵌段聚合物pdmaemasal t
73
‑
b
‑
p(st
200
‑
co
‑
tfema
100
)纳米结构的fe
‑
sem图如图3
‑
a和3
‑
b所示，tem图如图3
‑
c和3
‑
d所示。
[0056]
结果显示，所述pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)嵌段聚合物纳米结构，形貌相似，皆为球状纳米粒子，大小规整，粒径在50nm左右；为核壳双层结构，亲水的pdmaemasalt链段为外层，疏水的p(st
‑
co
‑
tfema)链段位于内层。
[0057]
4、材料表面润湿性
[0058]
测定不同疏水嵌段长度的嵌段共聚物的水接触角(wca)和表面能大小，结果如图4所示。
[0059]
其中图4
‑
a为不同疏水嵌段长度的嵌段共聚物pdmaemasalt
65
‑
b
‑
pst
200
(d65
‑
s200)、pdmaemasalt
65
‑
b
‑
pst
500
(d65
‑
s500)、pdmaemasalt
65
‑
b
‑
pst
800
(d65
‑
s800)的测定结果，结果显示，d65
‑
s200、d65
‑
s500和d65
‑
s800的亲水性接触角(wca)分别为35
°
、42.08
°
和92.6
°
，逐渐增大；对dmso的亲油性接触角分别为23.5
°
、37.0
°
和34.8
°
，随着疏水链段的增长，其疏水性也随之增大，当θ＜90
°
时，表明具有一定的湿润性能，其中d65
‑
s200和d65
‑
s500表现出了良好的湿润性能。结合owens
‑
wendt
‑
rabel
‑
kaelble(owrk)和杨氏方程计算不同薄膜的总表面自由能，计算得到的表面能如图所示，随着pdmaem asalt
65
‑
b
‑
pst
x
疏水链段长度的增加(x＝200，500，800)，其表面能减小，γ
s
分别为60.8，55.43，53.42。
[0060]
图4
‑
b为不同疏水链段组成的嵌段聚合物薄膜pdmaemasalt
25
‑
b
‑
pst
200
(d25
‑
s200)、pdmaemasalt
25
‑
b
‑
p(st
150
‑
co
‑
tfema
50
)(d25
‑
s150/t50)、pdmaemasalt
65
‑
b
‑
pst
500
(d65
‑
s500)、pdmaemasalt
65
‑
b
‑
p(st
500
‑
co
‑
tfema
100
)(d65
‑
s500/t100)的测定结果。其中d25
‑
s200的亲水性接触角为79.16
°
，d25
‑
s150/t50的接触角为95.68
°
，表明随着含氟单体tfema的引入，疏水性有所增强且表面能更低(由44.14mn/m降至37.87m/nm)，使基材由湿润性向疏水性转变。对比嵌段共聚物d65
‑
s500与d65
‑
s500/t100之间亲疏水性与表面能的差异，也显示了同样的规律。
[0061]
通过接触角的测试证明通过调节疏水链段中的化学组成，可以实现材料表面湿润性的调控，且验证了含氟聚合物的低表面能。
[0062]
5、抗菌性能测试
[0063]
通过抑菌圈的大小来对比不同聚合物的抗菌性能。方法：(a)配置培养基：首先按照培养基的配置方法配置lb固体培养基，并于121℃下灭菌15min，待培养基稍冷却后倒入无菌培养皿中，静置至凝固成平板。(b)标记：在培养皿底部做好标记。(c)活化菌株：用接种环分别取适量的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌接种于灭菌后的nb液体培养基，于37℃，220rmp下培养12h。(d)涂板：将培养后的菌种用无菌水稀释1000倍，移取500ul涂布于标记好的平板中。(e)取样：用镊子将200ul牛津杯置于涂布好的平板中，用移液器移取200ul不同的聚合物于牛津杯中，并置于37℃恒温培养箱中24h。用游标卡尺测量抑菌圈的大小。
[0064]
稀释pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)共聚物纳米颗粒乳液至浓度为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml、160mg/ml的，取200ul稀释乳液至育有细菌的培养基的牛津杯中，37℃恒温培养箱中24h，不同浓度的同一pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)聚合物的抑菌圈图片如图5所示，抑菌圈直径统计结果如图6
‑
a所示，结果显示，所述pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)共聚物可抑制金黄色葡萄球菌与大肠杆菌，最佳抑菌浓度为40mg/ml。
[0065]
取同浓度同体积的pdmaemasalt
‑
b
‑
pst，pdmaema
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)和pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)三类聚合物，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球的抑菌效果，测定的抑菌圈直径如图6
‑
b所示。结果显示，pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的抑菌圈明显大于pdmaema
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的抑菌圈，即抑菌性能要更强，说明季铵盐是发挥良好抗菌性能的关键。对比pdmaemasal t
‑
b
‑
pst和pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的抑菌圈大小，发现后者对e.coli的抑菌圈由3.34mm增至4.50mm，对s.aureus的抑菌圈由0.72mm增至1.61mm，表明tfema的加入，使聚合物抗细菌粘附的功能增强。
[0066]
取st：tfema＝2:1，但疏水嵌段长度不同的聚合物，测定其抑菌效果，结果如图6
‑
c所示。结果显示，随着疏水链段长度的增长，季铵盐的含量降低，依次为42.9％、27.3％、18.8％和12.5％，而季铵盐含量的降低使得抗菌性能表现出逐渐减弱的趋势。当季铵盐含量为42.9％和27.3％，抑菌圈半径大于1mm，即当季铵盐含量大于27.3％时，表现出了优异的抗菌性能。
[0067]
由于含氟聚合物具有耐高温，自清洁性，和低表面能的特性，制备不同氟含量的pdmaemasalt
91
‑
b
‑
p(st
x
‑
co
‑
tfema
y
)嵌段聚合物，探究在不影响季铵盐浓度的前提下，st和tfema的链段比例变化，即聚合物纳米粒子表面疏水性变化对抗菌性能的影响，结果如图6
‑
d所示。结果显示，涂布点周围均出现了大小不等的透明抑菌圈，随着含氟单体投料量的增大，其抑菌圈半径随之增大。含氟单体的加入，增加了嵌段共聚物疏水链段的非极性程度，更易在薄膜表面/空气界面富集，防止细菌粘附，其中d91
‑
s300/t100和d91
‑
s200/t300表现出了优异的抗菌性能。一旦细菌发生粘附，会刺激pdmaemasalt
‑
cta片段迁移，破坏细菌细胞膜，杀死细菌。
[0068]
综上所述，抑菌性能测试证明了季铵盐和含氟单体共同作用下的聚合物具有良好的抗菌性能。
[0069]
将均聚物，嵌段聚合物在3cm
×
3cm玻片表面浇铸成膜，使用s.aureus测试其抑菌圈大小，如图7
‑
(a)至7
‑
(c)所示，其中图7
‑
(a)为玻璃板为基材的对照试验。7
‑
(b)和7
‑
(c)分别为在玻璃板上成膜后的的pdmaemasalt
65
‑
cta和pdmaemasalt
65
‑
b
‑
p(st
500
‑
co
‑
tfema
100
)涂层。结果显示，对比对照组玻璃片，涂覆有聚合物的玻璃片表面并无细菌生长，并且涂覆有聚合物pdmaemasalt
‑
cta、pdmaemasalt
‑
b
‑
pst和pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)的玻璃片周围分别呈现出1mm，2mm和0.3mm大小的抑菌圈，其四周展现出来的抗菌性来源于释放出来的季铵盐。
[0070]
进一步测定不同物质的相容性，将
p
dmaemasalt
‑
cta和pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)分别放置于血平板上，24h观察平板变化，结果如图7
‑
(d)至7
‑
(g)所示，结果显示，pdmaemasalt
‑
cta具有较弱的溶血性，pdmaemasalt
‑
b
‑
p(st
‑
co
‑
tfema)无明显溶血现象，说明本发明制备得到的高分子抗菌剂克服了单一季铵盐抗菌剂带来的相容性问题。
[0071]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。